酈 萍 陳曉鎮(zhèn) 周青青 顧 青

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品微生物技術(shù)研究重點實驗室 杭州310018）

中國傳統(tǒng)的榨菜、歐洲的酸黃瓜、西德的甜酸甘藍(lán)， 被稱為世界三大著名腌菜， 深受消費者喜愛。傳統(tǒng)工藝腌制榨菜大都采用固態(tài)高鹽發(fā)酵，存在榨菜生產(chǎn)周期較長，食鹽含量高，安全品質(zhì)不穩(wěn)定等問題。大量研究發(fā)現(xiàn)，榨菜在腌制過程中會產(chǎn)生大量的亞硝酸鹽[1]，人體攝入后，易與胃部食物中含有的仲胺類物質(zhì)相互反應(yīng)， 形成致癌物——亞硝胺，嚴(yán)重危害健康[2]。 我國國家標(biāo)準(zhǔn)對不同食品中亞硝酸鹽的含量有不同規(guī)定， 榨菜中亞硝酸鹽的含量最高限量為30 mg/kg（GB15198-94）[3]。

目前， 降解亞硝酸鹽的方法主要包括生物降解、化學(xué)降解、物理降解等方法。 生物降解法因安全、高效而備受關(guān)注。 其中，乳酸菌是降解亞硝酸鹽最有效的微生物[4-9]。 乳酸菌發(fā)酵榨菜不僅顯著降低榨菜產(chǎn)品中亞硝酸鹽的含量， 而且有助于改善自然發(fā)酵生產(chǎn)周期長，雜菌污染嚴(yán)重，品質(zhì)不穩(wěn)定等問題，提高榨菜產(chǎn)品的安全性[10-11]。 有研究表明， 不同乳酸菌菌株的亞硝酸鹽能力存在顯著差異。 本研究篩選1 株高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌菌株，對其在榨菜汁培養(yǎng)基中的生長、產(chǎn)酸特性進(jìn)行研究， 為研制適于榨菜發(fā)酵的乳酸菌菌劑及生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 菌種來源

試驗菌種，從健康新生嬰兒糞便、鮮牛奶、發(fā)酵果蔬、發(fā)酵乳制品等分離獲得。

1.2 主要試劑和藥品

無水葡萄糖、檸檬酸銨、牛肉浸提物、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、MgSO4·7H2O、CH3COONa、Tween-80、NaCl、MnSO4、K2HPO4，浙江常青化工有限公司；對氨基苯磺酸、乙酸鋅、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、硼酸鈉、亞鐵氰化鉀，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

MRS 液體培養(yǎng)基： 酵母提取物5 g/L、K2HPO42 g/L、牛肉膏10 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、蛋白胨10 g/L、 無水葡萄糖20 g/L、CH3COONa 5 g/L、Mg-SO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO40.05 g/L、Tween-80 1 mL/L，分裝后121 ℃滅菌15 min。在固體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂。 含2%碳酸鈣的MRS 培養(yǎng)基：在MRS 基礎(chǔ)上添加2%碳酸鈣。

1.4 主要儀器和設(shè)備

尤尼柯2000 可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；pH 酸度計（PB-10），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；生物安全柜，美國Thermo；恒溫培養(yǎng)箱SPX-150B-Z，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；全自動滅菌鍋，美國Tuttnauer；小型離心機(jī)， 美國Thermo； 一次性無菌注射器，浙江常青化工有限公司。

2 試驗方法

2.1 分離純化

將不同來源的樣品（健康新生嬰兒糞便、鮮牛奶、發(fā)酵果蔬、發(fā)酵奶制品等）用MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，稀釋成梯度濃度后涂布，于37 ℃培養(yǎng)。 篩選溶鈣圈明顯的菌落，用20%甘油4 ℃保存。經(jīng)生理生化試驗及16S rDNA 序列鑒定分析， 確定菌株分類。

2.2 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照國標(biāo)GB 5009.33-2010 《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺法[12]繪制亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

