楊慧波，虞閏六，繆 勤，劉德良

（1） 云南省第三人民醫(yī)院兒科，云南昆明 650011；2） 杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江杭州 310000）

我國(guó)殘疾人群有8 296 萬(wàn)，其中聽(tīng)力殘疾人群有2 780 萬(wàn)[1]，穩(wěn)居各類(lèi)殘疾疾病之首。大部份的耳聾“無(wú)藥可治”，僅能靠植入人工耳蝸或者配戴助聽(tīng)器等器械輔助手段改善。費(fèi)用昂貴不說(shuō)，還有使用壽命的限制，再加上價(jià)格不菲的康復(fù)費(fèi)用，讓普通家庭無(wú)力承擔(dān)。據(jù)上海市委常委、上海交通大學(xué)教授沈曉明測(cè)算，一個(gè)聾兒耗費(fèi)社會(huì)衛(wèi)生資源超過(guò)70 萬(wàn)元，聾兒家庭承受著經(jīng)濟(jì)和精神上的雙重壓力[2]。目前為止，難以靠醫(yī)學(xué)技術(shù)預(yù)防新生兒聽(tīng)力障礙疾病的發(fā)生，如果耳聾的發(fā)現(xiàn)不及時(shí)還會(huì)導(dǎo)致由聾至啞、言語(yǔ)障礙，造成情感上、心理上和社交中的各種問(wèn)題，給兒童的身心健康造成嚴(yán)重影響[3]。

遺傳是導(dǎo)致耳聾最大的病因，約占60%，其中非綜合征型占42%，包括常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、X-連鎖遺傳，線(xiàn)粒體遺傳；綜合征型約18%，包括Alport 綜合征、Pendred 綜合征、Waardenburg 綜合征、BOR 綜合征、Usher綜合征等四百余種[4]。新生兒聽(tīng)力篩查存在自身局限性，由于僅篩查出生后3～42 d 的聽(tīng)力，容易發(fā)生漏診的遲發(fā)性耳聾。另外藥物敏感性基因突變攜帶者不能通過(guò)聽(tīng)力篩查檢測(cè)出來(lái)，難以通過(guò)預(yù)警來(lái)預(yù)防藥物導(dǎo)致的耳聾。據(jù)資料顯示我國(guó)因遺傳而致聾的患者呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)[5]。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)遺傳性耳聾基因篩查主要是四個(gè)常染色體隱性基因GJB2、GJB3、SLC26A4 和線(xiàn)粒體12S rRNA。新生兒耳聾遺傳基因篩查可以提供更多的潛在性的耳聾信息，并及早采取干預(yù)措施，對(duì)提高我國(guó)人口素質(zhì)有著重要的意義，為優(yōu)生優(yōu)育這一政策的實(shí)施提供保障。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心提供的2018 年8 月至2019 年9 月出生的4 020 個(gè)新生兒，新生兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)，自愿進(jìn)行耳聾基因篩查。4 020 例中，453 例為昆明地區(qū)送檢樣品。

1.2 耳聾基因篩查

1.2.1 新生兒采血 新生兒出生72 h 后，用專(zhuān)用的采血濾紙采集新生兒足跟內(nèi)側(cè)或外側(cè)血三個(gè)血斑，將血片置于清潔空氣中，避免陽(yáng)光直射，自然晾干（3～4 h） 呈深褐色，登記造冊(cè)，并將檢查合格的濾紙干血片，置于塑料袋內(nèi)，保存在2～8℃冰箱中。在規(guī)定時(shí)間內(nèi)將濾紙干血片遞送至杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心。

1.2.2 基因篩查 血液樣品經(jīng)過(guò)DNA 提取、PCR擴(kuò)增、SPA 反應(yīng)、延伸反應(yīng)和樣本脫鹽后，點(diǎn)樣到芯片上。使用MALDI-TOF（基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間） 質(zhì)譜儀獲得數(shù)據(jù)。基因檢測(cè)試劑盒和相關(guān)儀器使用均依據(jù)要求進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 新生兒足跟血標(biāo)本耳聾基因篩查結(jié)果

4 020 例新生兒有3.29%的新生兒檢測(cè)到耳聾基因突變，其中GJB2 的檢出率為2.19%，GJB3的檢出率為0.16%，SLC26A4 檢出率為0.12%，線(xiàn)粒體12S rRNA 的檢出率為0.10%。其中GJB2的檢出率最高，占總檢出率的88.45%，其中雜合突變占82.08%，純合突變?yōu)?.37%。GJB3 的檢出率次之，占總檢出率的4.86%，SLC26A4 的檢出率占3.65%，GJB3 和SLC26A4 的突變均為雜合突變。線(xiàn)粒體12S rRNA 的檢出率最低，占總檢出率的3.04%，其中異質(zhì)突變占2.66%，均質(zhì)突變占0.38%，見(jiàn)表1。

