鄭 嵐 馬耀宏* 孟慶軍 楊俊慧 夏 青 彭 耀 黃金棟 任 鑫

（1 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省科學(xué)院生物研究所 山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南250103 2 萊蕪裕源食品有限公司 山東萊蕪271199）

黑蒜又名發(fā)酵黑蒜，是一種口感軟糯，味道酸甜，具有多種保健功效的新型大蒜發(fā)酵制品[1]。 由于黑蒜具有提高免疫力[2]、抗氧化[3-5]、抗炎癥[6-7]、抗疲勞[8]、調(diào)節(jié)血糖和血脂水平[9-11]、保護(hù)肝臟[12-14]、抗過敏[15]、潤(rùn)腸通便[16]等作用，因此，近年來(lái)受到消費(fèi)者的青睞， 成為大蒜深加工領(lǐng)域最受關(guān)注的研究熱點(diǎn)[17]。

雖然黑蒜的蒜臭味及辛辣味大大降低， 但是仍有部分消費(fèi)者不易接受殘留的蒜味。 提取黑蒜中的有效成分，將其加工為黑蒜保健品，成為延長(zhǎng)黑蒜產(chǎn)業(yè)鏈的有效途徑之一。高溫、高濕的黑蒜發(fā)酵工藝使大蒜發(fā)生一系列復(fù)雜的變化， 多種有益成分含量顯著提高， 其中糖類物質(zhì)含量升高最為顯著[18-19]。大蒜多糖是大蒜中含量較高的活性成分之一，具有多種生物學(xué)活性[20]，對(duì)黑蒜多糖的研究正引起人們的重視。 黑蒜多糖是開發(fā)黑蒜保健品的良好材料， 如何有效利用黑蒜多糖的保健價(jià)值值得深入研究。 黑蒜多糖的提取方法是黑蒜開發(fā)利用的重要技術(shù)問題， 而活性評(píng)價(jià)是研發(fā)黑蒜多糖保健品的前提和基礎(chǔ)。 本研究采用Plackett-Burman 及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化黑蒜多糖的超聲提取工藝， 采用多種體外試驗(yàn)分析黑蒜多糖的體外抗氧化能力。 通過建立斑馬魚氧化應(yīng)激模型和炎癥模型，評(píng)價(jià)黑蒜多糖的體內(nèi)抗氧化、抗炎癥能力，為黑蒜多糖保健品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獨(dú)瓣黑蒜，萊蕪裕源食品有限公司提供；Tg（krt4：NTR-hKitGR）cy17系斑馬魚、AB 系斑馬魚、Tg（Lyz：GFP）系斑馬魚，山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1，1-二苯-2-苦基肼 （DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、甲硝銼，阿拉丁化學(xué)試劑公司；三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽），美國(guó)Fluka 公司；Pronase E 蛋白酶，索萊寶生物科技有限公司；活性氧（ROS）試劑盒（DCFH-DA），南京建成生物工程研究所；脂多糖，美國(guó)Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBST）、4%組織細(xì)胞固定液（PFA）、吲哚美辛，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，上海新芝生物技術(shù)研究所；Dynex Spectra MR 酶標(biāo)儀，美國(guó)Dynex Technologies 公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；5804R 離心機(jī)， 德國(guó)eppendorf公司；LE204E 電子天平， 梅特勒-托利多（Mettler Toledo）公司；UV2700 型紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；SZX16 體視顯微鏡， 奧林巴斯（OLYMPUS）有限公司；101A-2 電熱鼓風(fēng)干燥箱，南通宏大實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑蒜多糖的提取 黑蒜→加水搗碎→超聲波破碎→熱水浸提→離心（10 000 r/min，10 min，4℃）取上清液→按上述步驟重復(fù)提取→合并上清液→減壓濃縮→醇沉→離心 （10 000 r/min，10 min，4 ℃）→沉淀于55 ℃烘干→黑蒜多糖。

1.3.2 多糖含量的測(cè)定 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[21]。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取2 mL 不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中， 加入1 mL 6%苯酚和5 mL 濃硫酸溶液， 搖勻后靜置20 min， 于490 nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求回歸方程。樣品測(cè)定：取2 mL 待測(cè)樣品于試管中，加入1 mL 6%苯酚， 以下同標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，3 次重復(fù)取平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖含量。

1.3.3 黑蒜多糖得率的計(jì)算

多糖得率（%）=[多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）×溶液體積（mL）×稀釋倍數(shù)]/黑蒜質(zhì)量（mg）×100

