田 陽(yáng) 饒 歡 薛文通

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

花生過敏是一種發(fā)病率高且難以治愈的過敏性疾病，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)皮炎、哮喘、呼吸困難乃至死亡。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)高達(dá)1%的兒童對(duì)花生過敏[1-2]?；ㄉ^敏在美國(guó)、加拿大、英國(guó)、以色列的兒童發(fā)病率分別達(dá)到了1.4%，1.7%，1.9%和0.2%。引發(fā)花生過敏的蛋白有17 種[4]， 其中含量最高（15%）的是Ara h 1[5]，研究顯示超過95%的中國(guó)患者血清可識(shí)別該蛋白[6]。 Ara h 1 是同源三聚體，由3 條分子質(zhì)量均為63.5 ku 的肽鏈組成[7]。23個(gè)致敏表位分布在肽鏈交聯(lián)處，使其在熱加工、酶解乃至消化過程中仍能保持免疫活性[8]。 研究Ara h 1 的結(jié)構(gòu)及特性，對(duì)明確花生致敏機(jī)理，生產(chǎn)低致敏花生制品具有重要意義。

如何實(shí)現(xiàn)Ara h 1 的有效提取及純化， 是后續(xù)研究的第1 步。 目前較為成熟的提純方法一般包括硫酸銨鹽沉淀、陰離子交換層析、凝膠排阻層析、親和色譜柱層析等流程[9-10]，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，步驟繁瑣，且成本較高。 Ara h 1 在冗長(zhǎng)的提純過程中容易降解或失活， 層析的過多更會(huì)降低目標(biāo)蛋白的得率。 蛋白的重組表達(dá)可有效避免操作流程的繁瑣，提高純度與得率，降低純化成本。 重組蛋白的基因序列與天然蛋白一致，在結(jié)構(gòu)、功能特性方面與天然蛋白差異較小[11]。 此外，使用重組技術(shù)生產(chǎn)的低致敏性蛋白被應(yīng)用于口服免疫治療實(shí)驗(yàn)中[12]，取得了良好的治療效果。 重組致敏蛋白在研究致敏原結(jié)構(gòu)表征[13]、致敏原檢測(cè)[14]、致敏機(jī)理以及抗敏疫苗[15]的開發(fā)等方面正在被愈加廣泛的應(yīng)用。

現(xiàn)有研究表明， 重組Ara h 1（recombinant Ara h 1， rAra h 1）的制備過程仍存在技術(shù)難題。 由于原核表達(dá)系統(tǒng)與植物源蛋白之間的遺傳特性差異較大，所以rAra h 1 在大腸桿菌中的表達(dá)程度較低，且易形成包涵體，難以釋放在裂解液上清中。蛋白在裝配過程中較易錯(cuò)誤折疊，形成低分子質(zhì)量的變體，使得rAra h 1 的純化變得較為困難。本研究針對(duì)以上問題，對(duì)基因工程菌誘導(dǎo)過程、菌體裂解條件、蛋白純化流程進(jìn)行優(yōu)化，逐步建立高效的rAra h 1 制備方法，為進(jìn)一步開展致敏原的結(jié)構(gòu)及生物活性研究提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

pET-32a（+）Ara h 1 重組質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）公司合成。大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pLysS 感受態(tài)細(xì)胞，北京全式金生物公司。限制性核酸內(nèi)切酶SacI/NotI，TAKARA 工程有限公司。 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂糖、氨芐青霉素粉末、甘油，北京均利博生物有限公司。 異丙基硫代半乳糖苷 （isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-100）、 乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、 十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、 十二烷基磺酸鈉（Sodium laurylsulfonate，SLS）、 咪唑、 二硫蘇糖醇 （DLDithiothreitol，DTT）、苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、溶菌酶，北京全式金生物公司。Ni-NTA，Qiagen 公司。SDS-PAGE 分離膠緩沖液（4×，pH 8.8）、SDS-PAGE 濃縮膠緩沖液（4×，pH 6.8）、蛋白上樣緩沖液，索萊寶公司。TMB 試劑盒，生工生物工程（上海）公司。 Ara h 1 多克隆抗體，由英國(guó)曼徹斯特大學(xué)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200 紫外-可見分光光度計(jì)，美析儀器有限公司；迷你型蛋白電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；超聲波細(xì)胞破碎儀， 寧波新芝生物技術(shù)公司；THZ-82 恒溫水浴振蕩器， 常州國(guó)華電器有限公司；SHP-80 細(xì)菌培養(yǎng)箱， 林茂科技有限公司；5804R 冷凍離心機(jī)， 德國(guó)Eppendorf 公司；BHC-1304IIB2 生物安全柜， 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pET-32a-Ara h 1 重組質(zhì)粒的制備與鑒定