表1 4 020 例新生兒耳聾基因篩查突變類(lèi)型及百分率結(jié)果（%）Tab.1 Screening analysis of deafness genes mutation in 4020 newborns （%）

2.2 耳聾易感基因篩查結(jié)果突變類(lèi)型分布

GJB2 基因突變率最高，在檢測(cè)的6 個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)c.109G＞A 雜合突變與純合突變占的比例最高，分別為552 例和46 例。其次c.235 del C 雜合突變?yōu)?9 例。GJB3 基因檢測(cè)了2 個(gè)突變位點(diǎn)c.538 C＞T 和c.457 G＞A，均為雜合突變。SLC26A4基因檢測(cè)了11 個(gè)突變位點(diǎn)，其中c.919-2 A＞G 雜合突變檢測(cè)到37 例。線(xiàn)粒體12S rRNA 檢測(cè)了兩個(gè)突變位點(diǎn)m.1494 C＞T 和m.1555 A＞G，其中m.1494 C＞T 未檢測(cè)到突變，m.1555 A＞G 均質(zhì)突變和異質(zhì)突變均檢測(cè)到，見(jiàn)表2。

表2 耳聾易感基因篩查出的突變類(lèi)型分布情況（%）Tab.2 Distribution of mutation types detected by deafness susceptibility gene screen （%）

2.3 2019 年來(lái)新生兒耳聾基因篩查結(jié)果

全國(guó)范圍內(nèi)GJB2 基因是四個(gè)基因中突變比例最高的，與本篩查的結(jié)果一致。全國(guó)部分地區(qū)正常出生新生兒耳聾基因篩查總結(jié)見(jiàn)表3。

表3 2019 年全國(guó)各地區(qū)新生兒耳聾基因［n（%）］Tab.3 Newborn deafness genes in China,2019［n］

3 討論

3.1 4 個(gè)耳聾易感基因突變特點(diǎn)

在當(dāng)前的研究中，GJB2 基因突變的檢出率最高，是主要的致病原因之一。GJB2 基因的突變大多位于基因編碼區(qū)，臨床表現(xiàn)為先天性雙耳重度或極重度耳聾。本研究發(fā)現(xiàn)GJB2 基因c.235 del C純合突變1 例。c.235 del C 純合突變會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)致合成一個(gè)沒(méi)有生物活性的CX26 蛋白。CX26 蛋白是縫隙連接蛋白家族的一員，在電鏡下描述為與貼壁細(xì)胞接觸的質(zhì)膜上的區(qū)域性特殊結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)是由細(xì)胞間通道組成的，這些通道促進(jìn)了離子和小分子在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移。CX26 蛋白功能缺失造成重度感音神經(jīng)性耳聾。該類(lèi)患兒的聽(tīng)力無(wú)法恢復(fù)，即使佩戴了助聽(tīng)器效果也不明顯，最好的辦法是盡早植入人工耳耳蝸[10]。在本研究中還發(fā)現(xiàn)GJB2 基因c.109G＞A 雜合突變552 例，純合突變46 例，占所有突變的79.03%。GJB2 c.109G＞A 純合突變致病性，目前在臨床上為攜帶爭(zhēng)議位點(diǎn)，劉清明等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)了14 例GJB2 基因c.109G＞A 位點(diǎn)純合突變，其中3 例是中耳炎引起的聽(tīng)力下降，這14 例攜帶者1～3 年a 聽(tīng)力隨訪(fǎng)正常。Huculak 等[11]檢查了15 例GJB2 基因c.109G＞A 位點(diǎn)純合突變患者，發(fā)現(xiàn)這些患者均有輕中度耳聾，因此認(rèn)為該突變可致聾，只是病程慢而已。

本研究中發(fā)現(xiàn)GJB3 基因c.538 C＞T 和c.547 G＞A 雜合突變13 例，突變檢出率為0.16%，該基因的檢出率高于浙江長(zhǎng)興，低于廣州梅州，甘肅武威和浙江舟山。結(jié)果提示該基因的分布可能存在地域差異。GJB3 基因是連接蛋白基因家族的成員。編碼的蛋白質(zhì)（CX31） 是縫隙連接的一個(gè)組成部分，縫隙連接由一系列細(xì)胞間通道組成，這些通道為低分子量物質(zhì)在細(xì)胞間的擴(kuò)散提供了途徑。該基因突變和染色體顯性或隱形的遺傳性非綜合征性耳聾有關(guān)，患兒有可能發(fā)生遲發(fā)性聽(tīng)力損失。