1.3.4 黑蒜多糖提取工藝的優(yōu)化

1.3.4.1 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn) 以影響黑蒜多糖提取率的因素（固液比、超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇倍數(shù)、醇沉?xí)r間）為響應(yīng)變量（X），以黑蒜多糖提取率為響應(yīng)值（Y），選取的因素和水平見表1。

利用Design Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)PB 試驗(yàn)，選出對(duì)黑蒜多糖提取顯著影響的因素。

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)PB 試驗(yàn)結(jié)果，選擇固液比（x1）、提取時(shí)間（x2）、提取次數(shù)（x3）3 個(gè)因素為響應(yīng)變量，以黑蒜多糖的提取率為響應(yīng)值（Y），響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平表見2。

表1 黑蒜多糖提取PB 試驗(yàn)因素和水平表Table 1 The factor and level of PB experiment for black garlic polysaccharides extraction

表2 黑蒜多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平表Table 2 The factor and level of response surface experiment for black garlic polysaccharides extraction

利用Design Expert 8.0 軟件按照Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，分析黑蒜多糖的最優(yōu)提取條件。

1.3.5 體外抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 羥基自由基清除能力[22]向試管中依次加入1 mL 硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L）、1 mL 水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L）、1 mL 多糖樣品溶液和1 mL過氧化氫溶液（8.8 mmol/L），37 ℃水浴30 min，離心（6 000 r/min，10 min，4 ℃），于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定上清液的吸光度A。 維生素C 為陽(yáng)性對(duì)照。

式中，A0——去離子水代替樣品的吸光度。

1.3.5.2 ABTS 自由基清除能力[23]將ABTS 溶液（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（4.9 mmol/L）等體積混合，避光靜置20 h，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋，使其在波長(zhǎng)734 nm 處吸光度為0.7 ±0.02。 取上述ABTS 工作液0.8 mL 與0.2 mL 樣品溶液混勻，避光6 min，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)吸光度A。

式中，蒸餾水代替樣品為空白組（A空），磷酸鹽緩沖液代替ABTS 工作液為對(duì)照組（A對(duì)）。

1.3.5.3 DPPH 自由基清除能力[24]向試管中加入2 mL 樣品溶液和2 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L）， 混合均勻后避光反應(yīng)30 min， 于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定其吸光度A。

式中，A0——2 mL 乙醇與2 mL 樣品混合液的吸光度；A1——2 mL 去離子水與2 mL DPPH 乙醇溶液混合液的吸光度。

1.3.5.4 還原力[25]分別將1 mL樣品溶液、2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL 鐵氰化鉀溶液（10 g/L）于試管中混合均勻，置于50 ℃水浴20 min， 加入2 mL 100 g/L 三氯乙酸和1.2 mL 1 g/L 三氯化鐵溶液，混勻后于波長(zhǎng)700 nm 處測(cè)定吸光度。

1.3.5.5 總抗氧化能力[26]取0.4 mL 樣品于試管中， 加入4 mL P 溶液 （含有0.6 mol/L 硫酸，28 mmol/L 磷酸三鈉，4 mmol/L 鉬酸銨），95 ℃水浴90 min，冷卻后于波長(zhǎng)695 nm 處測(cè)定其吸光度。

1.3.6 斑馬魚體內(nèi)活性評(píng)價(jià)

1.3.6.1 清除自由基 斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield 等[27]的方法。 挑選受精后24 h 健康并帶有綠色熒光的Tg（krt4：NTR-hKitGR）cy17 系斑馬魚胚胎，加入1 mg/mL 蛋白酶脫膜，將脫膜后的斑馬魚移入24 孔板中， 隨機(jī)分為5 組， 每孔10條。（NC）正常對(duì)照組：養(yǎng)殖水。（MC）氧化應(yīng)激模型組：養(yǎng)殖水中含有甲硝唑（10 mmol/L）。 （PC）陽(yáng)性對(duì)照組：養(yǎng)殖水中含有甲硝唑（10 mmol/L）和維生素C（25 μg/mL）。 （I，II）高、低劑量黑蒜多糖干預(yù)組：養(yǎng)殖水中含有甲硝唑（10 mmol/L）和不同濃度黑蒜多糖 （質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL 和25 μg/mL）。 將裝有斑馬魚的24 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h。 每孔加入100 μL 1 g/mL 三卡因溶液麻醉斑馬魚，在熒光顯微鏡下拍照，用Image pro-plus 軟件計(jì)算軀干部熒光點(diǎn)數(shù)。