篩選獲得的乳酸菌于MRS 液體培養(yǎng)基中活化，接種至MRS 培養(yǎng)基（50 mL 培養(yǎng)基/250 mL 三角瓶）， 接種量為體積分?jǐn)?shù)3%，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。 用1 mol/L 氫氧化鈉將培養(yǎng)基pH 值調(diào)至6.0，加入配制好的無菌NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液，使培養(yǎng)基中最終含量為125 μg/mL，靜置培養(yǎng)（37 ℃，黑暗），發(fā)酵液中NaNO2含量在24 h 后測定?？瞻自囼灲M用無菌水接種。 每個試驗重復(fù)3 次。

式中：C對照組——對照組（未處理組）NaNO2的濃度，mol/L；C處理組——乳酸菌處理后NaNO2的濃度，mol/L。

2.4 榨菜汁培養(yǎng)基的制備

榨菜經(jīng)洗凈、打漿、抽濾，取榨菜汁250 mL，加蒸餾水250 mL、氯化鈉20 g、葡萄糖20 g，混勻，于121 ℃，15 min 滅菌，備用。

2.5 降亞硝酸鹽乳酸菌的發(fā)酵特性研究

對植物乳桿菌LZ227、ZFM228 和ZJ316 的發(fā)酵特性進(jìn)行研究。

2.5.1 接種量的確定 將篩選到的植物乳桿菌LZ227、ZFM228、ZJ316 分別以1%，2%，3%，4%，5%接種量接種到滅菌的榨菜汁培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h 后測定活菌數(shù)。

2.5.2 菌株生長曲線和產(chǎn)酸特性測定 植物乳桿菌LZ227、ZFM228、ZJ316 的接種量（體積分?jǐn)?shù)）分別為3%，4%，3%， 接種至滅菌的榨菜汁培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，每隔6 h 測定波長600 nm 處的吸光度值（細(xì)菌細(xì)胞生長量），并測定pH 值及產(chǎn)酸率。 以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)， 以對應(yīng)時間點的吸光度值、pH 值和產(chǎn)酸率為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線和產(chǎn)酸特性曲線。 以酚酞為指示劑，用0.10 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定酸，測定產(chǎn)乳酸率。

式中：NNaOH——滴定酸所用NaOH 的濃度，mol/L；VNaOH——滴定酸所用NaOH 的體積，L；V樣品——樣品體積，L。

2.5.3 榨菜汁培養(yǎng)基中乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

2.5.3.1 樣品處理 將植物乳桿菌LZ227、ZFM228、ZJ316 按3%，4%，3%的體積分?jǐn)?shù)接種至滅菌的榨菜汁培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)。24 h 后取10 mL裝入15 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，將頂空進(jìn)樣瓶放入50℃水浴鍋內(nèi)加熱30 min，備用。

2.5.3.2 頂空固相微萃取條件 將已老化處理的萃取頭插入進(jìn)樣瓶的頂空部分，50 ℃溫度下平衡吸附30 min 后插入GC 進(jìn)樣口， 啟動儀器采集數(shù)據(jù)，解吸20 min。

2.5.3.3 GC-MS 分析條件 7890A/5975 GC/MS聯(lián)用儀，色譜柱：HP-5MS 型 （30 m×0.250 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣溫度：230 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；升溫程序： 初溫45 ℃保持2 min，5 ℃/min 上升至180 ℃，保持1 min，25 ℃/min 升至230 ℃，保持5.5 min；載氣：氦氣。 由計算機(jī)質(zhì)譜系統(tǒng)NSIT 檢索未知化合物， 將匹配度大于70%的結(jié)果采用面積歸一法計算含量。

2.6 榨菜汁培養(yǎng)基中乳酸菌對亞硝酸鹽的降解率

在含NaNO2（125 μg/mL）的榨菜汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物乳桿菌LZ227、ZFM228 和ZJ316， 每隔12 h 測定亞硝酸鹽降解率，按公式（1）計算。 將NaNO2添加至已滅菌的榨菜汁培養(yǎng)基作為空白對照。 重復(fù)試驗3 次。

2.7 植物乳桿菌ZJ316 的亞硝酸鹽耐受性

將植物乳桿菌ZJ316 接種到含一系列質(zhì)量濃度梯度的NaNO 培養(yǎng)基中（0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，……，10.0 mg/mL），37 ℃培養(yǎng)48 h，測定OD600。

3 結(jié)果與討論

3.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照2.2 節(jié)方法， 分別準(zhǔn)確吸取一系列亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50 mL）， 使亞硝酸鹽含量分別為0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.50，10.00，12.50 μg 亞硝酸鈉，繪制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。其線性方程式為y=0.0241x+0.0001（R2=0.9999），標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，可用于測定亞硝酸鹽含量。