通過NCBI GENE BANK 數(shù)據(jù)庫(kù)查得Ara h 1的基因編號(hào)為AF432231.1， 其編碼區(qū)共有1 895個(gè)堿基。在Ara h 1 核酸序列末端插入6×his 標(biāo)簽和終止密碼子，序列兩端分別添加SacI 和NotI 酶切位點(diǎn)。 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及檢驗(yàn)測(cè)序交由生工生物工程（上海）公司完成，保證目標(biāo)基因的準(zhǔn)確插入。

1.3.2 Ara h 1 基因的誘導(dǎo)表達(dá)

1）大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 的轉(zhuǎn)化與篩選 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化，每100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中加入20 ng pET-32a-Ara h 1 或空載質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物，在冰上放置30 min。將混合后的感受態(tài)細(xì)胞放入預(yù)加溫至42 ℃的循環(huán)水浴中，放置80 s，不可搖動(dòng)。 快速將離心管轉(zhuǎn)至冰浴，使細(xì)胞冷卻1～2 min。 將感受態(tài)細(xì)胞與800 μL LB 培養(yǎng)基混合，37 ℃搖床溫育45 min， 使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)目標(biāo)基因，溫和搖動(dòng)細(xì)胞。分別取轉(zhuǎn)化pET-32a-Ara h 1 和空載質(zhì)粒的菌液， 均勻涂布于含有50 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板（直徑90 mm）上進(jìn)行菌株篩選。 倒置培養(yǎng)皿，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h 后即可觀察到有白色的菌落， 即轉(zhuǎn)化子。分別挑取單克隆3 個(gè)，在LB 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。

2）目標(biāo)基因的誘導(dǎo)表達(dá) 在50 mL 離心管中加入10 mL LB 培養(yǎng)基及0.5 mg 氨芐青霉素，按照1/100 的體積比分別加入轉(zhuǎn)化子菌液，37 ℃培養(yǎng)3.5 h。取1 mL 混合的菌液測(cè)量OD600，當(dāng)該值等于0.6 時(shí)，留下2 mL 未誘導(dǎo)的菌液作為空白對(duì)照， 其余菌液加入300 mmol/L IPTG 后分別在16℃和22 ℃誘導(dǎo)6，20，22 h。 誘導(dǎo)完成后對(duì)菌液及空白對(duì)照進(jìn)行4 ℃離心（5 000 g，50 min），留下菌體后用蛋白上樣緩沖液進(jìn)行裂解， 并使用SDSPAGE 鑒定其表達(dá)效果。

1.3.3 菌體裂解條件的優(yōu)化 使用優(yōu)化的誘導(dǎo)條件大量誘導(dǎo)大腸桿菌BL21 （DE3）pLysS， 在每100 mL 菌液離心得到的菌體中加入10 mL 裂解液（配方見表1），將裂解液插在冰盒中，使用超聲波細(xì)胞粉碎儀裂解細(xì)胞，釋放蛋白，直至裂解液變得澄清透亮。 該過程保持低溫， 以免蛋白受熱變性。 將裂解液4 ℃離心（10 000 g，40 min）后，分別取上清和沉淀制備成電泳樣品，在SDS-PAGE 中檢測(cè)裂解后的目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 重組蛋白rAra h 1 的純化

1）Ni-NTA beads 預(yù)洗 取400 μL Ni-NTA，置于15 mL 尖頭離心管中， 離心棄保存液。 加入10 mL 裂解液使其處于穩(wěn)定緩沖體系，快洗2 次，慢洗1 次（快洗：上、下輕柔顛倒混勻幾次，離心力為400 g，4 ℃離心2 min，棄上清；慢洗：旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10 min，離心，離心條件同快洗）。

