馬志強(qiáng)，王 霖，王曉燕，瞿春燕，高 茜，許世濤，劉子龍

（昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650301）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染人體后引起一種具有傳染性的慢性疾病[1]，該病有流行性強(qiáng)、危害程度高以及造成死亡人數(shù)較多的特點(diǎn)。在2018年全球結(jié)核病報(bào)告顯示中，我國(guó)約有89 萬(wàn)人新感染結(jié)核，對(duì)國(guó)人的健康和生活質(zhì)量有較嚴(yán)重的影響[2-3]。結(jié)核分枝桿菌感染者就診時(shí)往往因“漏診”“誤診”而錯(cuò)失最佳診斷和治療時(shí)機(jī)[4]，一般認(rèn)為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是細(xì)菌學(xué)痰培養(yǎng)檢測(cè)，但由于痰結(jié)核菌培養(yǎng)有要求較高、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等缺陷，并不利于結(jié)核菌感染者的早期快速診斷[5]。臨床常用檢測(cè)方法有痰涂片抗酸桿菌法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）、以及影像學(xué)和病理學(xué)等檢測(cè)方法，但這些方法敏感性較低，陽(yáng)性率不高，不能完全滿(mǎn)足臨床的需要[6-8]，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中：ADA、TB-DNA 及BACTEC MGIT 960 等檢測(cè)方法，在靈敏度和特異性上都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)[9-11]，但是上述方法在聯(lián)合檢測(cè)上有何價(jià)值還未明確。據(jù)此，本研究分析ADA、TB-DNA 及BACTEC MGIT 960 快速聯(lián)合檢測(cè)在疑似結(jié)核感染診斷中檢測(cè)數(shù)據(jù)，明確快速聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為結(jié)核病的臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集昆明市第三人民醫(yī)院2017 年10 月至2019 年10 月收治的100 例疑似結(jié)核性胸膜炎患者的胸水標(biāo)本進(jìn)行研究。其中男58 例，女42 例，年齡7～79 歲，平均（36.7±5.4） 歲。本研究通過(guò)了昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有診斷均按照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS288-2017）[12]。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器：美國(guó)貝克曼全自動(dòng)生化分析儀AU680，美國(guó)伯樂(lè)熒光定量PCR 儀CFX96，美國(guó)全自動(dòng)結(jié)核菌培養(yǎng)鑒定及藥敏分析儀BD960。主要試劑：ADA 腺苷脫氧酶檢測(cè)試劑盒（美康生物科技有限公司H014T1），結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司0A-052），結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)管（美國(guó)BD 公司L000041JAA）。

1.3 操作方法

將收集到的疑似結(jié)核性胸膜炎患者胸水標(biāo)本，在2～8℃環(huán)境下及時(shí)送到昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行以下檢測(cè)：

1.3.1 ADA 檢測(cè) 取3～5 mL 胸水標(biāo)本后及時(shí)分離，樣本稀釋后在室溫下4 000 r/min 離心10 min，使用寧波美康試劑盒于奧林巴斯AU680 進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)并讀取結(jié)果。

1.3.2 TB-DNA 檢測(cè) 取1 mL 胸水置1.5 mL 離心管中，離心機(jī)12 000 r/min 離心5 min，棄上清；沉淀加無(wú)菌生理鹽水1 mL 打勻，12 000 r/min 離心5 min；重復(fù)2 次。金屬浴10 min（誤差不超過(guò)1 min）。12 000 r/min 離心5 min 后上機(jī)并報(bào)告結(jié)果。

1.3.3 BACTEC MGIT 960 檢測(cè)（金標(biāo)準(zhǔn)法）取5～10 mL 胸水于刻度離心管，4 600 r/min 離心15 min，棄上清，加滅菌PBS 緩沖液2～3 mL 混勻，4 600 r/min 離心10 min，棄上清，再加滅菌PBS 緩沖液2 mL，充分混勻。最后向培養(yǎng)管中加入0.8 mL 營(yíng)養(yǎng)添加劑/雜菌抑制劑混合物，用移液器取0.5 mL 處理后的標(biāo)本液加入MGIT 培養(yǎng)管內(nèi)，儀器自動(dòng)培養(yǎng)并報(bào)告結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用率（%） 表示，組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)法及其它檢測(cè)結(jié)果差異比較

BACTEC MGIT 960 檢測(cè)法由于靈敏度和特異高而作為檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，其結(jié)果陽(yáng)性率為20%。ADA、TB-DNA 及BACTEC MGIT 960 快速聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率為77%，其它檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率ADA+TB-DNA 為57%，ADA+BACTEC MGIT 960為52%；聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率顯著高于金標(biāo)準(zhǔn)法及其它檢測(cè)（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1 聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)法及其它檢測(cè)結(jié)果比較Tab.1 Comparison of the results in combined test with the gold standard method and other tests

圖1 聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)法及其它檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果差異比較Fig.1 Comparison of positive results in combined test with the gold standard method and other tests