SLC26A4 基因又被稱(chēng)做“一掌致聾基因”，主要在甲狀腺高表達(dá)。該基因突變與Pendread 綜合征有關(guān)，Pendred 綜合征是一種常染色體隱性遺傳疾病，典型定義為感音神經(jīng)性耳聾/聽(tīng)力障礙、甲狀腺腫大和碘異常組織化伴或不伴甲狀腺功能減退，該綜合征的特征是聽(tīng)力受損，與內(nèi)耳畸形有關(guān)，如前庭導(dǎo)水管（enlarged vestibular aqueduct，EVA） 擴(kuò)大[12]。SLC26A4 基因表達(dá)產(chǎn)物為潘特林（Pendrin），一種轉(zhuǎn)運(yùn)碘-氯離子的蛋白質(zhì)。該病的發(fā)病機(jī)理尚不明確，可能是由于SLC26A4/PDS基因雙等位基因突變引起的，基因突變后引起潘特林功能和結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致甲狀腺過(guò)氧化酶缺陷以及碘的有機(jī)化障礙，以及內(nèi)耳前庭導(dǎo)水管內(nèi)氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，從而導(dǎo)致聽(tīng)力下降同時(shí)伴有甲狀腺腫大。SLC26A4 基因突變位點(diǎn)檢出率最高的是c.919-2 A＞G 雜合突變，其次為c.2168 A＞G 雜合突變，該結(jié)果與多篇文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-14]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)SLC26A4 基因純合突變，王海燕等[9]的研究發(fā)現(xiàn)SLC26A4 基因純合突變的攜帶者在出生時(shí)并沒(méi)有全表現(xiàn)為聽(tīng)力損失。這一結(jié)果提示即使新生兒通過(guò)了聽(tīng)力篩查也要持續(xù)監(jiān)測(cè)聽(tīng)力情況，必要時(shí)需進(jìn)行顳骨CT 檢查[15]。本研究中m.1555 A＞G突變率為0.10%，低于全國(guó)許多地區(qū)的檢出率，體現(xiàn)了地域差異性。

12S rRNA 是線(xiàn)粒體基因，屬于母系遺傳。臨床表現(xiàn)為氨基糖苷類(lèi)抗生素藥物性致聾。線(xiàn)粒體DNA（mtDNA） 突變是在許多國(guó)家都是感音神經(jīng)性耳聾的重要原因之一，該基因突變的攜帶者對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物非常敏感，低劑量的氨基糖苷就可以引起耳鳴甚至嚴(yán)重的聽(tīng)力損害[16]。由于該基因母系遺傳的特性，可根據(jù)遺傳規(guī)律推導(dǎo)出家族中其他成員的基因型。因此對(duì)于這類(lèi)基因突變的攜帶者，應(yīng)該指導(dǎo)其科學(xué)用藥，避免或減少藥物性耳聾的發(fā)生。

3.2 耳聾基因篩查的探討

在新生兒出生缺陷病癥中，耳聾最為常見(jiàn)。早期聽(tīng)力篩查雖然檢測(cè)了新生兒的聽(tīng)力狀況（3～42 d），但遲發(fā)型的耳聾無(wú)法檢測(cè)到。由于超過(guò)60%的語(yǔ)前聾是由遺傳導(dǎo)致的，明確遺傳致病因素是耳聾精準(zhǔn)診治干預(yù)的基礎(chǔ)和前提。近年來(lái)由于測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，耳聾基因檢測(cè)變得容易實(shí)施，為其普及創(chuàng)造了良好的條件。目前國(guó)家針對(duì)部分地區(qū)的新生兒，免費(fèi)開(kāi)展了耳聾基因的篩查，主要檢測(cè)4 個(gè)常見(jiàn)耳聾基因的一些位點(diǎn)，如本研究中檢測(cè)了21 個(gè)位點(diǎn)，其他研究中檢測(cè)了13、15、11、22 個(gè)位點(diǎn)不等。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，擴(kuò)大篩查基因以及突變位點(diǎn)將變得更加容易實(shí)現(xiàn)，雖然擴(kuò)大篩查范圍能提高檢出率，但檢測(cè)位點(diǎn)的增加也會(huì)出現(xiàn)一些臨床意義解釋不清的變異情況，使得醫(yī)生和患者/攜帶者處于兩難境地[17]。因此耳聾基因的篩查應(yīng)該結(jié)合實(shí)際情況，以能夠檢出耳聾風(fēng)險(xiǎn)、降低子代患病率、達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育為目的，且不給醫(yī)患雙方帶來(lái)更多的工作和精神壓力為準(zhǔn)。