孫夢(mèng)桐 呂欣然 崔天琦 林 洋 白鳳翎 勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013）

哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）是一種棲息在海洋生態(tài)環(huán)境中的革蘭氏陰性菌， 是海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主要致病菌之一，引起魚類、貝類及甲殼類等海洋動(dòng)物疾病[1]。 目前，預(yù)防和控制哈維氏弧菌疾病一般采用抗菌類藥物， 而長期反復(fù)使用抗菌藥物可導(dǎo)致哈維氏弧菌產(chǎn)生耐藥性， 形成藥物濃度與細(xì)菌抗性的惡性循環(huán)，加劇水體環(huán)境污染，并帶來巨大的食品安全隱患[2-3]。

哈維氏弧菌的致病作用與群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）密切相關(guān)，它能夠產(chǎn)生酰基高絲氨酸內(nèi)酯 （Acyl-homoserine lactones，AHLs）、呋 喃糖基硼酸二酯 （Furanosyl borate diester）AI-2 和（S）-3-羥基十三烷-4-酮【（S）-3-hydroxytridecan-4-one】3 類信號(hào)分子[4-5]。 其中，AHLs 類信號(hào)分子是介導(dǎo)群體感應(yīng)的主體成分， 當(dāng)AHLs 達(dá)到一定濃度時(shí)可改變基因表達(dá)來協(xié)調(diào)群體行為[6]。 AHLs類群體感應(yīng)系統(tǒng)主要由AHLs、AHLs 合酶（LuxI蛋白）和AHLs 受體（LuxR 族蛋白）3 類成分組成。LuxR 與AHLs 結(jié)合后，激活生物膜和毒力因子等基因表達(dá)[7-9]。 Rajamanikandan 等[10]利用分子對(duì)接技術(shù)確定了AHLs 分子在LuxR 上的結(jié)合位點(diǎn)，明確AHLs 類信號(hào)分子是引起致病作用的主要原因。 找到相對(duì)應(yīng)的群體感應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitor，QSI）是控制哈維氏弧菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病的一種安全有效的方法[11-12]。

在自然環(huán)境中尋找群體感應(yīng)抑制劑是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一， 針對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)抑制劑的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[13]。 Naik 等[14]應(yīng)用分子模擬技術(shù)發(fā)現(xiàn)新型吸附劑黏土材料加利百靈-Z（Calibrin Z）可將哈維氏弧菌AHLs 分子降解成更小的片段，使之喪失群體感應(yīng)的信息傳導(dǎo)功能，說明這類食品級(jí)黏土材料對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)具有淬滅作用。 Srinivasan 等[15]研究發(fā)現(xiàn)象橘提取物L(fēng)A-M 和LA-EA 對(duì)哈維氏弧菌KUMB-VA4 生物膜結(jié)構(gòu)形成具有抑制作用， 并降低其代謝活性。Muras 等[16]發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌粘著桿菌（Tenacibaculum sp.）20J 變形體的提取物對(duì)口腔鏈球菌（Streptococcus oralis）和牙鏈球菌 （Streptococcus dentisani）的生物膜形成具有抑制作用。目前，從自然環(huán)境中篩選對(duì)哈維氏弧菌AHLs 分子具有降解作用的乳酸菌，鮮見研究報(bào)道。Chatterjee 等[17]研究發(fā)現(xiàn)牧草青貯中分離的植物乳桿菌能產(chǎn)生抑制銅綠假單胞菌PAO1 毒力因子的QSI。經(jīng)過分離提純發(fā)現(xiàn)該抑制劑為3-苯基乳酸（PLA），能夠抑制銅綠假單胞菌蛋白酶和鼠李糖脂及生物膜形成。 Park等[18]發(fā)現(xiàn)從泡菜中篩選出的清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）NR28對(duì)大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）ATCC43894 的AI-2具有淬滅作用，能達(dá)到降低致病性的目的。本文從海水魚和淡水魚腸道分離的乳酸菌中篩選出對(duì)哈維氏弧菌AHLs 分子具有降解作用的菌株，并對(duì)其抑制作用機(jī)制進(jìn)行分析，為研發(fā)一種新型、綠色、安全的水產(chǎn)品養(yǎng)殖生物制劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件 乳酸菌菌株：菌株LY1-1，LY1-2，LY2-2，LY2-4，LY3-1，LY4-1 來源于鯉魚腸道； 菌株LP1-4，LP1-5，LP2-1，LP4-4，LP4-17 來源于大菱鲆腸道；DY1-1，DY1-2，DY1-9，DY2-1，DY2-5，DY2-11，DY3-2，DY3-14，DY3-15 來源于刀魚腸道；JK1-3，JK4-5，JK19-6 來源于鏡框魚 腸道；YP1-5，YP2-4，YP2-14，YP3-2，YP4-4，YP4-5，YP4-14 來源于牙鲆魚腸道。