2）蛋白與Ni-NTA beads 孵育 在預(yù)洗過的Ni-NTA beads 中加入10 mL 蛋白上清液， 分別4℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)40 min、2 h、3 h，4 ℃離心（10 000 g，20 min），棄上清。 使用洗液（20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L 咪 唑，300 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L ED-TA，1 mmol/L DTT，0.4% Triton-100，2%丙三醇，pH 7.4）將吸附蛋白后的Ni-NTA 快洗2 次，慢洗1 次。 洗完后取出10 μL Ni-NTA，加入蛋白上樣緩沖液， 做SDS-PAGE 檢測(cè)Ni-NTA beads 吸附情況。

表1 6 種裂解液配方Table 1 Composition of six kinds of lysis buffer

3）梯度洗脫 取出300 μL Ni-NTA beads于1.5 mL EP 管中，4 ℃離心棄上清。 加100 μL洗脫液A （20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.4% Triton-100，10%丙三醇，pH 7.4）洗脫兩次。 每次洗脫時(shí)4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育1 h，4 ℃離心（600 g）2 min， 得上清置于新的1.5 mL EP 管中。后繼續(xù)在Ni-NTA beads 中加入100 μL 洗脫液B（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.4%Triton-100，10% 丙三醇，pH 7.4）洗脫兩次，步驟同上。 收集洗脫后的上清液，通過SDS-PAGE 檢測(cè)洗脫液中蛋白種類。

1.3.5 質(zhì)譜鑒定純化蛋白的種類 純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 后割下目標(biāo)條帶送至北京邦非生物科技有限公司進(jìn)行MALDI TOF/TOF 質(zhì)譜鑒定。 氨基酸序列比對(duì)使用MASCOT （Matrix Sciences，英國(guó)）軟件系統(tǒng)分析。

1.3.6 免疫印跡測(cè)定rAra h 1 免疫活性 參考Rao 等[16]的方法，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)膜至PVDF 上（80 mA，300 V，90 min），用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉（37 ℃，2 h），洗膜3 次，每次5 min，然后將PVDF 膜與1∶5 000（體積比）稀釋的Ara h 1 抗體在4 ℃條件下孵育過夜，洗膜后加入1：5 000（體積比）稀釋的HRP 酶標(biāo)羊抗兔IgG 二抗，37 ℃溫育2 h。 洗膜后使用TMB 試劑盒顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-32a-Ara h 1 重組質(zhì)粒的鑒定

通過使用限制性內(nèi)切酶Sacl 和Notl 切割重組質(zhì)粒，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。 1 號(hào)泳道中出現(xiàn)兩條明顯的條帶，表明基因重組質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)并未插入其它雜質(zhì)基因。 其中5 900 bp 的條帶為pET-32a 載體，1 895 bp 左右的條帶為目標(biāo)基因帶， 目標(biāo)帶的分子質(zhì)量數(shù)值符合NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中Ara h 1 蛋白的數(shù)據(jù)。

圖1 瓊脂糖電泳鑒定pet-32a（+）Ara h 1 重組質(zhì)粒Fig.1 Identification of pet-32a （+）Ara h 1 recombinant plasmid by agarose electrophoresis

精準(zhǔn)插入目的基因是評(píng)價(jià)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功的重要指標(biāo)， 也是保證后期目標(biāo)基因成功表達(dá)的重要步驟。 此處通過對(duì)重組質(zhì)粒中的目標(biāo)基因分子質(zhì)量、序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)重組質(zhì)粒的專一性和準(zhǔn)確性，為開展下一步試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

2.2 目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)情況鑒定

使用SDS-PAGE 鑒定轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌是否成功表達(dá)rAra h 1。 如圖2a 所示，與泳道1、3、5 相比， 泳道2、4、6 中明顯多出1 條分子質(zhì)量約為110 ku 的條帶，該條帶亮度較高，是目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物。由此可見，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的克隆子均可表達(dá)目標(biāo)基因。與天然Ara h 1 相比，重組Ara h 1 的分子質(zhì)量增加了46.5 ku。 這主要是由于在pET-32a 標(biāo)準(zhǔn)載體中，啟動(dòng)子之后增加了Trx-tag、His-tag、S-tag 以及9 個(gè)酶切位點(diǎn)， 共計(jì)1 162 個(gè)堿基。多翻譯出的序列中包含388 個(gè)氨基酸，其分子質(zhì)量約為46.56 ku， 造成重組蛋白分子質(zhì)量較高。經(jīng)課題組試驗(yàn)表明，該蛋白的分子結(jié)構(gòu)及致敏性均與天然Ara h 1 蛋白具有較高的一致性[17]，可用于下一步的改性及降敏研究。 相比于泳道2和6，泳道4 中的目標(biāo)帶亮度更高，說明克隆子2號(hào)中目標(biāo)基因的表達(dá)效率為最高。 由此選擇克隆子2 號(hào)擴(kuò)大培養(yǎng)，大量生產(chǎn)目標(biāo)蛋白并進(jìn)行純化。

