王 松 龔禹瑞 袁亞男 尚靜靜 張樹竹 陳本佳 秦世雯

(云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院/云南省多年生稻工程技術(shù)研究中心 云南昆明650500)

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是芽孢桿菌屬的一個新種，屬于革蘭氏陽性菌，存在于土壤、水體、動植物體內(nèi)［1］。近年來，國內(nèi)外研究人員相繼分離到不同的B.velezensis菌株，發(fā)現(xiàn)其在促進植物生長、拮抗病原菌及食品發(fā)酵等方面發(fā)揮良好作用，且對環(huán)境友好、易于人工培養(yǎng)，在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)保、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的理論和應(yīng)用研究價值［2-5］。獲得高質(zhì)量總RNA 是進行RT-PCR、qRT-PCR、cDNA 文庫構(gòu)建、Northern 雜交、轉(zhuǎn)錄組和翻譯組測序等研究的基礎(chǔ)［6-8］。因此，高效、簡便的B.velezensis總RNA提取方法對該菌的深入研究和利用至關(guān)重要。

目前常見的細菌總RNA 提取方法有CTAB 法、強變性劑法、SDS-Phenol法及熱硼酸法等［7，9］，這些方法各有優(yōu)缺點，并根據(jù)菌體特性適用于不同細菌類型。有效的細胞裂解是提取高產(chǎn)量細菌總RNA 的關(guān)鍵步驟。目前細菌細胞壁破碎的方法有酶解法、玻璃珠法和超聲波法［10-11］。相對于真核生物，細菌的RNA含量少，半衰期短，易降解；內(nèi)外環(huán)境以及操作體系無處不在的RNA 酶（RNase）會導(dǎo)致細菌總RNA提取效果不理想［7］。此外，破碎的細胞內(nèi)含物常與RNA 形成難溶的物質(zhì)，導(dǎo)致RNA 難以分離。而國內(nèi)關(guān)于高質(zhì)量總RNA提取研究多集中于真核生物，尚缺乏高效、簡便和經(jīng)濟的細菌高質(zhì)量總RNA提取方法。

Trizol 法能夠快速高效分離不同的生物來源樣品的總RNA，所提取的總RNA 濃度和純度高，不需要超速離心或多步酚—氯仿進行抽提［7］。然而，常規(guī)Trizol 法不能夠有效裂解細菌細胞壁，且對RNase 的抑制效果并不理想，無法獲得高質(zhì)量的細菌總RNA［9］。因此，針對B.velezensis分泌蛋白量大且種類多、細胞壁厚等特點，本研究通過優(yōu)化菌體培養(yǎng)條件、洗滌菌體次數(shù)、溶菌酶裂解細胞、液氮冷凍處理等方法，對傳統(tǒng)Trizol法進行改良，獲得了高質(zhì)量的B.velezensis總RNA，為該菌的分子生物學(xué)研究提供了一種高效、簡便和經(jīng)濟的總RNA提取技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

B.velezensis YQ1菌株由云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室分離鑒定并于-80℃中保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

Trizol 試劑（Invitrogen，美國），0.1% DEPC水，溶菌酶（200 mg/mL）（Solarbio，北京），D 2 000 DNA Marker（天根，北京），RibopureTMBacteria kit（Invitrogen，美國），臺式高速冷凍離心機（Thermofisher，美國）等。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)Trizol法

（1）菌體培養(yǎng)及收集：將保存于-80℃的B.velezensis YQ1 菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，30℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h。①固體培養(yǎng)條件菌體培養(yǎng)與收集：用接種環(huán)蘸取上述活化菌液在LB 固體培養(yǎng)基上劃線，30℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h 后，取50 mg 菌體至1.5 mL 離心管中。②液體培養(yǎng)條件菌體培養(yǎng)與收集培養(yǎng)：將1 mL上述活化菌液加入200 mL LB 培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)，待OD600值達到1.0，8 000 g，4℃離心5 min，棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。