3.2 降亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

篩選培養(yǎng)基平板上鈣溶圈直徑及鈣溶圈直徑與菌落直徑比均特別大的菌落， 挑取單菌落并活化培養(yǎng)，經(jīng)生理生化試驗及16S rDNA 測序分析，確定菌種分類。 按2.3 節(jié)方法研究單菌株對亞硝酸鹽的降解能力。 其中9 株具有亞硝酸鹽降解能力。 結(jié)合亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得各菌株的亞硝酸鹽降解率，其降解亞硝酸鹽能力見表1。 對初始含量為125 μg/mL 的亞硝酸鹽降解率在90%以上的菌株有5 株，降解率80%～90%之間的菌株2株，降解率70%～80%和60%～70%之間的菌株各1株。 其中植物乳桿菌LZ227、ZFM228 和ZJ316 對亞硝酸鹽降解率達(dá)93%以上，NaNO2殘留量分別為8.28，8.69 μg/mL 和4.14 μg/mL，表現(xiàn)出強(qiáng)降解亞硝酸鹽的能力。將其作為重點研究菌株，對生長特性及在榨菜汁中的發(fā)酵特性進(jìn)行深入研究。

表1 菌株發(fā)酵液中亞硝酸鹽降解率Table 1 Nitrite degradation ability of different lactic acid bacterium strains

3.3 降亞硝酸鹽乳酸菌的生長特性

3.3.1 3 株乳酸菌（LZ227、ZFM228、ZJ316）接種量的確定 接種量對乳酸菌的生長有一定影響，接種量過少不利于乳酸菌高密度生長， 而接種量過高，會導(dǎo)致乳酸菌短時間內(nèi)生長旺盛，后期因營養(yǎng)缺乏而致部分菌體死亡。 由圖2 可知3 株菌種的最適接種量為： 菌種LZ227 3%， 菌種ZFM228 4%，菌種ZJ316 3%。

3.3.2 3 株乳酸菌（LZ227、ZFM228、ZJ316）在榨菜汁培養(yǎng)基上的生長曲線和產(chǎn)酸特性 3 株乳酸菌都能很好地適應(yīng)榨菜發(fā)酵環(huán)境， 在榨菜汁培養(yǎng)基中生長情況良好， 其中以植物乳桿菌ZJ316 生長情況最好（圖3）。 在榨菜發(fā)酵過程中，主導(dǎo)發(fā)酵的乳酸菌會分泌乳酸、乙酸等有機(jī)酸，在賦予榨菜產(chǎn)品獨特風(fēng)味的同時，致環(huán)境pH 的下降，抑制好氧雜菌的生長，這對保證榨菜的安全性至關(guān)重要?？疾? 株乳酸菌利用榨菜汁培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酸的情況，衡量乳酸菌發(fā)酵性能。由圖4 和圖5 可知3 株乳酸菌均能利用榨菜汁培養(yǎng)基產(chǎn)酸， 植物乳桿菌ZJ316 在榨菜汁培養(yǎng)基中產(chǎn)酸速度最快， 培養(yǎng)至24 h 發(fā)酵液的pH 值降至4.10， 可滴定酸度達(dá)0.14%，低pH 值有利于減少亞硝酸鹽的富集，從而減少發(fā)酵榨菜中亞硝酸鹽的含量[13]。

圖2 初始接種量對乳酸菌生長的影響Fig.2 Effect of initial inoculation on growth of lactic acid bacteria

圖3 榨菜汁培養(yǎng)基上乳酸菌的生長曲線Fig.3 Lactic acid bacteria growth curve on mustard juice medium

圖4 榨菜汁培養(yǎng)基上乳酸菌pH 值變化Fig.4 Changes of pH of lactic acid bacteria in mustard juice medium

圖5 榨菜汁培養(yǎng)基上乳酸菌可滴定酸的變化Fig.5 Changes of titratable acid of lactic acid bacteria in mustard juice medium

