陳子琪 郜海燕 房祥軍 陳杭君 吳偉杰 劉瑞玲

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室 浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室 中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室 杭州310021）

香菇（Lentinus edodes）屬擔子菌綱（Basidaiomycetes）、傘 菌 目（Agaricales）、口 蘑 科（Tricholomatacete）、香菇屬（Lentinus），又名花蕈、香信、厚菇、花菇等[1]。 香菇起源于我國，是世界第二大菇，也是我國久負盛名的珍貴食用菌，在民間素有“植物皇后”的美譽[2]。 其肉質(zhì)肥厚細嫩，味道鮮美，香氣獨特，具有很高的營養(yǎng)、藥用和保健價值。 香菇含有大量氨基酸和呈味核苷酸， 使其具有濃郁的香氣和鮮味。目前，國內(nèi)外已有香菇風味物質(zhì)組成和形成機理的報道[3]，然而，利用發(fā)酵處理加強香菇風味的研究較少。

發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的食品保存和加工的方式[4]。發(fā)酵利用微生物分泌的糖酶和蛋白酶改進食品質(zhì)構(gòu)和營養(yǎng)物質(zhì)組成，并改善食品風味[5]。 植物乳桿菌是發(fā)酵食品常用的發(fā)酵菌種之一， 其代謝產(chǎn)物相互作用對于食品發(fā)酵風味形成具有重要作用[6]。植物乳桿菌可利用碳水化合物產(chǎn)生有機酸， 并將多肽降解為小肽和游離氨基酸， 最終產(chǎn)生各種揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分， 賦予產(chǎn)品獨特的風味和口感[7]。任大勇等[8-9]利用植物乳桿菌發(fā)酵辣白菜時發(fā)現(xiàn)， 植物乳桿菌可增加還原糖代謝并促進非還原糖向還原糖轉(zhuǎn)化， 同時增加非揮發(fā)性酸的含量和揮發(fā)性酸的種類， 大大改善泡菜的風味， 這與Wang 等[10]的研究一致。 劉宗敏等[11]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可縮短蘿卜干的發(fā)酵周期并增加游離氨基酸和揮發(fā)酯的含量。 有研究報道植物乳桿菌在發(fā)酵果蔬汁[12-13]、發(fā)酵肉制品[14-15]以及調(diào)味品[16]中的應(yīng)用。而目前使用植物乳桿菌發(fā)酵香菇的研究較少。 本課題組篩選香菇發(fā)酵菌種， 發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵所得發(fā)酵液的風味最佳。在前期工作的基礎(chǔ)上，優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵香菇蓋和香菇柄的工藝條件，為香菇發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum，GDM1.191），由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

香菇品種為“L808”，采自浙江省磐安縣盛源食用菌基地。

甘氨酸，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；茚三酮，生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，上海凌峰化學試劑有限公司；鹽酸，上海凌峰化學試劑有限公司

1.2 設(shè)備與儀器

DHG-9079A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Thermo Biofuge startos 型冷凍離心機，美國Thermo 公司；UNICO UV-2802型紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料預處理 產(chǎn)地預冷后當天運回實驗室。 于5 ℃冷庫預冷12 h，選取無機械損傷、外形正常的香菇作為試驗材料。 將香菇蓋和香菇柄分別于65 ℃烘干，粉碎、密封保存。

1.3.2 pH 值測定 按照GB 5009.237-2016 《食品pH 值的測定》測定香菇發(fā)酵液的pH 值[17]。

1.3.3 風味物質(zhì)提取方法 香菇發(fā)酵液的上清液于70 ℃水浴加熱2 h，冷卻至室溫，備用。

1.3.4 游離氨基酸測定 采用茚三酮比色法[18-20]測定香菇發(fā)酵液中游離氨基酸含量。 分別量取香菇蓋和香菇柄發(fā)酵液上清液1.0 mL， 加蒸餾水補充至5 mL。 加入茚三酮顯色劑0.5 mL，磷酸緩沖液1 mL，混合均勻，100 ℃水浴加熱15 min 后冷卻至室溫，加水定容25 mL，搖勻。 在波長570 nm 處以蒸餾水為對照測定吸光度值。

1.3.5 呈味核苷酸測定 采用滋味分光光度法[21-22]測定。 分別量取香菇蓋和香菇柄發(fā)酵液上清液0.5 mL，用0.01 mol/L 鹽酸溶液定容25 mL，搖勻后在波長260 nm 處，以0.01 mol/L 鹽酸為參比溶液，用紫外分光光度計測定吸光值。