（2）總RNA 提取步驟：①往上述離心管加入0.75 mL Trizol 試劑，移液器吸打混勻菌體，以最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩3～5 min；②室溫孵育5～10 min。加入0.2 mL 氯仿，上下顛倒混勻，室溫孵育2～3 min；③4℃、12 000 g 離心10 min；④吸取上清，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，置于20℃中冰凍10 min；⑤4℃、12 000 g 離心10 min；棄上清，加1 mL 75%乙醇，溫和振蕩5～10 s；⑥4℃、7 500 g 離心5 min；⑦棄上清，超級工作臺中晾置5～10 min 至乙醇完全揮發(fā)；⑧加入30～50 μL DEPC水溶解，獲得的總RNA于-80℃冰箱保存。

1.2.2 Trizol改良法

（1）菌體培養(yǎng)條件優(yōu)化：①固體培養(yǎng)條件下菌體培養(yǎng)時間優(yōu)化：將活化菌液劃線至LB固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)24、36和48 h，分別取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。②液體培養(yǎng)條件下菌液OD600值優(yōu)化：1 mL 活化的菌體加入200 mL LB 培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.5、1.0、1.5 和2.0 時，8 000 g，4℃離心5 min，棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL 離心管中。

（2）菌體DEPC 水處理：用25 mL 0.1%DEPC 水洗滌菌體，洗滌次數(shù)分別設(shè)置為1、2、3、4 次，充分混勻菌體后，4℃，8 000 g離心5 min，棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。

（3）溶菌酶處理：向最適DEPC 水處理后的菌體中加1 mL DEPC 水，混勻后分別加入20、30、40 μL 的溶菌酶，37℃靜置30 min，4℃、10 000 g 離心1 min，收集菌體。

（4）液氮處理：將最適溶菌酶處理后的菌體置于1.5 mL離心管中，液氮冷凍2～3 min，未進行液氮處理的菌體設(shè)置為對照。加入Trizol 試劑前將上述離心管取出后置于冰上融化。

（5）總RNA 的提?。嚎俁NA 提取步驟同上述常規(guī)Trizol法總RNA提取步驟。

1.2.3 改良Trizol法與試劑盒法的比較

RibopureTMBacteria Kit 試劑盒總RNA 提 取 方法如下：取1 mL 菌液（OD600為1.0），將250 μL 氧化鋯珠滴入0.5 mL 的螺旋蓋中；離心收集樣品，加入350 μL RNAWTZ，渦旋振蕩均勻，將RNAWTZ中的細胞轉(zhuǎn)移到250 μL 的氧化鋯珠，擰緊蓋子，渦旋器中最大轉(zhuǎn)速振蕩10 min，充分溶解；4℃，14 000 g離心5 min；溶菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL 離心管，加入0.2 倍體積的氯仿，混勻，室溫孵育10 min；4℃、14 000 g 離心5 min；水相轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管，加0.5倍體積的無水乙醇，完全混合，將濾器放入2 mL 的收集管，將樣品轉(zhuǎn)移到濾器中；4℃、14 000 g 離心1 min；棄濾筒，濾器轉(zhuǎn)入新的 濾 筒，加700 μL Wash Solution 1；4℃、14 000 g 離心1 min；丟棄濾筒，過濾器放入收集管，加500 μL Wash Solution 2/3；4℃、14 000 g離心1 min；棄濾筒，過濾器放入收集管，重復(fù)上述步驟一次；4℃、14 000 g 離心1 min，轉(zhuǎn)移到2 mL的收集管；將預(yù)熱至95℃的25～50 μL洗脫液加到濾池中心；4℃、14 000 g 離心1 min；重復(fù)上述兩步一次，獲得的總RNA于-80℃冰箱保存。

1.2.4 總RNA質(zhì)量及完整性檢測

（1）1%瓊脂糖凝膠電泳檢測：取總RNA 樣品4～5 μL，于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。200 V恒壓，16 min。凝膠成像儀上觀察條帶，并記錄結(jié)果。

（2）RNA 純度和濃度檢測：取2 μL 總RNA 樣品，用超微量紫外分光光度計（Thermofisher，美國）分別檢測A260/A280、A260/A230及濃度（ng/μL）?？俁NA 的A260/A280值為2.0 且A260/A230值 為2.0～2.5時為高純度總RNA。

（3）cDNA 的合成和擴增質(zhì)量鑒定：利用RTPCR 法對Trizol 改良法提取的總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄擴增質(zhì)量鑒定，以常規(guī)法提取的總RNA作為對照。根據(jù)Takara AMV （V 3.0） Reverse Transcriptase（Takara，大連）的說明進行cDNA 第一鏈的合成和RT-PCR 擴增。RT-PCR 擴增片段為B.velezensis16S rRNA片段，所用引物為（F：5’-CTTCGGGTGTTACAAACTCTCG-3’；R：5’-TAAGCCAATCCCACAAATCTG-3’），利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)Trizol法提取

