劉沛通 段長(zhǎng)青 燕國(guó)梁*

（1 葡萄與葡萄酒研究中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 2 農(nóng)業(yè)部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100083）

不飽和脂肪酸是釀酒酵母生長(zhǎng)代謝的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 對(duì)酵母繁殖及葡萄酒發(fā)酵香氣物質(zhì)的產(chǎn)生具有重要影響[1-2]。 葡萄汁是釀酒酵母利用不飽和脂肪酸的主要來源，其中油酸、亞油酸和α-亞麻酸是葡萄汁中的主要不飽和脂肪酸， 其濃度和種類變化直接影響酵母的生長(zhǎng)及發(fā)酵性能[3-6]。 葡萄汁中的不飽和脂肪酸被酵母迅速吸收整合入細(xì)胞膜中，改善酵母細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性，提高酵母的抗逆性， 促進(jìn)酵母與環(huán)境基質(zhì)中的物質(zhì)交換，影響酵母生長(zhǎng)繁殖[7-9]。細(xì)胞膜功能的改善影響膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)， 添加不飽和脂肪酸可上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因，增加胞內(nèi)氨基酸的積累；氨基酸是高級(jí)醇類化合物的重要前體物質(zhì)， 其含量的變化直接影響高級(jí)醇及其乙酸酯類物質(zhì)的生成[6]。 同時(shí)，部分不飽和脂肪酸進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)部，通過調(diào)節(jié)香氣前體物質(zhì)以及相關(guān)基因表達(dá)來影響香氣化合物（包括中鏈脂肪酸及其乙酯）的生成[3，10-11]。 高級(jí)醇、 酸類和酯類物質(zhì)濃度的變化共同影響葡萄酒的感官品質(zhì)。

近年來， 大量研究關(guān)注葡萄汁中不飽和脂肪酸的濃度及種類的變化對(duì)葡萄酒發(fā)酵及香氣的作用。 Pinu 等[12]報(bào)道增加亞油酸的濃度抑制了硫化物的產(chǎn)生。 Casu 等[2]研究表明添加亞油酸促進(jìn)高級(jí)醇的合成，降低乙酸酯類物質(zhì)的含量，影響葡萄酒的風(fēng)味和口感。 復(fù)合添加油酸、亞油酸和α-亞麻酸也會(huì)促進(jìn)酵母生長(zhǎng)代謝， 提高葡萄酒中高級(jí)醇和乙酯類物質(zhì)的含量， 調(diào)控葡萄酒香氣品質(zhì)[1]。目前的研究主要集中在復(fù)合脂類或亞油酸含量變化對(duì)酵母發(fā)酵的影響，而油酸和α-亞麻酸濃度變化對(duì)酵母發(fā)酵性能及香氣物質(zhì)濃度的影響仍需探明。 葡萄汁中油酸和α-亞麻酸的含量分別占不飽和脂肪酸總量的10%和13%左右， 僅次于葡萄汁中的亞油酸含量[1]。 油酸和α-亞麻酸的濃度受栽培處理和釀造工藝的影響顯著， 如葡萄果實(shí)的曝光處理可使油酸和α-亞麻酸含量由微量分別增加至117 mg/L 和132 mg/L[1]，而浸漬工藝可將葡萄汁中的油酸和α-亞麻酸濃度分別增加1 至2倍[13]。從實(shí)際生產(chǎn)的角度，研究油酸和α-亞麻酸的濃度變化對(duì)酵母生長(zhǎng)代謝和葡萄酒香氣的影響是很有必要的。 本試驗(yàn)以“赤霞珠”葡萄汁為發(fā)酵基質(zhì)，參考文獻(xiàn)[6]，分別添加3 個(gè)濃度的油酸或α-亞麻酸，比較不同濃度下油酸或α-亞麻酸對(duì)酵母生長(zhǎng)、主要代謝產(chǎn)物以及香氣物質(zhì)生成的影響，旨在進(jìn)一步提高葡萄酒的感官品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器、設(shè)備

葡萄汁：使用2014年采收于河北昌黎的“赤霞珠”（Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon）葡萄果實(shí)，除梗、破碎后出汁，其還原糖239 g/L，可滴定酸（以酒石酸計(jì)）5.9 g/L，pH 3.3，油酸0.13 mg/L，亞麻酸0.12 mg/L。