1.3.6 風味物質(zhì)評價 等鮮濃度 （Equivalent Umami Concentration，EUC）表示鮮味氨基酸與呈味核苷酸混合物協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強度相當于多少質(zhì)量濃度的單一味精所產(chǎn)生的鮮味強度[23-24]。EUC 根據(jù)式（1）計算：

式中， ai和aj——鮮味氨基酸和鮮味核苷酸的質(zhì)量濃度（g/100 g）；bi和bj——鮮味氨基酸和鮮味核苷酸的呈鮮系數(shù) （Glu 1，Asp 0.077，IMP 1，GMP 2.3，AMP 0.18）。

1.3.7 不同因素對香菇蓋和香菇柄發(fā)酵的影響選取發(fā)酵時間（1，2，3，4 d）、接種量（2%，4%，6%，8%）、粉末量（0.5，1.0，1.5，2.0 g）和發(fā)酵溫度（25，30，35，40 ℃）進行單因素試驗，采用1.3.2 至1.3.6節(jié)所述方法測定風味物質(zhì)，以等鮮濃度（EUC）為指標評價發(fā)酵效果，每組重復3 次。

1.3.8 最佳提取工藝的確定 通過單因素試驗，采用經(jīng)典的Box-Behnken Design（BBD），選取發(fā)酵時間（A）、菌液接種量（B）、粉末添加量（C）和發(fā)酵溫度（D）4 個因素作為優(yōu)化條件的對象。 以-1，0，+1 代表變量水平，試驗因素和水平見表1。通過中心組合設(shè)計，以等鮮濃度（EUC）為響應(yīng)值，重復3 次。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

單因素試驗結(jié)果采用SPSS 22 軟件分析處理， 響應(yīng)面試驗結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對香菇蓋和香菇柄發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間是影響發(fā)酵效果的重要參數(shù)。 發(fā)酵時間過短， 菌體生長和代謝不充足， 使得產(chǎn)酶不足，發(fā)酵不充分[25]。 發(fā)酵時間過長，菌體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，并且發(fā)酵液染菌機率增加，從而影響工藝進程[26]。 發(fā)酵時間對香菇蓋和香菇柄發(fā)酵的影響見表2～3。 隨著發(fā)酵時間延長，香菇蓋發(fā)酵液pH 值明顯下降， 游離氨基酸和呈味核苷酸含量呈上升趨勢， 發(fā)酵第3 天風味物質(zhì)評價達到最高點。 香菇柄pH 值在發(fā)酵第3 天趨于穩(wěn)定，游離氨基酸和呈味核苷酸含量呈上升趨勢，并且EUC 值在第3 天達到最高點，說明發(fā)酵第3 天是香菇蓋和香菇柄的最佳發(fā)酵時間。

表2 發(fā)酵時間對香菇蓋發(fā)酵的影響Table 2 Effects of fermentation times on fermentation results of Lentinus edodes pileus

表3 發(fā)酵時間對香菇柄發(fā)酵的影響Table 3 Effects of fermentation times on fermentation results of Lentinus edodes stipe

2.2 菌液接種量對香菇蓋和香菇柄發(fā)酵的影響

菌液接種量是影響發(fā)酵效果的重要因素之一[27]。 提高接種量，能促進菌種生長繁殖及代謝物生成，從而影響發(fā)酵液的發(fā)酵進程[28]。 接種量過低，菌種生長遲緩，不利于酶及產(chǎn)物的生成；接種量過高，菌體繁殖過快，發(fā)酵底物的營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，并且代謝產(chǎn)物會影響酶的合成[29]與大分子蛋白質(zhì)的降解[30]。 菌液接種量對發(fā)酵的影響見表4～5。隨著接種量增加，香菇蓋和香菇柄發(fā)酵液pH值均有明顯下降。 當接種量為4%時，香菇蓋的呈味核苷酸含量顯著高于其它3 組（P＜0.05），香菇柄的游離氨基酸含量顯著高于其它3 組（P＜0.05）。通過比較EUC 值，當菌液接種量為4%時，香菇蓋和香菇柄的發(fā)酵均達到最優(yōu)。

表4 菌液接種量對香菇柄發(fā)酵的影響Table 4 Effects of inoculation amount on fermentation results of Lentinus edodes pileus

表5 菌液接種量對香菇柄發(fā)酵的影響Table 5 Effects of inoculation amount on fermentation results of Lentinus edodes stipe