指示菌株：紫色桿菌CV026（Chromobacterium violaceum）為紫色桿菌ATCC 31532 的mini-Tn5突變體。

目標(biāo)菌株：哈維氏弧菌ATCC BB-170，美國典型菌種保藏中心。

以上菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 瓊脂粉、LB 瓊脂、LB 肉湯、MRS 肉湯，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（200 000 U/g）、中性蛋白酶（200 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g）、胃蛋白酶（15 000 U/g），華藍(lán)化學(xué)有限公司；乳酸菌生化鑒定管， 杭州天和微生物試劑有限公司； 細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、DNA 標(biāo)記-D、Taq PCR 反應(yīng)混合物、卡那霉素，上海生工生物工程有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

DL-CJ-2N 工作臺(tái)， 北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；IKA Vortex GENIUS 3 振蕩器，德國IKA 公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)， 德國Eppendorf 公司；SPX-25 生化培養(yǎng)箱， 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠； GI54DS 立式高壓蒸汽滅菌鍋， 致微（廈門）儀器有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Labconco Free Zone 2.5 臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)， 美國LABCONCO 公司；MS105UD 電子分析天平， 瑞士梅特勒-托利多有限公司；DYY-8C 電泳儀， 北京市六一儀器廠；Quantity One 凝膠成像系統(tǒng)、mark 酶標(biāo)儀， 美國Bio-Rad 公司； ABI stepone plus PCR 儀， 德國Eppendorf 公司； S-4800 掃描電鏡、E-1045 鍍金儀，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌無細(xì)胞上清液及哈維氏弧菌AHLs的制備 在MRS 液體培養(yǎng)基中接種分離自魚腸道的乳酸菌菌株，于37 ℃培養(yǎng)24 h，傳代2 次。 以接種量2.0%接種于MRS 液體培養(yǎng)基， 于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h 后，4 ℃、6 500 r/min 條件下離心15 min， 上清液用0.22 μm 濾膜過濾得到乳酸菌無細(xì)胞上清液（Cell free supernatants，CFS），于4 ℃條件保存。

參考Vattem 等[19]的方法，將-80 ℃保藏的哈維氏弧菌以接種量2.0%接種于LB 肉湯中，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，傳代2 次后以接種量1.0%接種于LB 肉湯中，30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)12 h，在4 ℃、6 500 r/min 條件下離心15 min， 用0.22 μm 濾膜過濾得到哈維氏弧菌CFS。 將哈維氏弧菌CFS 與乙酸乙酯等體積混合震蕩， 靜置15 min 待分層，收集乳化層，重復(fù)萃取2 次。 將收集的液體于50℃、120 r/min 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至乙酸乙酯完全蒸干，用甲醇溶解哈維氏弧菌AHLs 粗提物，于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 哈維氏弧菌群體感應(yīng)產(chǎn)AHLs 的檢驗(yàn) 將紫色桿菌CV026 以接種量2.0%接種于LB 肉湯中，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，傳代2 代，取200 μL 接種于10 mL LB 肉湯中，其中含10 μg/mL 卡那霉素，30℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。 與含有100 μL 哈維氏弧菌CFS 的10 mL LB 瓊脂混合， 以未加哈維氏弧菌CFS 作為對(duì)照，于30 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察，產(chǎn)生紫色素立即進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.3 抑制哈維氏弧菌群體感應(yīng)乳酸菌的篩選將200 μL 活化2 代紫色桿菌CV026 接種于10 mL LB 肉湯中， 其中含10 μg/mL 卡那霉素，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。 與加入100 μL AHLs 的10 mL LB 培養(yǎng)基混合，倒入底層鋪有10 mL 凝固的素瓊脂的平板中， 用牛津杯打孔法在每孔中加入乳酸菌CFS 180 μL，對(duì)照組孔中加入MRS 肉湯，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，記錄每孔外圍出現(xiàn)的白色渾濁圈直徑，每個(gè)菌株設(shè)3 個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3.4 乳酸菌菌株鑒定

1.3.4.1 生理生化鑒定 選擇對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)有抑制作用的乳酸菌菌株，按《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步鑒定菌株[20-21]。