如圖1 所示， 常規(guī)Trizol 法提取的B.velezensis總RNA 存在明顯的降解，且A260/A280和A260/A230值均小于2.0（表1），說明有雜質(zhì)污染。推測培養(yǎng)基殘留，B.velezensis培養(yǎng)過程中分泌物多，菌體細胞壁未完全破裂，造成常規(guī)Trizol 法無法提取到該菌完整的總RNA。

表1 常規(guī)Trizol法提取Bacillus velezensis總RNA的濃度和質(zhì)量

2.2 Trizol改良法提取

2.2.1B.velezensis培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在進行菌體培養(yǎng)時，若B.velezensis生長對數(shù)期之前收集菌體，菌體量少；而進入對數(shù)生長期后，B.velezensis分泌大量的胞外酶（包括RNase），嚴重影響總RNA提取質(zhì)量。為明確菌體培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)時間對B.velezensis總RNA 提取的影響，分別取LB 固體和液體培養(yǎng)基條件下不同培養(yǎng)時間的菌體進行總RNA提取。如圖2和表2所示，在LB固體培養(yǎng)基條件下，24 h的總RNA濃度和純度相對較高，說明在LB 固體培養(yǎng)基條件下，應(yīng)盡量選取24 h（對數(shù)生長早期）的菌體進行總RNA 抽提。但24、36、48 h 總RNA 均有不同程度的降解，且A260/A280和A260/A230值均小于2.0（表2），說明有蛋白、酚類、多糖等雜質(zhì)污染。

表2 LB固體培養(yǎng)基條件下不同培養(yǎng)時間B.velezensis總RNA的濃度和質(zhì)量

如圖3 所示，在LB 液體培養(yǎng)基條件下當菌體OD600值為1.0 和1.5 時能夠提取質(zhì)量較高的總RNA，但存在降解，且A260/A280和A260/A230值均小于2.0（表3），說明有蛋白、酚類、多糖等雜質(zhì)污染；而OD600值為0.5 和2.0 時總RNA 嚴重降解。說明在LB 液體培養(yǎng)基條件下，菌體培養(yǎng)至OD600值為1.0～1.5 時是最佳的總RNA提取時間。

2.2.2 不同洗滌次數(shù)預(yù)處理對B.velezensis總RNA提取的影響

表3 LB液體培養(yǎng)基條件下不同B.velezensis菌體OD600值的總RNA濃度和質(zhì)量

收集菌體時，殘留的培養(yǎng)基和菌體分泌物等對總RNA提取存在嚴重影響，因此本研究采用DEPC水洗滌菌體的方法來減少雜質(zhì)和RNase影響。為明確洗滌次數(shù)對減少雜質(zhì)和菌體分泌物的效果，分別對LB 液體培養(yǎng)基條件下收集的菌體（OD600值為1.0）進行1、2、3、4次洗滌。如圖4和表4所示，洗滌2 次的B.velezensis總RNA 質(zhì)量較高，但均存在一定程度的降解。另外，DEPC 水洗滌處理后，總RNA濃度較低，不利于后續(xù)進行RNA純化處理。

表4 DEPC水洗滌處理后B.velezensis 總RNA的濃度和質(zhì)量

2.2.3 溶菌酶處理對B.velezensis總RNA提取的影響

為提高B.velezensis總RNA 提取量，需完全裂解菌體細胞壁，釋放核酸。本研究將上述DEPC水洗滌2次后的菌體，分別用20 μL（20 mg）、30 μL（30 mg）、40 μL（40 mg）溶菌酶處理菌體。如圖5和表5 所示，溶菌酶處理后，總RNA 濃度得到了明顯提高，30 μL（30 mg）溶菌酶處理后提取的總RNA質(zhì)量和濃度最高，但仍存在一定程度降解（表5）。說 明30 μL（30 mg） 溶 菌 酶 能 夠 完 全 裂 解B.velezensis（OD600值為1.0）細胞壁，保證高濃度的總RNA提取量。