菌株： 商業(yè)釀酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae var. bayanus）EC1118， 法國(guó)Lallemand公司。

試驗(yàn)儀器：Agilent 1200 series HPLC 系統(tǒng)，美國(guó)Agilent 公司；Agilent 7890N/5975B MS 型 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；離子交換色譜柱HPX-87H Aminex ion-exchange column（300 mm×7.8 mm）， 美國(guó)Bio-Rad Laboratories；毛細(xì)管色譜柱HP-INNOWAX 60 m × 0.25 mm ×0.25 μm，美國(guó)J & W Scientific 公司；示差折光檢測(cè)器 （RID，refractive index detector，G1362A），美國(guó)Agilent 公司； 二極管陣列檢測(cè)器（DAD，photodiode array detector，G1315D），美國(guó)Agilent 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber 萃取柱， 美國(guó)Supelco 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵條件 發(fā)酵前分別向葡萄汁中添加3個(gè)質(zhì)量濃度（12，60，120 mg/L）的油酸或α-亞麻酸， 編號(hào)分別為OA-12，OA-60，OA-120，ALA-12，ALA-60，ALA-120。 在500 mL 錐形瓶中發(fā)酵，每瓶裝入350 mL 葡萄汁，商業(yè)酵母活化后接入葡萄汁中，液封發(fā)酵栓，密封瓶口，25 ℃下靜置發(fā)酵。所有處理設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

發(fā)酵早期每12 h 測(cè)定1 次酵母細(xì)胞生長(zhǎng)情況（OD600nm）和還原糖濃度，進(jìn)入穩(wěn)定期后每24 h測(cè)定1 次， 監(jiān)測(cè)酵母的生長(zhǎng)發(fā)酵情況。 發(fā)酵結(jié)束后，低溫（4 ℃）離心（8 000 r/min，10 min）后棄菌體，上清液于-20 ℃下凍藏，用于代謝產(chǎn)物的測(cè)定。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定 葡萄糖、果糖、甘油、乙醇和有機(jī)酸（乙酸、蘋果酸、檸檬酸和乳酸）的測(cè)定參考Liu 等[14]的方法。5 mmol/L H2SO4溶液為流動(dòng)相，以流速0.6 mL/min 等度洗脫。葡萄糖、果糖、甘油和乙醇的測(cè)定用示差折光檢測(cè)器， 柱溫45 ℃，進(jìn)樣量20 μL。 有機(jī)酸的測(cè)定使用二極管陣列檢測(cè)器， 檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm， 柱溫60 ℃， 進(jìn)樣量10 μL。

揮發(fā)性香氣物質(zhì)的檢測(cè)參考Lan 等[15]的方法，使用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)行。將5 mL 樣品加入15 mL 樣品瓶中，加入1 g NaCl、10 μL 內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2-戊醇）后迅速用帶有隔墊的瓶蓋擰緊密封， 使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber 在40 °C 恒溫條件下180 r/min 萃 取30 min 后， 用Agilent 7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。 使用HP-INNOWAX 60 m × 0.25 mm × 0.25 μm 毛細(xì)管色譜柱，柱溫50 ℃保持1 min，之后以3°C/min 的速率升至220 ℃保持5 min。 載氣為高純氦氣 （純度99.999%），流速1.0 mL/min。 電子轟擊電離源（EI）方式，離子源能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍30～350 m/z。 所有檢測(cè)均做3 次技術(shù)重復(fù)。

使用質(zhì)譜全離子掃描（Scan）圖譜，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的相同檢測(cè)條件下各化合物的保留時(shí)間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進(jìn)行定性分析。使用各化合物在模擬酒溶液（2 g/L 葡萄糖、12%酒精度和7 g/L 酒石酸的水溶液）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析和作圖 使用SPSS 20.0 單因素方差分析（ANOVA）對(duì)處理間各代謝產(chǎn)物含量差異顯著性進(jìn)行分析， 采用Duncan 檢驗(yàn)兩兩比較，顯著性水平P＜0.05。 圖形采用Origin 9.0 繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 油酸或α-亞麻酸對(duì)酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵速率的影響