1.3.4.2 16S rRNA 鑒定 取乳酸菌菌株培養(yǎng)12 h 后的菌懸液1.0 mL，接入1.5 mL EP 管中，8 000 r/min 離心15 min。 按照DNA 快速抽提試劑盒的方法提取乳酸菌菌株的DNA， 使用16S rDNA 通用引物擴(kuò)增。 所用正向引物是27f （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物是1492r （5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’）[22]。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序：Taq PCR Master mix 12.5 μL，DNA 模板1.0 μL，dd H2O 9.5 μL，上游引物27f 1.0 μL， 下游引物1492r 1.0 μL， 總體積25 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃條件下2 min 的預(yù)變性，94 ℃條件下1 min 的變性，60 ℃條件下1 min的退火，72 ℃條件下90 s 的延伸，72 ℃條件下保持10 min，30 個(gè)循環(huán)次數(shù)， 結(jié)束時(shí)保存溫度4 ℃。PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果并記錄、保存。將剩余擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序。 校對(duì)測(cè)序結(jié)果， 并與NCBI 上Gene Bank 數(shù)據(jù)庫中己有序列BLAST 比對(duì)，下載相似序列，使用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.5 乳酸菌粗提物的制備 250 mL 分液漏斗中加入乳酸菌CFS 100 mL，100 mL 乙酸乙酯平均分為5 次加入，震蕩、靜置，待分層后收集上層的乳化層。 50 ℃、120 r/min 條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至乙酸乙酯氣味完全消失，收集殘留液，經(jīng)真空冷凍干燥，于-18 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 乳酸菌粗提物對(duì)紫色桿菌CV026 及哈維氏弧菌生長曲線的影響 用LB 肉湯將已活化的哈維氏弧菌稀釋至106CFU/mL，吸取190 μL 稀釋后的菌懸液于96 孔板中，加入10 μL（質(zhì)量濃度分別為2.0，4.0，8.0，16.0，20，24，32.0 mg/mL）乳酸菌粗提物，對(duì)照為不加粗提物的LB 肉湯，于30 ℃培養(yǎng)24 h，每2 h 測(cè)定OD595值。

1.3.7 乳酸菌粗提物對(duì)哈維氏弧菌生物膜形成的影響

1.3.7.1 96 孔板法測(cè)定哈維氏弧菌生物膜抑制率

每孔加入180 μL 106CFU/mL 哈維氏弧菌菌懸液和20 μL 粗提物， 對(duì)照組加20 μL MRS 肉湯，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。 每孔除去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用200 μL 無菌水清洗3～5 次，200 μL 0.4%結(jié)晶紫保持染色5 min，無菌蒸餾水洗3 次，60 ℃干燥10 min， 每孔加95%乙醇200 μL， 每孔移出150 μL到另一96 孔板中，酶標(biāo)儀測(cè)定OD595值，每個(gè)樣品設(shè)平行3 個(gè)。 抑制率根據(jù)式（1）計(jì)算。

式中，OD對(duì)照——對(duì)照組OD595值；ODQSI——CFS 處理組OD595值。

1.3.7.2 顯微鏡觀察 將無菌的蓋玻片 （R=1.4 cm）放入24 孔板中，孔內(nèi)加入1 mL LB 肉湯和10 μL 哈維氏弧菌菌懸液及100 μL 乳酸菌粗提物，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h 后，超純水潤洗蓋玻片3 次，0.4%結(jié)晶紫保持染色20 min，用油鏡觀察。

1.3.7.3 掃描電鏡分析 將無菌蓋玻片 （R=1.4 cm）放入24 孔板中，孔內(nèi)加入1 mL LB 肉湯、哈維氏弧菌菌懸液10 μL 及QSI 粗提物100 μL，30℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，蓋玻片用超純水洗3 次，于4℃，2.5%戊二醛溶液中固定24 h，用超純水清洗3次去除戊二醛。分別用40%，70%，90%，100%的乙醇梯度脫水，每次洗15 min，真空干燥蓋玻片后噴金，掃描電鏡觀察記錄。

1.3.8 乳酸菌粗提物對(duì)哈維氏弧菌AHLs 的降解作用 參照Romero 等[23]的方法并稍做修改。 取10.0 μL AHLs 粗提物加到0.0，4.0，8.0 mg/mL 的乳酸菌粗提物中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。 取2 mL 紫色桿菌CV026 與45～50 ℃的25 mL LB 固體培養(yǎng)基混勻倒入底層有10 mL 素瓊脂的平板中， 采用牛津杯打孔法， 孔中加入180 μL 樣品，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h， 以0.0 mg/mL 的乳酸菌粗提物作為對(duì)照，V3 型全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀記錄孔周圍出現(xiàn)的紫色圈。