表5 溶菌酶處理后B.velezensis總RNA濃度和質(zhì)量

2.2.4 液氮冷凍處理菌體對B.velezensis總RNA 提取的影響

通過DEPC 水洗滌和溶菌酶處理后，提取的總RNA仍存在降解情況，說明B.velezensis體內(nèi)或提取過程中仍有RNAase 的影響。為抑制RNAase 活性，本研究對上述30 μL（30 mg）溶菌酶處理的菌體進行液氮冷凍。如圖6 所示，提取菌體的總RNA可以清晰的看到23S、16S 和5S 條帶。相較于未進行液氮處理的樣品，液氮處理后提取的總RNA降解程度少，并且濃度和純度高（表6），說明液氮處理能夠有效降低B.velezensis內(nèi)源性和提取過程中RNAase活性。

2.3 Trizol改良法和試劑盒法比較

表6 液氮冷凍處理提取B.velezensis總RNA的質(zhì)量和濃度比較

由以上結(jié)果確定了B.velezensis總RNA Trizol改良法。為比較其與試劑盒法提取的總RNA效果，選取革蘭氏陽性菌總RNA提取試劑盒RibopureTMBacteria Kit。如圖7 所示，2 種方法均能獲得完整和高純度的總RNA，而Trizol法改良法提取的總RNA濃度更高，但相對于試劑盒法提取時間較長（表7）。另外，試劑盒法提取的單個樣本總RNA價格比Trizol 改良法昂貴。因此Trizol 改良法適用于B.velezensis大批量樣本的總RNA 提取，而試劑盒法適用于小批量樣本的總RNA快速提取。

2.4 RT-PCR擴增檢測

表7 Trizol改良法和試劑盒法提取的B.velezensis總RNA濃度和質(zhì)量

以Trizol 常規(guī)法和改良法所提取的總RNA 為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。隨后以其為模板，利用B.velezensis16S rRNA的熒光定量PCR引物進行PCR擴增。結(jié)果表明，Trizol常規(guī)法提取的總RNA 無法擴增出16S rRNA 片段，而Trizol 改良法提取的總RNA 能夠擴增出明顯的16S rRNA 片段，且片段大小與預(yù)期相符（163 bp），說明Trizol 改良法提取的總RNA能夠滿足RT-PCR要求。

3 討論與結(jié)論

B.velezensis不僅具有富含肽聚糖的細胞壁，還具有強大的胞外酶分泌系統(tǒng)，同時易產(chǎn)生內(nèi)源性RNase，這些特點加大了其總RNA提取難度［10-11］。貝萊斯芽孢桿菌在對數(shù)生長早期，細胞分裂旺盛，胞內(nèi)活動主要以細胞分裂相關(guān)為主，細胞壁積累較少，分泌物較少，易于破碎細胞并獲得高質(zhì)量的總RNA。由于常規(guī)Trizol 法無法提取到B.velezensis完整的總RNA，因此，本研究比較了不同培養(yǎng)條件下，不同生長時期對B.velezensis總RNA提取的影響，結(jié)果表明，LB液體培養(yǎng)條件下的B.velezensis總RNA 提取質(zhì) 量 較好，且OD600值 為1.0～1.5 是最佳提取時期。針對B.velezensis具有較強的胞外酶分泌系統(tǒng)特性，本研究通過DEPC水洗滌處理，在一定程度上減少了分泌物和殘留培養(yǎng)基的影響，與枯草芽孢桿菌總RNA提取方法的研究結(jié)果相符［12］。本研究通過加入適量溶菌酶裂解菌體，提高了總RNA濃度，但該方法并不適用于糞腸球菌和金黃色葡萄球菌［13-14］，推測溶菌酶對不同革蘭氏陽性菌的裂解效率存在差異。另外，本研究通過對菌體液氮冷凍處理后發(fā)現(xiàn)，液氮能夠抑制菌體破裂后的RNAase 活性，防止總RNA 在提取過程中的降解［10］。本研究還比較了Trizol 改良法與試劑盒提取B.velezensis總RNA 濃度效果，結(jié)果表明Trizol 改良法更加適合于大批量B.velezensis總RNA提取。

本研究提供了一種簡便有效的B.velezensis總RNA 提取方法，為滿足B.velezensis相關(guān)分子生物學(xué)研究提供了重要的技術(shù)支撐。