根據(jù)圖2b 中的結(jié)果，24 ℃，24 h 誘導(dǎo)后的克隆子2 號(hào)，可大量表達(dá)目標(biāo)蛋白（泳道A 中有明顯的110 ku 條帶）， 而菌體裂解液上清中卻只有很少的目標(biāo)蛋白 （泳道B 中110 ku 處幾乎沒有條帶）。 泳道C 中目標(biāo)帶的含量較多，表明大部分目標(biāo)蛋白被包裹在包涵體內(nèi)，難以溶解在裂解液中。使用Ni-NTA 對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行吸附和洗脫， 結(jié)果如泳道D、E 所示，鎳柱無法和裂解液上清中目標(biāo)蛋白結(jié)合， 反而與分子質(zhì)量約為100 ku 和40 ku等的雜蛋白結(jié)合。 這是由于大腸桿菌的誘導(dǎo)條件不適宜，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量過少，裂解液上清中的目標(biāo)蛋白含量顯著少于鎳柱， 導(dǎo)致鎳柱無法有效識(shí)別重組蛋白， 轉(zhuǎn)而與雜帶結(jié)合。 為了提高rAra h 1 的表達(dá)效率，使其在裂解液上清中得到釋放，對(duì)大腸桿菌的誘導(dǎo)條件及菌體裂解條件進(jìn)行研究。

圖2 質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 中的表達(dá)Fig.2 Expression of plasmid in Escherichia coli BL21（DE3）pLysS

2.3 菌體誘導(dǎo)條件、裂解條件變化對(duì)重組蛋白表達(dá)量及可溶性的影響

高溫短時(shí)誘導(dǎo)大腸桿菌雖然可使菌體生長(zhǎng)較快，但易造成重組蛋白過度折疊及形成包涵體[18]。由此，選擇22，16 ℃分別誘導(dǎo)6，20，22 h。 誘導(dǎo)完后裂解菌體，檢測(cè)裂解液上清中的重組蛋白含量，結(jié)果如圖3 所示。圖3a 中泳道1、2、3 中110 ku 的蛋白亮度顯高于泳道4、5、6， 說明相比于16 ℃和22℃誘導(dǎo)可使重組蛋白獲得較高表達(dá)量。 此外，泳道2 中的rAra h 1 含量在6 條泳道中為最高，由此確定了22 ℃誘導(dǎo)22 h 為大腸桿菌的最佳誘導(dǎo)條件。

將大量誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行裂解，結(jié)果如圖3b所示。相比于泳道A，泳道B 中目標(biāo)蛋白的表達(dá)量較高，說明誘導(dǎo)條件合適。 泳道C 與泳道D 中均存在分子質(zhì)量為110 ku 的條帶，說明優(yōu)化誘導(dǎo)條件后，目標(biāo)蛋白形成包涵體的含量減少，重組蛋白已部分溶解在裂解液上清中。

為了增加重組蛋白的可溶性， 使用6 種配方的裂解液對(duì)菌體進(jìn)行裂解，結(jié)果如圖4 所示。鹽溶作用可以破壞蛋白分子表面的水膜， 增加分子表面的電荷，促使蛋白分子與鈉離子競(jìng)爭(zhēng)水分，從而提高溶解效率。 裂解液1、2、3 號(hào)中氯化鈉濃度逐步上升，而泳道3、5、7 中分子質(zhì)量為110 ku 的蛋白亮度并未增加， 推測(cè)鹽溶作用不能使rAra h 1溶解， 因此本試驗(yàn)中將裂解液中的氯化鈉濃度確定為較低的200 mmol/L，以免造成蛋白質(zhì)變性。裂解液4、5、6 號(hào)中添加了十二烷基磺酸鈉（SLS）作為陰離子表面活性劑，以提高目標(biāo)蛋白的親水性。根據(jù)圖4 顯示， 泳道9、11、13 中分子質(zhì)量為110 ku 的蛋白條帶亮度增加，說明添加SLS 可增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的可溶性。與泳道12 相比，泳道14 中目標(biāo)蛋白的含量明顯下降， 說明增加SLS 的濃度可抑制包涵體的形成， 提高重組蛋白在裂解液上清中的表達(dá)效率。 據(jù)本課題組研究經(jīng)驗(yàn)，SLS 的濃度過大會(huì)抑制his 標(biāo)簽蛋白與Ni-NTA 的結(jié)合，因此在裂解液中配方中添加15 mmol/L SLS，在提高蛋白可溶性的同時(shí)避免純化時(shí)蛋白與Ni 柱結(jié)合的效率過低。