1.3.9 乳酸菌粗提物對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)抑制作用的影響因素

1）酶 調(diào)節(jié)乳酸菌粗提物pH 值分別為2.0，6.0，7.0，8.0 和10.0，加入木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶，使其終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，37 ℃水浴2 h，將pH 值調(diào)為初始值。 對(duì)照組為未處理的乳酸菌粗提物，按1.3.3節(jié)測(cè)定其活性。

2）溫度 在40，60，80，100，121 ℃處理乳酸菌粗提物30 min， 以未處理的乳酸菌粗提物為對(duì)照，按1.3.3 節(jié)測(cè)定其活性。

3）pH 用1.0 mol/L NaOH 和1.0 mol/L HCl 將菌株上清液的pH 值分別調(diào)為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，按1.3.3 節(jié)測(cè)定其活性。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0 分析，數(shù)據(jù)3 次平行，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示結(jié)果，軟件Origin 8.0 繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 哈維氏弧菌產(chǎn)AHLs 的檢驗(yàn)及抑制其群體感應(yīng)乳酸菌的篩選

采用平板傾注法檢驗(yàn)哈維氏弧菌AHLs 分子的產(chǎn)生，結(jié)果表明CFS 使紫色桿菌CV026 發(fā)生紫色色素反應(yīng)， 哈維氏弧菌具有AHLs 類群體感應(yīng)活性。

采用牛津杯打孔法篩選出5 株對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)有抑制作用的乳酸菌菌株，結(jié)果見圖1。菌株LY3-1，LP4-17，LP2-1，JK19-6，YP4-4 的抑菌圈直徑分別為14.21，11.46，11.55，10.40，10.12 mm， 其中菌株LY3-1 抑制活性最強(qiáng)。 選擇菌株LY3-1 做后續(xù)研究。

圖1 對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)有抑制作用的乳酸菌Fig.1 Lactic acid bacteria with inhibitory effect on quorum sensing of V. harveyi

2.2 乳酸菌菌株鑒定

菌株LY3-1 的鑒定結(jié)果見表1，對(duì)照文獻(xiàn)[21]初步判定菌株LY3-1 為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。

表1 菌株LY3-1 的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain LY3-1

菌株LY3-1 的16S rRNA 基因擴(kuò)增結(jié)果如圖2a 所示。 菌株LY3-1 在1 500 bp 處有一特異性條帶， 表明菌株LY3-1 的目標(biāo)片段擴(kuò)增成功。圖2b 為菌株LY3-1 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，菌株LY3-1 與KX881782.1（Lactococcus lactis）在同一分支上，置信度為98%。 鑒定菌株LY3-1 為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。

圖2 菌株LY3-1 的16S rRNA 測(cè)序Fig.2 Sequencing analysis of 16S rRNA of strain LY3-1

2.3 乳酸菌粗提物對(duì)紫色桿菌及哈維氏菌生長曲線的影響

圖3 為菌株LY3-1 粗提物對(duì)紫色桿菌及哈維氏弧菌生長的影響。 與對(duì)照相比，經(jīng)2.0，4.0，8.0 mg/mL 的菌株LY3-1 粗提物處理的哈維氏弧菌生長曲線呈正常生長趨勢(shì)。 當(dāng)LY3-1 粗提物質(zhì)量濃度達(dá)到16.0 mg/mL 時(shí)， 哈維氏弧菌的生長量大幅下降； 當(dāng)LY3-1 粗提物質(zhì)量濃度上升至20.0，24.0，32.0 mg/mL 時(shí)， 哈維氏弧菌的生長量接近于0，表面生長完全被抑制，說明菌株LY3-1 對(duì)紫色桿菌的生長沒有影響，也沒有抑制作用。

圖3 菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌和紫色桿菌CV026 生長曲線的影響Fig.3 Effects of strain LY3-1 crude extracts on growth curves of V. harveyi and C. violaceum CV026

2.4 乳酸菌粗提物對(duì)哈維氏弧菌生物膜形成的影響

由表2 可知，當(dāng)菌株LY3-1 粗提物的質(zhì)量濃度為16.0 mg/mL 時(shí)，抑制率為90.6%。根據(jù)此結(jié)果及粗提物濃度對(duì)哈維氏弧菌和紫色桿菌生長活性的影響，選擇質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL 的菌株LY3-1 粗提物做后續(xù)研究。

菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響如圖4 所示。光鏡觀察結(jié)果表明，對(duì)照組哈維氏弧菌在24 h 后初步形成生物膜，而粗提物處理組的哈維氏弧菌菌體呈分散狀態(tài)， 未形成完整的生物膜（圖4a～h）。 圖5 中，掃描電鏡結(jié)果表明：經(jīng)相同處理時(shí)間，對(duì)照組（i 和k）生物膜結(jié)構(gòu)完整，而經(jīng)菌株LY3-1 粗提物處理的試驗(yàn)組（j 和l）生物膜結(jié)構(gòu)喪失。 這與Devi 等[24]對(duì)枯草芽孢桿菌R-18 提取物以80 μg/mL 質(zhì)量濃度處理干擾了S. marcescens 的群體感應(yīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致生物膜的破壞的結(jié)果相近。

表2 菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌生物膜的抑制作用Table 2 Inhibition effects of crude extracts of strain LY3-1 on biofilm of V. harveyi

圖4 光鏡觀察菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌生物膜的影響Fig.4 Effects of strain LY3-1 crude extraction on biofilm microscopic of V. harveyi by light microscope

圖5 電鏡觀察菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌生物膜形態(tài)的影響Fig.5 Effects of strain LY3-1 crude extraction on biofilm microscopic of V. harveyi electron microscope

2.5 乳酸菌粗提物對(duì)哈維氏菌AHLs 分子的降解作用

采用菌株LY3-1 粗提物降解哈維氏弧菌AHLs 的結(jié)果見圖6。 由圖6 可知，8.0 mg/mL 菌株LY3-1 粗提物降解哈維氏弧菌AHLs 的直徑為14.35 mm， 降解率41.7%；16.0 mg/mL 菌株LY3-1粗提物降解時(shí)，紫色完全消失，表明該粗提物對(duì)哈維氏弧菌AHLs 具有較強(qiáng)的降解作用。 Soukarieh等[25]在喹啉類分子庫中篩選出抑制劑Ia、Ii、IIa 和IIi 抑制菌株銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）中PaO1-L 和PA14 信號(hào)分子形成，具有較強(qiáng)群體感應(yīng)抑制活性，且不干擾細(xì)菌生長。這與本結(jié)果類似。

2.6 乳酸菌粗提物對(duì)哈維氏菌群體感應(yīng)抑制作用的影響因素

1）蛋白酶 圖7 是經(jīng)蛋白酶處理后菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)抑制作用的結(jié)果。 對(duì)照組中抑制直徑為13.49 mm， 經(jīng)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶處理后平均抑制直徑為9.22 mm， 表明菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)的抑制活性顯著降低，該活性物質(zhì)對(duì)蛋白酶敏感，屬于蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

圖6 菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌AHLs 的降解Fig.6 AHLs-degradation of V. harveyi by crude extraction of strain LY3-1

圖7 蛋白酶對(duì)菌株LY3-1 粗提物抑制活性的影響Fig.7 Effects of protease on the activity of crude extraction of strain LY3-1

2）溫度和pH 表3 為不同溫度和pH 處理后菌株LY3-1 粗提物對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)抑制作用的結(jié)果。 由表3 可知， 經(jīng)40，60，80，100，121 ℃處理的粗提物對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)的抑菌作用與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05），表明菌株LY3-1 粗提物具有較好的耐熱性。 在pH 3.5～7.0 范圍，菌株粗提物對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)具有抑制活性；在pH4.5～5.5 范圍，抑制活性較好（P＜0.05），表明菌株LY3-1 粗提物在酸性和偏中性條件下對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)具有較強(qiáng)的抑制作用。

表3 溫度和pH 處理對(duì)菌株LY3-1 粗提物抑制活性的影響Table 3 Effects of temperature and pH on inhibitory activity of strain LY3-1 crude extracts

3 結(jié)論

從鯉魚腸道中篩選出對(duì)哈維氏弧菌群體感應(yīng)及生物膜形成具有抑制作用的乳酸菌菌株LY3-1，經(jīng)生理生化反應(yīng)和16S rRNA 測(cè)序鑒定為乳酸乳球菌。 8.0 mg/mL 菌株LY3-1 粗提物可降低哈維氏弧菌生物膜生成量，降解率為69.8%。 當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到16.0 mg/mL 時(shí)，可完全降解哈維氏弧菌群體感應(yīng)AHLs 分子。 對(duì)蛋白酶、溫度、pH 等影響因素的研究表明： 菌株粗提物抑制活性物質(zhì)屬于蛋白質(zhì)類，具有熱穩(wěn)定性。本文從自然環(huán)境中獲得微生物源性革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)抑制劑，為控制哈維氏弧菌等致病菌找到一種新型生物制劑。