2.3 粉末添加量對香菇蓋和香菇柄發(fā)酵效果的影響

粉末添加量決定發(fā)酵底物中營養(yǎng)物質(zhì)的含量[31]， 直接影響菌體在發(fā)酵液中生長代謝進程[32]。粉末添加量越高，發(fā)酵液中發(fā)酵底物越多，菌體生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)越多。 粉末添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響見表6 和表7。 隨著粉末添加量的提高，發(fā)酵底物濃度增加， 香菇蓋和香菇柄發(fā)酵液中游離氨基酸和呈味核苷酸的含量顯著升高， 導致最終的風味物質(zhì)評價（EUC 值）顯著提高。據(jù)文獻[37]報道，EUC 可分為4 個水平： 第1 水平為EUC＞1 000 g MSG/100 g， 第2 水平為 （100～1 000）g MSG/100 g， 第3 水平為（10～100）g MSG/100 g，第4 水平為EUC＜10 gMSG/100 g。 由表6～7 可知，粉末添加量為1.0 g 時，香菇蓋和香菇柄發(fā)酵液的發(fā)酵效果最佳。

表6 粉末添加量對香菇蓋發(fā)酵的影響Table 6 Effects of powder amount on fermentation results of Lentinus edodes pileus

表7 粉末添加量對香菇柄發(fā)酵的影響Table 7 Effects of powder amount on fermentation results of Lentinus edodes stipe

2.4 發(fā)酵溫度對香菇蓋和香菇柄發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度也是影響發(fā)酵效果的重要因素之一[27，33]。 每種菌都有其最適生長溫度，而最適生長溫度不一定是最佳發(fā)酵溫度[34-35]。發(fā)酵時只有選擇合適的溫度，才能達到較好的效果[36]。 發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響見表8 和表9。 隨著發(fā)酵溫度升高，香菇蓋和香菇柄的pH 值上升。 發(fā)酵溫度對香菇蓋發(fā)酵液游離氨基酸的含量沒有顯著影響（P＞0.05），呈味核苷酸含量雖有明顯上升，但30，35，40 ℃時含量無顯著性差異（P＞0.05），最終導致發(fā)酵溫度30 ℃時EUC 值最佳。 發(fā)酵溫度對香菇柄發(fā)酵液風味物質(zhì)含量的影響主要在游離氨基酸含量方面。 由表9 可知，EUC 值變化無顯著性差異，30 ℃時EUC 值最高，說明最佳發(fā)酵溫度30 ℃。

表8 發(fā)酵溫度對香菇蓋發(fā)酵的影響Table 8 Effects of fermentation temperature on fermentation results of Lentinus edodes pileus

表9 發(fā)酵溫度對香菇柄發(fā)酵的影響Table 9 Effects of fermentation temperature on fermentation results of Lentinus edodes stipe

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.5.1 響應(yīng)面設(shè)計方案與試驗結(jié)果 采用Design-Expert 8.0.6 軟件， 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以EUC 值為指標， 做4 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。 共計29 組，設(shè)計方案及結(jié)果見表10。

表10 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 10 Experimental design and results by response surface test

2.5.2 模型方程的建立及顯著性分析 運用Design-Expert 8.0.6 軟件對表10 中試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得出發(fā)酵時間（A）、接種量（B）、粉末量（C）和發(fā)酵溫度（D）與香菇蓋（Y1）和香菇柄（Y2）的EUC 值，擬合得到回歸方程（2）和（3）：

方差分析見表11～12， 兩個模型的P 值均小于0.01，極顯著；失擬項P 值均大于0.05，不顯著，說明模型擬合良好，試驗誤差小，結(jié)果切合實際。模型的回歸系數(shù)R2香菇蓋=0.9957，R2香菇柄= 0.9939，說明此方程試驗擬合度較好，誤差??；R2adj（香菇蓋）=0.9914，R2adj（香菇柄）=0.9877， 說明該模型能解釋99.14%和98.77%的響應(yīng)值變化，能很好預測植物乳桿菌發(fā)酵香菇蓋和香菇柄的工藝參數(shù)。

香菇蓋發(fā)酵液模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗顯示，一次項A 對EUC 的影響顯著（P＜0.05），一次項C，D，二次項A2，B2，C2對EUC 的影響極顯著（P＜0.01）。 香菇柄發(fā)酵液模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗顯示， 一次項C，D， 二次項A2，B2，C2對EUC 的影響極顯著（P＜0.01）。比較A，B，C，D 4 個因素的可知，影響香菇蓋發(fā)酵液EUC 值因素的主次順序為： 粉末量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞接種量；影響香菇柄發(fā)酵液EUC 值因素的主次順序為：粉末量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞接種量。