1.3.6.2 抑制炎癥導(dǎo)致的活性氧簇（ROS）形成將受精后72 h 健康A(chǔ)B 系斑馬魚移入24 孔板中，隨機(jī)分為6 組，每孔10 條。 （NC）正常對(duì)照組：養(yǎng)殖水。 （MC）炎癥模型組： 養(yǎng)殖水中含有脂多糖（LPS，25 μg/mL）。（PC）陽(yáng)性對(duì)照組：養(yǎng)殖水中含有25 μg/mL 脂多糖和25 μg/mL 維生素C。 （I，II，III）高、中、低劑量黑蒜多糖干預(yù)組：養(yǎng)殖水中含有脂多糖（25 μg/mL）和黑蒜多糖（質(zhì)量濃度分別為25，50，100 μg/mL）。 于28 ℃培養(yǎng)72 h 后， 加入300 μL DCFH-DA 染色40 min，清洗，麻醉斑馬魚，在熒光顯微鏡下拍照。 用Image J 軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.3.6.3 抗炎作用 挑選受精后72 h 健康并帶有熒光的Tg（Lyz：GFP）系斑馬魚，隨機(jī)移入24 孔板中，分為6 組，每孔10 條。將黑蒜多糖樣品或吲哚美辛與斑馬魚共孵育2 h， 然后用20 μmol/L 硫酸銅處理2 h。用4% PFA 處理斑馬魚1 h，清除PFA并使用PBST 清洗斑馬魚。（NC）正常對(duì)照組：養(yǎng)殖水。 （MC）炎癥模型組：硫酸銅處理2 h。 （PC）陽(yáng)性對(duì)照組：5 μg/mL 吲哚美辛處理2 h，然后硫酸銅處理2 h。 （I，II，III）高、中、低劑量黑蒜多糖干預(yù)組：黑蒜多糖（質(zhì)量濃度分別為25，50，100 μg/mL）處理2 h， 然后硫酸銅處理2 h， 在熒光顯微鏡下拍照。 用Image pro-plus 軟件計(jì)算中性粒細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化的黑蒜多糖提取工藝

2.1.1 PB 試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0088x+0.168，R2=0.9995。PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The design and result of PB experiment

運(yùn)用Design Expert 8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，獲得多元一次回歸方程：

Y= 1.80 + 0.42X1+ 0.062X2- 0.004983X3+0.084X4- 0.14X5- 0.42X6+ 0.082X7+ 0.080X8，R2=0.9174。

2.1.1.2 PB 試驗(yàn)的回歸模型方差分析 試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見表4。

表4 PB 試驗(yàn)的回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for the regression model in PB experiment

由表4 可見， 各因素對(duì)黑蒜多糖提取率的影響為：提取次數(shù)＞固液比＞提取時(shí)間＞乙醇倍數(shù)＞提取溫度＞超聲功率＞醇沉?xí)r間＞超聲時(shí)間。其中提取次數(shù)、固液比、提取時(shí)間為顯著因素，其它為不顯著因素。 模型顯著（P ＜0.01），失擬值不顯著（P ＞0.05）。 決定系數(shù)R2= 0.9174， 調(diào)整性決定系數(shù)R2Adj=0.8348，說(shuō)明模型在整個(gè)回歸區(qū)域中擬合度較好，可準(zhǔn)確描述試驗(yàn)結(jié)果。

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.1.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 The design and result of the response surface experiment

運(yùn)用Design Expert 8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=3.51+0.011x1-0.16x2-0.084x3+0.13x1x2-0.13x1x3-0.048x2x3-0.44x12-1.04x22-0.84x32，R2=0.9568。

2.1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)的回歸模型方差分析 對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)的回歸模型進(jìn)行方差分析， 結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)的回歸模型方差分析Table 6 ANOVA for the regression model of response surface experiment

如表6 所示，二次項(xiàng)（x12，x22，x32）對(duì)黑蒜多糖提取率顯著影響，而交互項(xiàng)（x1x2，x1x3，x2x3）均不顯著， 說(shuō)明提取條件間的交互作用較小。 模型顯著（P ＜0.01），失擬值不顯著（P ＞0.05），決定系數(shù)R2= 0.9568，調(diào)整性決定系數(shù)R2Adj= 0.9013，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況擬合程度較好， 模型可很好地反映響應(yīng)變量（x）與響應(yīng)值（Y）之間的關(guān)系。

2.1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)的響應(yīng)面圖 用Design Expert 8.0 軟件處理得到的響應(yīng)面圖（見圖1）。

