劉 陽 許程劍，2* 林 丹 梁鵬娟

（1 四川旅游學院食品學院 成都610100 2 石河子大學食品學院 新疆石河子832000）

凝集素（Lectin）是專一識別糖并與特定結(jié)構(gòu)糖分子可逆、非共價結(jié)合的糖蛋白或蛋白質(zhì)，從植物、動物、微生物中皆可以分離得到[1]。Yoon 等[2]研究發(fā)現(xiàn)從韓國槲寄生[Viscum coloratum（Kom.）Nakai]中分離的凝集素具有免疫調(diào)節(jié)活性，可增強宿主對抗腫瘤的防御系統(tǒng)， 對腫瘤轉(zhuǎn)移的預防和治療效果與NK 細胞（natural killer，NK）和巨噬細胞的活化相關(guān)。研究表明，大量大型真菌均具有一定凝集素活性[3]，可抑制癌細胞增殖，促進機體免疫活性，如阿魏菇[4]、猴頭菌[5]、牛樟芝[6]、杏鮑菇[7]等。 在食品領域凝集素一直是各國學者研究的重點[8-10]。

阿魏菇作為目前食用菌中營養(yǎng)含量最高的一種， 其蛋白質(zhì)含量高達14.9%， 富含不飽和脂肪酸，并含有豐富的維生素及多種礦物質(zhì)[11]，是食用與藥用價值并存的珍貴菌類。 李娜等[12]研究發(fā)現(xiàn)食用阿魏菇有助于減輕宮頸癌患者化療后的不良反應，增強對化療的耐受力。Gong 等[13]研究發(fā)現(xiàn)阿魏菇多糖可提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬作用，進而增強其免疫活性，達到抗腫瘤的目的。目前鮮有報道顯示阿魏菇凝集素的免疫活性。 本文基于真菌凝集素的研究現(xiàn)狀， 采用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)從阿魏菇中分離得到凝集素， 通過凝集素與巨噬細胞的共培養(yǎng)，檢測蛋白的免疫生理活性，探討真菌凝集素在藥用真菌中存在的特點和普遍性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏菇，采至新疆清河縣。 昆明種小鼠，石河子大學動物實驗中心。

二乙氨基乙基纖維素52、 瓊脂糖凝膠4B，上海圓創(chuàng)生物科技有限公司； 小鼠TNF-α、IL-1 Elisa 試劑盒，北京誠林生物科技有限公司；噻唑藍MTT 、RPMI-1640 培養(yǎng)基， 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設備

ENK-PRO 型酶標儀， 美國Bioteck 公司；BT-200E 型恒流泵，上海琪特分析儀器有限公司；BSZ160-LCD 型自動部分收集器， 上海琪特分析儀器有限公司；Ultrospec-5300 型紫外分光光度儀，美國Amersham 公司；真空冷凍干燥系統(tǒng)，日本SHIMADZU；BPN-50CH（UV）二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒公司。

1.3 方法

1.3.1 PFLL 的分離純化 取濕重200 g 的新鮮阿魏菇， 打漿后加入pH 7.2 的PBS 緩沖液1 000 mL，浸泡1 d，次日8 000 r/min 離心20 min，取上清液。 用硫酸銨沉淀蛋白[14]，過夜后8 000 r/min 離心20 min。取沉淀重新溶解于硫酸銨溶液中，透析2 d，冷凍干燥后得粗品。