圖3 誘導(dǎo)條件對(duì)rAra h 1 表達(dá)及純化的影響Fig.3 Effect of inducing conditions on the expression and purification of rAra h 1

圖4 不同配方裂解液中rAra h 1 的溶解度變化Fig.4 The solubility change of rAra h 1 in different lysis buffers

2.4 重組蛋白純化條件的優(yōu)化

將裂解液上清與Ni 柱共孵育，通過控制孵育時(shí)間的長(zhǎng)度，使得雜質(zhì)蛋白結(jié)合較少[19]。 本試驗(yàn)選取40 min，2 h，3 h 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)終止孵育， 并對(duì)Ni柱進(jìn)行洗脫。使用SDS-PAGE 對(duì)目標(biāo)蛋白與Ni 柱的結(jié)合效率、 洗脫結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果如圖5 所示。 圖5a 中， 泳道3、5、7 中均出現(xiàn)分子質(zhì)量為110 ku 的目標(biāo)蛋白以及90 ku 和22 ku 的兩條蛋白雜帶，泳道4、6、8 分別是其對(duì)應(yīng)的洗脫結(jié)果。與泳道5、7 相比，泳道3 中約90 ku 和約22 ku 的雜蛋白條帶亮度較低， 這是由于蛋白液（裂解上清液）與Ni 柱結(jié)合時(shí)間越短，雜蛋白越難掛柱。本試驗(yàn)最終選擇40 min 為Ni 柱結(jié)合時(shí)間。

圖5 孵育時(shí)長(zhǎng)和梯度洗脫對(duì)rAra h 1 純化效果的影響Fig.5 The influence of binding time and gradient elution on the purification of rAra h 1

使用梯度咪唑洗脫液洗脫可以控制Ni 柱中結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量， 從而對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)合效率進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)而獲得純化的重組蛋白。 本試驗(yàn)中，分別采用50 mmol/L 和100 mmol/L 的洗脫液對(duì)結(jié)合蛋白后的鎳柱洗脫2 次， 并對(duì)洗脫過程中鎳柱結(jié)合蛋白的情況做SDS-PAGE 檢測(cè)。 如圖5b 所示，泳道F、G 中雜帶含量最低，說明梯度洗脫過程中，使用100 mmol/L 咪唑洗脫蛋白可獲得較佳的純化效果。

2.5 重組蛋白的鑒定與免疫性評(píng)價(jià)

使用SDS-PAGE 檢測(cè)誘導(dǎo)前、 后菌體表達(dá)蛋白，裂解后上清液，沉淀，結(jié)合蛋白后的鎳柱以及100 mmol/L 咪唑洗脫液中的蛋白，結(jié)果如圖6a 所示。泳道5、6、7 中110 ku 的目標(biāo)蛋白含量高且雜帶少，表明rAra h 1 的純化流程效率較高。 使用質(zhì)譜鑒定分子質(zhì)量110 ku 蛋白條帶是否與Ara h 1 氨基酸序列相符合， 結(jié)果如圖6b 所示， 共有9條標(biāo)志性肽段與Ara h 1 相符，重組蛋白與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Ara h 1 氨基酸匹配分值達(dá)到426，鑒定該條帶即重組Ara h 1 蛋白。

使用western-blot 評(píng)價(jià)重組蛋白的免疫原性，結(jié)果如圖6c 所示。 泳道B、C、D、E 中成功表達(dá)的重組蛋白均可與anti-Ara h 1 抗體結(jié)合， 說明重組蛋白具有與Ara h 1 抗體結(jié)合的能力并保持良好的免疫活性。