圖1 不同因素對(duì)黑蒜多糖提取率交互影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot of interaction of different factors on extraction rate of polysaccharides from black garlic

響應(yīng)面圖直觀反映因素間相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。如圖1 所示，響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，說(shuō)明響應(yīng)值（Y）在響應(yīng)變量（x）所選取的范圍存在最大值。 由響應(yīng)面模型得出提取黑蒜多糖的最優(yōu)工藝條件：固液比30.09 倍，提取時(shí)間1.92 h，提取1.95 次，預(yù)測(cè)提取率為3.51%。因操作的局限性，故將提取工藝條件修正為：固液比30 倍，提取時(shí)間2 h，提取2 次。 在此工藝條件下，黑蒜多糖提取率的實(shí)際值為3.65%， 與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異（P ＜0.01）。 最優(yōu)工藝條件較為可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.2 黑蒜多糖的體外抗氧化能力

黑蒜多糖的羥基自由基、ABTS 自由基和DPPH 自由基的清除能力以及還原力、總抗氧化能力見圖2。

羥基自由基是一種化學(xué)性質(zhì)活潑且破壞性強(qiáng)的活性氧自由基。DPPH 法和ABTS 法是分析抗氧化物質(zhì)清除自由基能力最常用的檢測(cè)方法。 由圖2a，2b，2c 可見， 黑蒜多糖清除自由基的能力隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。黑蒜多糖清除羥基自由基、DPPH 自由基和ABTS 自由基的EC50值分別為4 322.43，312.15，198.36 mg/L。由圖2d，2e 可見， 黑蒜多糖的還原力和總抗氧化能力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。 在質(zhì)量濃度為6 000 mg/L 時(shí)， 黑蒜多糖的還原力和總抗氧化能力分別為1.66 和3.35，分別是維生素C 還原力和總抗氧化能力的61.94%和95.99%。

2.3 黑蒜多糖的斑馬魚體內(nèi)活性評(píng)價(jià)

圖2 黑蒜多糖的體外抗氧化能力Fig.2 Anti-oxidant activities in vitro of black garlic polysaccharides

2.3.1 清除自由基 Tg （krt4：NTR-hKitGR）cy17系斑馬魚是評(píng)價(jià)活性物質(zhì)抗氧化能力的轉(zhuǎn)基因斑馬魚， 其表皮細(xì)胞被構(gòu)建成為特異性標(biāo)記熒光蛋白與硝基還原酶的共表達(dá)體系，帶有綠色熒光點(diǎn)。當(dāng)環(huán)境中存在甲硝唑時(shí)， 甲硝唑可與表皮細(xì)胞中的硝基還原酶結(jié)合，產(chǎn)生大量的自由基，引起細(xì)胞死亡，綠色熒光點(diǎn)消失。 當(dāng)抗氧化物質(zhì)存在時(shí)，自由基被及時(shí)清除， 從而避免表皮細(xì)胞的凋亡和綠色熒光點(diǎn)的消失。 黑蒜多糖清除斑馬魚體內(nèi)自由基能力的測(cè)定結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 黑蒜多糖清除體內(nèi)自由基的能力Fig.3 Free radicals scavenging activity in vivo of black garlic polysaccharides

圖4 斑馬魚皮膚細(xì)胞的熒光點(diǎn)數(shù)Fig.4 The number of fluorescent spots in zebrafish skin cells

由圖3、圖4 可見，氧化應(yīng)激模型組（MC）斑馬魚的熒光點(diǎn)數(shù)顯著少于空白對(duì)照組（NC）的熒光點(diǎn)數(shù)（P ＜0.01），氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。 與氧化應(yīng)激模型組相比， 黑蒜多糖干預(yù)組的熒光點(diǎn)數(shù)顯著提高（P ＜0.01），黑蒜多糖低劑量干預(yù)組（I）和高劑量干預(yù)組 （II）的抗氧化率分別為40.18%和50.6%，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。 維生素C 陽(yáng)性對(duì)照組（PC）的抗氧化率為11.38%。黑蒜多糖通過清除自由基產(chǎn)生較強(qiáng)的抗氧化能力，在25 μg/mL 干預(yù)濃度下黑蒜多糖的抗氧化能力高于維生素C。

2.3.2 抑制炎癥導(dǎo)致的活性氧簇（ROS）形成 LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌特有的物質(zhì)， 是系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥的啟動(dòng)因子， 可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致ROS 含量的升高[28-29]。 黑蒜多糖抑制斑馬魚體內(nèi)ROS 形成的測(cè)定結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 黑蒜多糖抑制體內(nèi)ROS 形成的能力Fig.5 Inhibition of ROS formation in vivo by black garlic polysaccharides