將粗品溶解后，過DEAD-52 柱，分別用0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L 和0.5 mol/L NaCl 洗脫，于波長280 nm 處測定吸光度值， 按洗脫峰收集合并組分。 過Sepharose 4B 層析柱，收集有峰值的組分，檢測凝血活性。 將有凝血活性的組分合并后的凝集素透析，冷凍干燥得到高純度凝集素PFLL。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細胞的分離 對實驗小鼠于3 d 前腹腔注射1 mL 小牛血清。 實驗當天頸椎脫臼處死小鼠，于醫(yī)用酒精中浸泡5 min，打開腹部皮肽， 腹腔注射無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基15 mL，輕揉腹部10 min，收集腹腔中的培養(yǎng)基，1 000 r/min 離心5 min， 用無血清RPM I-1640 培養(yǎng)基離心洗滌2 次[15]，再用含血清RPMI-1640 培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為5×106個/mL。 將調(diào)整好的細胞懸液按每孔100 μL 加入96 孔培養(yǎng)板， 每組設3個復孔，于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)2 h，吸棄培養(yǎng)液， 除去未貼壁的細胞， 然后加入新鮮的培養(yǎng)基，即巨噬細胞。以不同質(zhì)量濃度的PFLL（10，20，30，40 μg/mL 和50 μg/mL）與巨噬細胞共培養(yǎng)，于空白組加入無血清培養(yǎng)液10 μL。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬細胞增殖活性的檢測 提取小鼠腹腔巨噬細胞并將細胞數(shù)調(diào)整到1×106個/mL。 在培養(yǎng)細胞中加入不同質(zhì)量濃度的PFLL（0，10，20，30，40 μg/mL 和50 μg/mL）和10 μg/mL LPS，并設置空白對照組和LPS 刺激組（10μg/mL）[15]。每個濃度3 個重復孔，將細胞于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。 實驗前，每孔分別加入2 μL 5 μg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。 培養(yǎng)結(jié)束后輕扣去除液體培養(yǎng)基， 每孔加入150 μL DMSO， 震蕩10 min，于波長570 nm 處測定OD 值。 以OD 值為衡量標準判斷細胞增殖情況。 空白對照組為加入無血清培養(yǎng)液10 μL。

1.3.4 NO 生成量的檢測 用Griess 重氮化反應法試劑盒檢測。 取待測上清100 μL，加入96 孔板中，每孔加50 μL Griess 試劑A，輕輕震蕩，反應10 min 后加入50 μL Griess 試劑B，輕輕震蕩，反應10 min 后于波長550 nm 處檢測OD 值。

1.3.5 O2-生成量的檢測 有關(guān)O2-生成量的檢測，將小鼠分成9 組進行實驗。 所有對照組注射無菌PBS （pH 7.2～7.4）。腹腔注射PFLL 溶液。7 d 后收集細胞至24 孔板， 調(diào)整細胞數(shù)為1×105個/孔，然后依照之前的方法收集貼壁巨噬細胞。 兩組巨噬細胞（5×105個/mL）與HBSS（Hank’s 平衡鹽溶液）標準液和高鐵細胞色素C 的混合物 （80 μmol/mL）共同培養(yǎng)[8]，分別添加或者不添加PMA（1 μg/mL）。 在波長540 nm 處測定OD 值，消光系數(shù)=2.1×104/（m·cm）。

1.3.6 TNF-α、IL-1 的檢測 依靠酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）測定上述物質(zhì)。 測定工具為專用試劑盒， 使用方法如下：將試劑盒從冰箱中取出，平衡至室溫，取出所需反應板； 對反應板每孔加入10 μL 標準品、10 μL 樣品，每孔再加入40 μL 樣品稀釋液，輕輕混勻30 s，封住板孔，37 ℃溫育30 min。洗板：甩干板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應板（48 孔）（20 倍洗滌液，用前應稀釋至1 倍），反復洗滌5 次，每孔加入酶，輕輕混勻10 s，37 ℃溫育30 min。洗板（洗去未結(jié)合的反應物）：甩干板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應板，去除水滴；反復洗滌5 次；每孔加入顯色液A 50 μL， 再加入顯色液B 50 μL， 避光溫育15 min；每孔加入100 μL 終止液，輕輕混勻30 s；在30 min 內(nèi)于波長450 nm 處讀取OD 值。 以OD 值為縱坐標， 以標準品濃度為橫坐標， 繪制標準曲線。 根據(jù)樣品的OD 值， 在標準曲線上查出其濃度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 所有試驗重讀3 次， 數(shù)據(jù)值為平均值±標準偏差（SD）。采用方差分析和t 檢驗來確定其統(tǒng)計學意義（P≤0.01）。 數(shù)據(jù)分析和圖形繪制用Spass 18.0 和Origin 8.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFLL 的分離和純化

2.1.1 DEAE-52 離子交換層析洗脫曲線 阿魏菇經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、冷凍干燥等步驟分離出凝集素粗品。將凝集素粗品進行DEAE-52 離子交換層析，建立洗脫曲線。由圖1 可知洗脫過程分別在35 min 和95 min 處有兩個明顯的洗脫峰，收集兩部分的洗脫液透析除鹽， 通過凝血試驗測得35 min 處的洗脫液具有更好的凝血活性， 因此收集35 min 處的洗脫液進一步試驗。