表11 香菇蓋發(fā)酵液EUC 值回歸模型的方差分析Table 11 Variance analysis of regression model for the EUC value of Lentinus edodes pileus

表12 香菇柄發(fā)酵液EUC 值回歸模型的方差分析Table 12 Variance analysis of regression model for the EUC value of Lentinus edodes stipe

（續(xù)表12）

2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析 等高線為橢圓形表示2個因素交互作用顯著，圓形則與之相反。響應(yīng)曲線直觀反映各因素的響應(yīng)值。 圖1，2 分別為香菇蓋發(fā)酵液和香菇柄發(fā)酵液的各因素與EUC 值的交互作用。通過回歸方程求解，得出植物乳桿菌發(fā)酵香菇蓋的最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵時間4.00 d， 接種量4.38%，粉末量1.5 g，發(fā)酵溫度40 ℃。 植物乳桿菌發(fā)酵香菇柄的最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵時間2.96 d，接種量4.18%，粉末量1.5 g，發(fā)酵溫度30 ℃。 考慮實際生產(chǎn)情況，對該工藝進行修正，得到：香菇蓋的工藝條件為發(fā)酵時間4 d，接種量4.5%，粉末量1.5 g，發(fā)酵溫度40 ℃；香菇柄的工藝條件為發(fā)酵時間3 d，接種量4.2%，粉末量1.5 g，發(fā)酵溫度30 ℃。 在此修正條件下香菇蓋和香菇柄的理論EUC 值分別為84.09 gMSG/100 g 和32.38 gMSG/100 g，實際測得的EUC 值為84.61 gMSG/100 g 和32.02 gMSG/100 g，與預測值基本吻合，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠， 具有一定的應(yīng)用價值。

圖1 各因素交互作用的香菇蓋發(fā)酵液EUC 值響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface diagram of interaction for various factors on the EUC value of fermentation of Lentinus edodes pileus

圖2 各因素交互作用的香菇柄發(fā)酵液EUC 值響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagram of interaction for various factors on the EUC value of fermentation of Lentinus edodes stipe

3 討論

本試驗中利用植物乳桿菌發(fā)酵處理香菇不同部位，提升了香菇風味物質(zhì)含量，明顯改善了香菇的風味。

研究了不同發(fā)酵條件對香菇風味的影響，結(jié)果表明：最佳發(fā)酵時間3 d，最佳菌液接種量4%，最佳粉末添加量1.0 g，最佳發(fā)酵溫度30 ℃。 發(fā)酵時間過短或過長都會影響菌體發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。香菇發(fā)酵液在發(fā)酵第3 天風味最佳，可能是因為植物乳桿菌生長代謝最為旺盛。 菌液接種量為4%，能提高酶和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率，且不會影響相關(guān)酶的合成和大分子蛋白的降解。 粉末量決定菌體生長代謝所消耗營養(yǎng)物質(zhì)的量。 考慮到EUC 值水平范圍和實際應(yīng)用，選擇1.5 g 為最佳粉末量。 本試驗中，最佳發(fā)酵溫度為30 ℃，在此溫度下既能促進植物乳桿菌的生長繁殖， 又促進其風味物質(zhì)的生成。 在單因素試驗的基礎(chǔ)上， 采用Box-Behnken 設(shè)計4 因素3 水平中心組合試驗，分別得到植物乳桿菌發(fā)酵香菇蓋和香菇柄的最優(yōu)工藝條件。 驗證試驗采用該工藝條件， 所得EUC實際值與預測值基本吻合，且比優(yōu)化前提高76.38%和86.23%，表明該工藝條件是植物乳桿菌發(fā)酵香菇蓋和香菇柄最佳工藝條件， 對植物乳桿菌發(fā)酵香菇的風味具有提升作用。

4 結(jié)論

本試驗優(yōu)化了植物乳桿菌發(fā)酵香菇的工藝條件，并結(jié)合實際生產(chǎn)情況，得到植物乳桿菌發(fā)酵香菇蓋的最優(yōu)工藝條件為：發(fā)酵時間4 d，接種量4.5%，粉末量1.5 g，發(fā)酵溫度40 ℃；植物乳桿菌發(fā)酵香菇柄的最優(yōu)工藝條件為： 發(fā)酵時間3 d，接種量4.2%，粉末量1.5 g，發(fā)酵溫度30 ℃。