圖6 斑馬魚體內(nèi)ROS 的熒光強(qiáng)度Fig.6 The fluorescence intensity of ROS in zebrafish

斑馬魚體內(nèi)的ROS 被標(biāo)記為綠色熒光。 由圖5、圖6 可見，炎癥模型組（MC）斑馬魚的熒光強(qiáng)度顯著高于空白對(duì)照組（NC）（P＜0.01），炎癥模型構(gòu)建成功。 與炎癥模型組相比，黑蒜多糖干預(yù)組的熒光強(qiáng)度顯著降低，黑蒜多糖低、中、高劑量干預(yù)組（I，II，III）的熒光強(qiáng)度分別降低了11.6%（P＜0.05），35.9%（P＜0.01）和58.2%（P＜0.01）， 陽(yáng)性對(duì)照組（PC）的熒光強(qiáng)度降低了42.5%，說(shuō)明黑蒜多糖通過抑制斑馬魚體內(nèi)ROS 形成，減輕氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)。 然而，在25 μg/mL 干預(yù)質(zhì)量濃度下，黑蒜多糖抑制ROS 形成的能力略低于維生素C。

2.3.3 抗炎作用 轉(zhuǎn)基因Tg（Lyz： GFP）系斑馬魚的中性粒細(xì)胞被標(biāo)記為綠色。 中性粒細(xì)胞的激活、遷徙及聚集是炎癥反應(yīng)的重要特征，可直接反映機(jī)體的炎癥水平。 黑蒜多糖抗炎作用的測(cè)定結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 黑蒜多糖的體內(nèi)抗炎能力Fig.7 Anti-inflammatory ability in vivo of black garlic polysaccharides

圖8 斑馬魚中性粒細(xì)胞的遷移個(gè)數(shù)Fig.8 The number of migrating neutrophils of zebrafish

由圖7、圖8 可見，炎癥模型組（MC）斑馬魚的中性粒細(xì)胞遷移數(shù)顯著高于空白對(duì)照組（NC）（P ＜0.01），硫酸銅誘導(dǎo)的炎癥模型構(gòu)建成功。 與炎癥模型組相比， 黑蒜多糖干預(yù)組的中性粒細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少，黑蒜多糖低、中、高劑量干預(yù)組（I，II，III）的細(xì)胞遷移數(shù)分別降低了58.33%（P ＜0.01），70.34%（P ＜0.01）和88.35%（P ＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照組（PC）的熒光強(qiáng)度降低了73%。 這說(shuō)明黑蒜多糖具有顯著的抗炎作用， 當(dāng)其干預(yù)質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)，其抗炎效果與抗炎藥物吲哚美辛（5 μg/mL）無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。 由于黑蒜多糖具有顯著的抑制炎癥導(dǎo)致的ROS 形成能力，所以黑蒜多糖的抗炎機(jī)制可能與其阻斷ROS 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)途徑相關(guān)。

3 結(jié)論

黑蒜多糖最優(yōu)提取工藝為：提取2 次、固液比30 倍、提取時(shí)間2 h、乙醇3 倍、提取溫度70 ℃、超聲功率300 W、 醇沉?xí)r間16 h、 超聲時(shí)間10 min，在該條件下黑蒜多糖的實(shí)際提取率達(dá)3.65%。 黑蒜多糖具有良好的體外抗氧化能力，清除羥基自由基、DPPH 自由基和ABTS 自由基的EC50值分別為4 322.43，312.15 和198.36 mg/L，在黑蒜多糖質(zhì)量濃度為6 000 mg/L 時(shí)， 還原力和總抗氧化能力分別為1.66 和3.35。 通過建立甲硝銼誘導(dǎo)的斑馬魚氧化應(yīng)激模型， 發(fā)現(xiàn)黑蒜多糖具有顯著的自由基清除能力（P ＜0.01）。 通過建立脂多糖誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥模型， 發(fā)現(xiàn)黑蒜多糖可顯著抑制炎癥導(dǎo)致的ROS 含量升高（P ＜0.01）。 通過建立硫酸銅誘導(dǎo)的急性炎癥模型， 發(fā)現(xiàn)黑蒜多糖具有顯著的抗炎活性（P ＜0.01）。 結(jié)論：黑蒜多糖具有良好的抗氧化、抗炎癥活性，可用于開發(fā)具有相應(yīng)功效的保健食品。