2.1.2 Sepharose-4B 親和層析洗脫曲線 將DEAE-52 離子交換層析35 min 處的洗脫液進行Sepharose-4B 親和層析， 通過PBS 平衡、D-半乳糖解吸附。 如圖2 所示，在210 min 時出現(xiàn)峰值，收集此處洗脫液透析并冷凍干燥得高純度的阿魏菇凝集素。

圖1 PFLL 的DEAE-52 離子交換層析圖Fig.1 DEAE-cellulose chromatogram of crude extract PFLL

圖2 PFLL 的Sepharose-4B 親和層析圖Fig.2 Sepharose-4B affinity chromatography of PFLL

2.2 PFLL 對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活性的影響

MTT 法是一種檢測細胞存活和生長的方法。MTT 的四氮唑環(huán)可被活細胞線粒體的SDH 催化形成MTT-甲瓚復合物，該復合物濃度的變化反映了細胞的增殖活性[14]。 為了研究阿魏菇凝集素對巨噬細胞的體外調(diào)節(jié)作用， 用阿魏菇凝集素同巨噬細胞共培養(yǎng)，根據(jù)不同PFLL 添加量時吞噬細胞吸光度大小確定PFLL 對巨噬細胞增殖活性的影響。圖3a 顯示，添加PFLL 的巨噬細胞增殖活性皆高于空白對照組，表明小鼠腹腔巨噬細胞在PFLL的誘導下增值活性明顯提高，且隨著PFLL 濃度的升高其增值活性明顯增加。 圖3b 所示，巨噬細胞增值活性隨培養(yǎng)時間的延長而上升， 說明凝集素能促進巨噬細胞的增殖作用， 刺激巨噬細胞進一步分化成熟，使之成為活化的巨噬細胞，從而顯著提高其吞噬能力。試驗結(jié)果顯示PFLL 對巨噬細胞增值的影響呈劑量依賴性和時間依賴性。Ajit 等[16]首次發(fā)現(xiàn)小麥胚芽凝集素對巨噬細胞有直接影響， 且小麥胚芽凝集素對巨噬細胞增值的影響同樣呈劑量依賴性和時間依賴性。

圖3 PFLL 對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活性的影響Fig.3 Effect of PFLL on proliferation activity in mice peritoneal macrophage

2.3 PFLL 對NO 誘導的劑量依賴性和時間依賴性

由圖4a 可知，阿魏菇凝集素刺激小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO 的量， 與空白對照組相比，PFLL（20 μg/mL）組出現(xiàn)顯著差異。 隨著凝集素濃度的升高，巨噬細胞NO 產(chǎn)生量增加。 由圖4b 可知，阿魏菇凝集素能夠增加LPS 刺激小鼠腹腔巨噬細胞的NO 產(chǎn)生量，與空白對照組相比，從LPS（10 μg/mL）+PFLL（10 μg/mL）組開始隨著凝集素濃度的升高，巨噬細胞NO 產(chǎn)生量增加，PFLL 對NO 產(chǎn)生量的影響呈劑量依賴性。 巨噬細胞可受多種細胞因子及LPS 誘導活化，產(chǎn)生并釋放大量NO，從而起到抑制或殺傷的作用， 同時還可通過釋放溶酶體酶及細胞毒性因子對組織器官造成損害[17]。 在內(nèi)毒素引起的休克和多臟器功能衰竭中，NO 是重要的炎性介質(zhì)之一。 有效控制NO 的合成和釋放，進一步減輕NO 的細胞毒作用， 對免疫性疾病等的治療具有重要意義。

圖4 PFLL 對小鼠腹腔巨噬細胞分泌NO 的影響Fig.4 Effect of PFLL on NO secretion in peritoneal macrophage