如圖1 所示，從對(duì)數(shù)中期開始，添加不飽和脂肪酸（油酸或α-亞麻酸）顯著提高酵母的細(xì)胞量，其中12 mg/L 油酸（OA-12）和α-亞麻酸添加組（ALA-12）中酵母的最大OD 值分別為7.69 和7.83，均顯著高于對(duì)照組（7.09）。 同時(shí)，油酸或α-亞麻酸可顯著促進(jìn)葡萄汁中還原糖的消耗， 提高酵母的發(fā)酵速率，12 mg/L α-亞麻酸添加組（ALA-12）的還原糖消耗速率最大（1.80 g/L/h），顯著高于對(duì)照組（1.68 g/L/h）。

2.2 油酸或α-亞麻酸對(duì)發(fā)酵主產(chǎn)物的影響

酒精發(fā)酵結(jié)束后，酒中殘?zhí)橇?、甘油、乙醇和乙酸、蘋果酸、檸檬酸和乳酸的含量如表1 所示。與對(duì)照組相比，添加油酸或α-亞麻酸后，殘?zhí)菨舛入S不飽和脂肪酸濃度的增加呈先降低后增加的趨勢(shì)，其中添加12 mg/L α-亞麻酸（ALA-12）顯著降低葡萄酒中的殘?zhí)菨舛取?添加不飽和脂肪酸可以促進(jìn)糖的消耗，然而不飽和脂肪酸濃度過高時(shí)，其對(duì)酵母生長(zhǎng)代謝的促進(jìn)作用減弱（圖1），導(dǎo)致酵母的糖利用率降低，殘?zhí)菨舛仍黾?。葡萄酒中的乙醇含量隨油酸和α-亞麻酸濃度的增加而升高。與對(duì)照相比，添加油酸和α-亞麻酸各組葡萄酒中的甘油含量有所增加， 增強(qiáng)葡萄酒的圓潤(rùn)感[16]。所有處理葡萄酒中的乙酸含量均在0.2～0.7 g/L 范圍， 含量適中的乙酸可為葡萄酒帶來愉悅的香氣[11]。 與對(duì)照相比，添加油酸和α-亞麻酸組葡萄酒中蘋果酸的含量有所降低， 檸檬酸和乳酸含量并無顯著差異。

圖1 不同濃度油酸（a）或α-亞麻酸（b）對(duì)酵母生長(zhǎng)和還原糖消耗的影響Fig.1 Effects of different concentrations of oleic acid （a）or α-linolenic acid （b）on yeast growth and sugar consumption

表1 添加不同質(zhì)量濃度油酸或α-亞麻酸對(duì)酒精發(fā)酵結(jié)束葡萄酒成分的影響Table 1 Effects of adding different concentrations of oleic acid or α-linolenic acid on the profile of final wines

2.3 油酸或α-亞麻酸對(duì)葡萄酒香氣的影響

酒精發(fā)酵結(jié)束后，從葡萄酒中共檢測(cè)到21 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，包括7 種醇類、4 種乙酸酯類、5種乙酯類、4 種酸類物質(zhì)以及1 種含硫化合物。 其中，異丁醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯等14 種物質(zhì)在酒中含量超過其感覺閾值， 其香氣值（Odour Active Value，OAV）大于1（表2）。

油酸和α-亞麻酸的濃度變化對(duì)香氣化合物影響顯著。異丁醇、異戊醇和苯乙醇是本研究中檢測(cè)出的主要高級(jí)醇，添加油酸或α-亞麻酸可提高葡萄酒中高級(jí)醇的含量（表2）。 葡萄酒中乙酸乙酯、 乙酸異戊酯和乙酸己酯等乙酸酯類物質(zhì)的含量在添加油酸或α-亞麻酸后也有提高， 其中12 mg/L 的α-亞麻酸（ALA-12）顯著促進(jìn)這3 種物質(zhì)的合成， 其含量與對(duì)照相比分別提高了52.27%，27.16%和31.33%，最終導(dǎo)致乙酸酯類物質(zhì)與對(duì)照相比增產(chǎn)49.27%，為葡萄酒帶來果香、花香等愉悅香氣（表2）。 添加油酸或α-亞麻酸促進(jìn)了酸類物質(zhì)（包括己酸、辛酸、癸酸和異戊酸）的產(chǎn)生，其中12 mg/L α-亞麻酸添加組（ALA-12）葡萄酒中辛酸含量最高，比對(duì)照提高31.51%；60 mg/L 油酸（OA-60）添加組葡萄酒中異戊酸含量較對(duì)照提高53.01%（表2）。 與酸類物質(zhì)變化相似，添加油酸或α-亞麻酸促進(jìn)葡萄酒中乙酯類物質(zhì)的生成， 其中12 mg/L α-亞麻酸添加組（ALA-12）中乙酯類物質(zhì)總量較對(duì)照提高32.41%（表2）。 3-甲硫基丙醇是檢測(cè)出的唯一含硫化合物， 其含量過高時(shí)會(huì)給葡萄酒帶來脂肪味。 添加油酸顯著增加了葡萄酒中該物質(zhì)含量，然而α-亞麻酸添加組與對(duì)照酒樣相比并無顯著性差異（表2）。