圖6 rAra h 1 純化結(jié)果鑒定及Western-Blot 分析Fig.6 The identification and western-blot analysis of rAra h 1

3 討論

重組過敏原不僅保留了天然過敏原的抗原性，而且易于制備，方便改性，已廣泛應(yīng)用在過敏原檢測(cè)和口服免疫治療疫苗的生產(chǎn)[20-21]。重組蛋白技術(shù)可以針對(duì)致敏原的線性表位做出定點(diǎn)氨基酸改變，從而靶向改變致敏原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，獲得低致敏性衍生物。 這些低致敏衍生物可在表現(xiàn)較低的IgE 結(jié)合能力的同時(shí)，保留T 細(xì)胞反應(yīng)活性，因此可用于特異性免疫治療[22-23]。

隨著重組致敏原在過敏病癥診斷、 治療等方面的廣泛應(yīng)用， 重組技術(shù)的優(yōu)化也愈加成為研究熱點(diǎn)。目前，已有學(xué)者報(bào)道Ara h 1、Ara h 2、Ara h 6 的重組制備技術(shù)[9，24-26]，由于表達(dá)載體不同，目標(biāo)基因序列插入位點(diǎn)不同，所帶標(biāo)簽不同等原因，所以各種制備方式存在較大差異， 目標(biāo)基因表達(dá)的效率也各不相同。例如，Gregory 等[27]使用萊茵衣藻制備Ara h 1 和Ara h 2， 雖然表達(dá)效率較高，但是重組蛋白的免疫性與天然蛋白相差較大。Lew等[28]對(duì)Ara h 2.02 進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其在大腸桿菌中的表達(dá)效率增加，通過親和層析、蛋白變性和復(fù)性等流程對(duì)不可溶的重組蛋白進(jìn)行純化，操作過程涉及步驟較為繁瑣。 閆飛等[9，29]采用RTPCR 獲得Ara h 1 基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-Ara h 1，優(yōu)化大腸桿菌誘導(dǎo)條件后，利用親和純化獲得rAra h 1。 本試驗(yàn)前期曾嘗試采用該研究條件進(jìn)行誘導(dǎo)和蛋白純化， 然而由于質(zhì)粒構(gòu)建不同，重組蛋白的可溶性始終較低，對(duì)后續(xù)純化工作造成一定困難。 本研究通過對(duì)重組Ara h 1 蛋白工藝中的菌體誘導(dǎo)條件、純化條件等重新優(yōu)化，得到高效的制備方法， 為后期針對(duì)重組Ara h 1 展開結(jié)構(gòu)及生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

在制備重組蛋白時(shí)， 目標(biāo)基因的表達(dá)很容易形成包涵體，不能溶解在裂解液上清中。這多是因植物源蛋白的遺傳信息與原核表達(dá)系統(tǒng)相差較大，基因工程菌的誘導(dǎo)條件不適宜所致。若要純化包涵體中的蛋白，則需要變性、復(fù)性等一系列操作[18，30]。 對(duì)于致敏蛋白而言，變性與復(fù)性可能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而使過敏原喪失免疫原性。如何促使目標(biāo)蛋白在裂解液上清中大量表達(dá)，是亟需解決的關(guān)鍵問題。研究結(jié)果表明，改變裂解液的pH 值，使其遠(yuǎn)離目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)，調(diào)整裂解液中鹽離子的濃度促進(jìn)重組蛋白的鹽溶， 添加陰離子交換劑改善蛋白與水分子的結(jié)合效率等措施都可增加重組蛋白的可溶性[31-32]。重組蛋白的制備過程中，誘導(dǎo)條件的確定，菌體裂解液、鎳柱平衡液和洗脫液的配方選擇尤為重要。 本研究針對(duì)以上條件進(jìn)行研究， 結(jié)果表明：300 mmol/L IPTG 于22 ℃誘導(dǎo)菌液22 h 時(shí)蛋白表達(dá)量最高； 添加15 mmol/L 十二烷基磺酸鈉可將蛋白釋放在上清液中， 使用含50 mmol/L 和100 mmol/L 咪唑洗脫液分別洗脫2 次和1 次， 可得到純度較高且免疫原性良好的重組Ara h 1。 rAra h 1 高效制備方法的確定可為之后研究Ara h 1 結(jié)構(gòu)、致敏力變化、致敏機(jī)制以及低致敏衍生物的生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。