2.4 PFLL 對O2-生成量的影響

PFLL 誘導巨噬細胞產(chǎn)生O2-的結(jié)果如圖5 所示。 在已知的O2-生成過程中，PMA 是公認的信號物質(zhì)。 由圖5a 可知， 加入PMA 的PFLL （0～400 mg/kg）溶液誘導巨噬細胞產(chǎn)生O2-的量為18～38 nmol/mg 細胞蛋白， 而未添加PMA 只添加PELL的O2-的量為9～16 nmol/mg 細胞蛋白。 圖5b 表明在60 min 后， 經(jīng)PFLL 處理的小鼠， 巨噬細胞的O2-的生成量比未處理的高150%（P≤0.01）。另外，經(jīng)PMA 處理的小鼠在各個水平， 巨噬細胞的O2-的生成量都比未處理的高，而僅高40%。由于巨噬細胞是免疫系統(tǒng)中的效應細胞， 活化的巨噬細胞可更加有效地為細胞呈遞抗原， 感染期間更好地吞噬外來顆粒， 形成更好的宿主防御機制[18-19]。PFLL 可以增強其吞噬功能，說明在治療微生物感染和癌癥方面，PFLL 具有潛在的應用價值。

圖5 PFLL 對小鼠腹腔巨噬細胞生成O2-的影響Fig.5 Effect of PFLL on the production of O2- in mice peritoneal macrophage

2.5 PFLL 對TNF-α 生成量的影響

由圖6 可知，PFLL 能夠顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的TNF-α 產(chǎn)生量， 與空白對照組相比，10 μg/mL 組就出現(xiàn)顯著差異。 隨其濃度的升高，巨噬細 胞TNF-α 產(chǎn)生量也增加，TNF-α產(chǎn)生量對PFLL 呈劑量依賴性，然而在試驗范圍均比LPS 組低。 在固定PFLL 濃度下，TNF-α 產(chǎn)生量呈時間依賴性，24 h 后具有顯著性差異。TNF-α 主要由單核細胞和巨噬細胞分泌， 它可活化單核細胞和巨噬細胞，提高巨噬細胞的殺傷活性；同時也可通過上調(diào)巨噬細胞MHCII 類分子， 提高其抗原遞呈能力；還可提高中性粒細胞的吞噬能力，提高超氧陰離子的分泌，增強ADCC 功能[20]。

圖6 凝集素對小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α 的影響Fig.6 Effect of Lectin on TNF-α secretion in peritoneal macrophage

2.6 PFLL 對IL-1 生成量的影響

由圖7a 可知， 在不同劑量的PFLL 作用下，IL-1 的生成量呈劑量依賴性。 在PFLL 為50 μg/mL 時與LPS 為10 μg/mL 作用， 巨噬細胞產(chǎn)生的IL-1 量接近。 觀察圖7b 可知，PFLL 誘導IL-1 的產(chǎn)生呈時間依賴性，IL-1 生成量均高于對照組，且60 h 后生成量繼續(xù)增加。 石玉榮等[21]研究發(fā)現(xiàn)共同培養(yǎng)巨噬細胞和肺癌細胞時， 巨噬細胞可促進肺癌細胞增殖， 同時肺癌細胞可增強巨噬細胞IL-1 的表達，抑制細胞自噬。 多個研究[22-24]也表明IL-1 可促進腫瘤細胞增殖。 本試驗結(jié)果驗證了這一結(jié)論。

圖7 凝集素對小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1 的影響Fig.7 Effect of Lectin on IL-1 secretion in peritoneal macrophage

3 結(jié)論

對阿魏菇凝集素提取、 純化后， 得到純品PFLL。 測定了PFLL 誘導巨噬細胞對幾種細胞因子NO、O2-、TNF-α、IL-1 生成的結(jié)果。 在PFLL 的作用下，巨噬細胞產(chǎn)生的NO、O2-、TNF-α、IL-1 顯示出劑量依賴性和時間依賴性。 試驗結(jié)果表明PFLL 可以增強巨噬細胞的免疫活性，并具有潛在的免疫調(diào)節(jié)的輔助作用。 IL-1 具有抑制細胞生產(chǎn)和殺滅細胞的能力。 TNF-α 直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性， 可促進T 細胞產(chǎn)生各種炎癥因子。 上述細胞因子都由活化的巨噬細胞釋放。 以上研究一方面為凝集素促進細胞因子在mRNA 水平的表達及其調(diào)控奠定了基礎， 另一方面對于阿魏菇凝集素的開發(fā)和應用提供了理論依據(jù)。