以上結(jié)果表明，增加葡萄汁中油酸或α-亞麻酸濃度可顯著改變葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量，主要表現(xiàn)為促進(jìn)葡萄酒中高級(jí)醇、 酸類和酯類物質(zhì)的生成，影響葡萄酒的香氣特征。

2.4 油酸或α-亞麻酸發(fā)酵葡萄酒的香氣輪廓

添加不同濃度油酸和α-亞麻酸對(duì)葡萄酒香氣特征的影響直接改變葡萄酒的香氣輪廓。 將葡萄酒中OAV 大于1 的14 種物質(zhì)進(jìn)行香氣系列歸類，參考文獻(xiàn)[17]，根據(jù)各物質(zhì)的香氣特征分為5大類，分別為花香、果香、焦糖味、溶劑味和脂肪味（圖2）。 果香和花香特征在所有葡萄酒中都比較突出，其次為溶劑味、焦糖味和脂肪味。整體來看，與添加油酸相比，添加α-亞麻酸更有利于提升葡萄酒的果香和花香特征， 特別是添加12 mg/L 的α-亞麻酸（ALA-12），可顯著改善葡萄酒的香氣特性。

3 討論

油酸和α-亞麻酸可通過調(diào)節(jié)酵母的生長(zhǎng)代謝來影響葡萄酒的香氣。厭氧發(fā)酵時(shí)，不飽和脂肪酸為酵母生長(zhǎng)提供必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 葡萄汁中其含量的提高可顯著促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵速度[1]。 本研究中，添加油酸或α-亞麻酸可顯著提高酵母的細(xì)胞量， 促進(jìn)葡萄汁中還原糖的消耗（圖1）。 值得注意的是， 添加12 mg/L 的α-亞麻酸（ALA-12）具有較顯著的促進(jìn)作用（圖1）。 釀酒酵母自身不能合成α-亞麻酸，厭氧發(fā)酵條件下適當(dāng)濃度的α-亞麻酸不僅可以保持酵母細(xì)胞膜的完整性，增強(qiáng)酵母的抗逆能力，也可以參與酵母生長(zhǎng)代謝，有利于酵母的生長(zhǎng)發(fā)酵[6-7，9]。

圖2 添加不同濃度油酸或α-亞麻酸對(duì)葡萄酒香氣活性值的影響Fig.2 Effects of adding different concentrations of oleic acid or α-linolenic acid on OAVs of final wines

葡萄汁中的不飽和脂肪酸部分被酵母吸收，參與香氣化合物的代謝。 高級(jí)醇是葡萄酒重要的香氣物質(zhì)，主要由釀酒酵母通過Ehrlich 途徑降解氨基酸生成[22]。 本研究中添加油酸或α-亞麻酸促進(jìn)了高級(jí)醇的生成（表2）。 研究表明，不飽和脂肪酸濃度的升高可上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因GAP1 的表達(dá)水平，促進(jìn)氨基酸向酵母細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加高級(jí)醇前體物質(zhì)氨基酸的濃度， 從而提高葡萄酒中高級(jí)醇的含量[1，23]。OA-12、OA-120 和ALA-120的高級(jí)醇含量高于400 mg/L， 給葡萄酒帶來強(qiáng)烈的刺鼻味[11]。 綜上，控制葡萄汁中不飽和脂肪酸的種類， 保持適當(dāng)?shù)牟伙柡椭舅釢舛纫彩呛苡斜匾摹?/p>