2.2 聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)法及其它檢測(cè)診斷效能對(duì)比

ADA、TB-DNA 及BACTEC MGIT 960 快速聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果敏感度為88.9%、特異度為92.8%，AUC 為0.95；BACTEC MGIT 960 金標(biāo)準(zhǔn)法檢測(cè)結(jié)果敏感度為90.9%，特異度為97.6%，AUC 為0.83；其它檢測(cè)結(jié)果敏感度和特異度分別為ADA+TB-DNA 87.9%、90.4%，ADA+BACTEC MGIT 960 88.7%、93.0%；AUC 分別為0.82 和0.87，聯(lián)合檢測(cè)診斷效能均高于金標(biāo)準(zhǔn)法和其它檢測(cè)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)法及其它檢測(cè)診斷效能對(duì)比Tab.2 Comparison of diagnostic efficacy of combined detection with gold standard method and other tests

圖2 各檢測(cè)法診斷效能對(duì)比Fig.2 Comparison of diagnostic efficiency of various detection methods

3 討論

結(jié)核病是人體感染結(jié)核分枝桿菌后，由于感染者抵抗力降低而導(dǎo)致的一種慢性傳染病，可累及肺、腎、腸和胸膜等器官。菌陽(yáng)患者為最主要的傳染源[13-14]。該病有感染率高、耐藥性強(qiáng)、疫情難以遞減的特點(diǎn)，因此給患者及家庭帶來(lái)嚴(yán)重的生活負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)[15]，全球大約有1/3 的人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，感染后可因患者抵抗力和結(jié)核桿菌數(shù)量的改變可發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核，進(jìn)而成為新的傳染源[16-17]。結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室快速診斷是結(jié)核防控的重點(diǎn)措施之一。結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)目前普遍認(rèn)為是樣本中檢出結(jié)核桿菌。但由于培養(yǎng)有周期長(zhǎng)、陽(yáng)性檢出率低的缺點(diǎn)。因此，尋找結(jié)核病的快速診斷檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病的臨床診治至關(guān)重要。

腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA） 廣泛存在于人體組織及各種細(xì)胞中。近年來(lái)，作為一種臨床常用的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，胸水ADA 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)在診斷結(jié)核性胸膜炎中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)在其他患者如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和膿胸患者中，ADA 的水平也可上升[18]。此外，由于年齡段的不同，胸水ADA 檢測(cè)的陽(yáng)性閾值也有明顯的差別[19]。在筆者實(shí)驗(yàn)室一般以ADA＞35 U/L 為判定的臨界值。但在不同年齡段的疑似肺結(jié)核患者中，胸水ADA的陽(yáng)性判定值也不同，并且其檢測(cè)值升高也可發(fā)生在非結(jié)核的患者中[20]。因此，本研究結(jié)果表明，若用胸水ADA 對(duì)疑似結(jié)核病患者進(jìn)行單一檢測(cè)，則結(jié)果陽(yáng)性率較低，應(yīng)用聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高檢測(cè)陽(yáng)性率。同時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)與單一ADA 金標(biāo)準(zhǔn)法檢測(cè)相比其對(duì)疑似結(jié)核病診斷效能有顯著的提高。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，TB-DNA 檢測(cè)的技術(shù)作為診斷結(jié)核病常用的方法之一也得到了快速的發(fā)展。目前，筆者對(duì)疑似患者胸水標(biāo)本進(jìn)行TB-DNA 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率與ADA 結(jié)果無(wú)顯著差異。在本研究中ADA 陽(yáng)性組仍有少數(shù)患者TB-DNA 結(jié)果為陰性，可能與患者免疫功能不全或使用免疫抑制劑，以及使用抗結(jié)核藥物等因素有關(guān)[21]。

BACTEC MIGT 960 是一種集結(jié)核桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏于一體的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。與MIGT 快速液體培養(yǎng)管搭配使用，即可實(shí)現(xiàn)結(jié)核桿菌的鑒定。BACTEC MGIT 960 可對(duì)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)，但是單純用一種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率并不能達(dá)到理想的狀態(tài)[22]。在本研究中，筆者通過(guò) BACTEC MGIT 960 與 ADA、TB-DNA 及BACTEC MGIT 960 快速聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，雖然BACTE CMGIT 960 檢測(cè)結(jié)果其陽(yáng)性率和診斷效能不及聯(lián)合檢測(cè)，但不可否認(rèn)的是BACTEC MGIT 960 作為較先進(jìn)的自動(dòng)化結(jié)核桿菌藥敏檢測(cè)系統(tǒng)，其可以檢出微量的結(jié)核分支桿菌，為結(jié)核病的耐藥方面提供臨床價(jià)值。

綜上所述，本研究運(yùn)用了三種聯(lián)合方法對(duì)疑似結(jié)核性胸膜炎患者胸水進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在疑似結(jié)核性胸膜炎的實(shí)驗(yàn)室診斷中，ADA、TB-DNA 及BACTEC MGIT 960 快速聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果陽(yáng)性率和診斷效能均顯著高于金標(biāo)準(zhǔn)法和其它檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，臨床診斷價(jià)值最高，值得在臨床多加推廣與應(yīng)用。