3.4 榨菜汁培養(yǎng)基上3 株乳酸菌對亞硝酸鹽的降解率

菌株LZ227、ZFM228 和ZJ316 在榨菜汁培養(yǎng)基上降解亞硝酸鹽的復(fù)篩結(jié)果見圖6。 3 株菌經(jīng)36 h 的培養(yǎng)，亞硝酸鹽降解率在80.00%以上。72 h時亞硝酸鹽降解率分別為90.30%，89.60%和95.23%， 其中植物乳桿菌ZJ316 降解亞硝酸鹽速度較快，降解能力最強(qiáng)。

3.5 植物乳桿菌ZJ316 的亞硝酸鹽耐受性

圖6 植物乳桿菌LZ217、ZFM228、ZJ316 對亞硝酸鹽降解的影響Fig.6 Effect of L. plantarum LZ217，ZFM228，ZJ316 on nitrite degradation

圖7 ZJ316 對亞硝酸鹽的耐受性Fig.7 The tolerance of ZJ316 on nitrite

考察了植物乳桿菌ZJ316 在不同亞硝酸鹽濃度的耐受性，結(jié)果見圖7。 植物乳桿菌ZJ316 在亞硝酸鹽質(zhì)量濃度3.20 mg/mL 時，乳酸菌仍能正常生長； 當(dāng)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度達(dá)3.60 mg/mL 時，乳酸菌生長受到明顯抑制； 當(dāng)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為4.80 mg/mL 時，乳酸菌生長受到嚴(yán)重抑制；當(dāng)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度大于8.40 mg/mL 時，乳酸菌幾乎不生長。 由此得出植物乳桿菌ZJ316 耐受硝酸鹽質(zhì)量濃度范圍為0～3.60 mg/mL。

3.6 榨菜汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

發(fā)酵樣品通過固相微萃取處理后， 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及相對含量用GC-MS 測定并分析。如表2 所示，3 組發(fā)酵榨菜中含量較高的物質(zhì)為乙酸、辛酸、月桂酸、含硫化合物、甘油芥酸酯，這些物質(zhì)為榨菜的主要風(fēng)味成分。 植物乳桿菌ZJ316、發(fā)酵組、植物乳桿菌LZ227、植物乳桿菌ZFM228 和對照組分別檢出33 種物質(zhì)、27 種物質(zhì)、31 種物質(zhì)、18 種物質(zhì)。 在植物乳桿菌發(fā)酵組中，醇類和酸類均多于對照組。醇類和酸類是影響榨菜風(fēng)味的主要化合物， 賦予榨菜優(yōu)良的發(fā)酵風(fēng)味。另外，感官嗅覺分析表明接種組比對照組香氣更強(qiáng)烈。 植物乳桿菌ZJ316 發(fā)酵組的醇類與酸類物質(zhì)含量明顯優(yōu)于植物乳桿菌LZ227 和植物乳桿菌ZFM228。

表2 乳酸菌發(fā)酵榨菜汁揮發(fā)性風(fēng)味成分表Table 2 Volatile flavor components of mustard juice medium

（續(xù)表2）

4 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)榨菜采用高鹽腌制，鹽耗量高，產(chǎn)生資源浪費， 容易導(dǎo)致亞硝酸鹽含量超標(biāo)， 腌制時間過長，脫鹽排放造成環(huán)境污染等問題。乳酸菌是榨菜腌制發(fā)酵過程中的主要微生物， 在高效降解亞硝酸鹽，不破壞食品基質(zhì)，賦予特殊風(fēng)味等方面具有很大的優(yōu)勢。 本研究通過篩選得到具有高效降解亞硝酸鹽的3 株植物乳桿菌ZJ316、LZ227 和ZFM228，降解率均在93%以上。 其中植物乳桿菌ZJ316 表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和產(chǎn)酸速度， 可在0～3.6 mg/mL 亞硝酸鹽含量環(huán)境生長。 此外，在發(fā)酵過程中， 植物乳桿菌ZJ316 發(fā)酵榨菜產(chǎn)生大量醇類化合物和酸類化合物， 賦予榨菜優(yōu)良的發(fā)酵風(fēng)味。植物乳桿菌ZJ316 作為榨菜發(fā)酵菌株，可有效降低亞硝酸鹽的含量， 增加發(fā)酵榨菜的風(fēng)味物質(zhì)含量和酸度， 從而提高榨菜食品的安全性和營養(yǎng)價值。 本研究結(jié)果為發(fā)酵榨菜優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選和應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。