短、中鏈脂肪酸（己酸、辛酸和癸酸）在低濃度時(shí)可產(chǎn)生清新的香氣， 當(dāng)其含量超過20 mg/L 時(shí)會(huì)產(chǎn)生不愉悅的酸腐味[24]。 與對(duì)照相比，添加油酸或α-亞麻酸顯著提高了葡萄酒中短、中鏈脂肪酸的濃度（表2），且各組酸類物質(zhì)總量未超過不良濃度范圍，不僅提高了葡萄酒的香氣品質(zhì)，也對(duì)葡萄酒的香氣復(fù)雜性有重要貢獻(xiàn)[8，24-25]。

酯類物質(zhì)包括乙酸酯類和乙酯類， 可為葡萄酒提供宜人的果香和花香， 對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)有積極貢獻(xiàn)[11]。 添加油酸或α-亞麻酸可提高葡萄酒中乙酸酯類物質(zhì)的含量， 其中以12 mg/L α-亞麻酸（ALA-12）的促進(jìn)作用最為顯著，為葡萄酒帶來果香、花香等愉悅香氣。 隨著α-亞麻酸濃度的增加，其對(duì)乙酸酯類物質(zhì)的促進(jìn)作用逐漸降低。研究表明， 高濃度的不飽和脂肪酸會(huì)抑制乙酸酯合成路徑中的關(guān)鍵基因——乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ATF1）的表達(dá)，降低該酶的活性，從而減少乙酸酯類物質(zhì)的生成[26]。 葡萄汁中不飽和脂肪酸的濃度對(duì)葡萄酒中高級(jí)醇的產(chǎn)生有重要影響。 乙酯類物質(zhì)是另一類重要的酯類物質(zhì)， 其產(chǎn)生主要受底物中鏈脂酰輔酶A 的影響[27]。與酸類物質(zhì)變化相似，油酸或α-亞麻酸促進(jìn)葡萄酒中乙酯類物質(zhì)的生成 （表2）。Saerens 等[28]報(bào)道，添加不飽和脂肪酸可以抑制乙酰輔酶A 羧化酶AAC1 的活性， 進(jìn)而釋放該酶的底物——酰基輔酶A， 導(dǎo)致中鏈脂酰輔酶A 累積，促進(jìn)中鏈脂肪酸乙酯的合成。 然而，不飽和脂肪酸含量過高時(shí)會(huì)抑制乙酯類物質(zhì)的生成[29]。 與本研究結(jié)果相對(duì)應(yīng)， 乙酯類物質(zhì)的濃度隨油酸和α-亞麻酸含量的升高而降低。添加適量油酸或α-亞麻酸可促進(jìn)乙酯類物質(zhì)的合成。

發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒香氣輪廓分析表明， 添加12 mg/L α-亞麻酸后， 與對(duì)照組和其它處理組相比，葡萄酒的花香和果香特征顯著增強(qiáng)，這主要是由于具有花香、果香的苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸乙酯、 己酸乙酯、 乙酸異戊酯含量較高引起的（表2）。 12 mg/L α-亞麻酸的（ALA-12）能夠顯著促進(jìn)葡萄酒中醇、酯、酸類物質(zhì)的合成，增強(qiáng)葡萄酒花香、果香特征，提高葡萄酒的感官品質(zhì)。

4 結(jié)論

提高葡萄汁中油酸或α-亞麻酸的濃度，可以促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)繁殖，提高發(fā)酵能力，增加葡萄酒的甘油含量，并促進(jìn)葡萄酒中高級(jí)醇、酸類和酯類物質(zhì)的生成。 該作用因不飽和脂肪酸種類和濃度不同而變化，其中添加適量（12 mg/L）α-亞麻酸可以顯著增加葡萄酒中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯和癸酸乙酯等酯類物質(zhì)的含量， 產(chǎn)生含量適中的高級(jí)醇（＜400 mg/L），最終更加突出葡萄酒中花香和果香的香氣特征，改善葡萄酒的香氣品質(zhì)，提高葡萄酒感官質(zhì)量。