王曉薇，樊 毅，馬小明，馬麗娜，岳彩娟，王 錦，趙正偉，馬 青，*

(1.寧夏農(nóng)林科學院 動物科學研究所，寧夏 銀川 750000； 2.銀川中科元昊科技有限公司，寧夏 銀川 750000)

灘羊是我國珍稀的肉裘兼用地方綿羊良種，主要分布在寧夏，輻射甘肅、陜西、內(nèi)蒙等狹窄生態(tài)區(qū)的干旱半荒漠地區(qū)[1]，其肉質(zhì)細嫩鮮美、無膻腥味，所產(chǎn)的二毛裘皮是寧夏特產(chǎn)毛皮，因毛穗柔軟潔白、輕暖美觀，在國內(nèi)外享有盛譽。毛色是動物品種的重要表型特征之一，是灘羊重要的經(jīng)濟性狀。灘羊體軀多為白色，頭部以黑、黃、褐斑為主，少數(shù)純白，極少純黑色等[1]，較之雜色，純白色更受消費者的青睞。研究表明，與動物毛色相關的基因和位點多達378個[2]，這些基因功能多是調(diào)控黑色素的生成。黑色素皮質(zhì)受體-1基因(MC1R)是控制毛色的重要候選基因之一，近年來國內(nèi)外學者對MC1R基因研究較多，但大多關注基因多態(tài)性與毛色表型的研究，對該基因表達量與毛色表型的研究較少，有關灘羊MC1R基因的研究更是鮮有報道。

為了探究影響哺乳動物毛色的MC1R基因和TCF25基因與灘羊毛色的關系，培育更加具有裘皮商業(yè)價值的灘羊，提高寧夏灘羊裘皮的市場競爭力，前期已經(jīng)開展了對灘羊毛色候選基因篩選的研究?；诓煌珵┭?白色、褐斑、黑斑)群體的SNP 600K芯片分型數(shù)據(jù)，借助遺傳分化系數(shù)FST法進行群體間選擇信號檢測分析，應用生物信息學方法分析篩選到與灘羊毛色形成相關的候選基因MC1R和TCF25。本研究采用qRT-PCR技術對灘羊MC1R基因和TCF25基因mRNA在不同毛色灘羊(純白、褐斑、黑斑)皮膚組織中的表達量進行檢測，以驗證目的基因與灘羊毛色的關系，旨在為灘羊毛色形成機制提供相關理論，為灘羊毛色選育與品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和材料

1.1.1 試驗動物

本試驗所用的15只灘羊均來自寧夏鹽池灘羊場的純種灘羊。根據(jù)毛色的不同將灘羊分為3組，每組選取5只，分別是全身白毛(簡稱全白)，身體全白、頭部黑色或帶部分黑色斑點(簡稱黑斑)，身體全白、頭部帶褐色或黃色斑點(簡稱褐斑)。用取皮器在頭部帶色部位取皮膚組織2 cm2，迅速裝入無酶凍存管并放入液氮罐中，帶回實驗室于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 引物設計與合成

依據(jù)NCBI基因庫公布的綿羊MC1R(登錄號：DQ530057.1)和TCF25(登錄號：XM_027977786.1)以及GADPH(登錄號：HM043737.1)的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件為目的基因(MC1R、TCF25)和內(nèi)參基因(GADPH)各設計一對引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

Trizol(TaKaRa公司)，RT-PCR試劑盒(VAZYME公司)，DEPC(美國Sigma公司)，RNasin(美國Promega公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(YEASEN公司)等。

1.2.2 主要儀器

表1 灘羊MC1R、TCF25、GADPH基因引物序列

超速冷凍離心機、NanoPhotometer-N60(IMPLEN，德國)，Real-time PCR擴增儀(Bio-Rad，美國)，水平電泳槽(Bio-Rad，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同毛色灘羊皮膚組織總RNA的提取與cDNA的合成

取液氮保存的皮膚組織約100 mg用Trizol法提取總RNA。分別吸取1 μL總RNA溶液，使用NanoPhotometer-N60超微量分光光度計測定D260/D280、D260/D230，將所提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。將測定好的總RNA溶液分別稀釋定量至50 ng·μL-1，迅速分裝并置于超低溫冰箱中(-80 ℃)保存。參照YEASEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit RNA PCR Kit)說明書，對所提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實時熒光定量PCR反應

本研究采用Bio-Rad Themal Cycler熒光定量PCR儀(C-1000 Touch)進行熒光定量PCR實驗，擴增反應總體系為20 μL，其中Q711 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，PCR Forward Primer(10.0 μmol·L-1)1.0 μL，PCR Reverse Primer(10.0 μmol·L-1)1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。擴增程序：預變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 10 s，退火58.7 ℃ 30 s，39個循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s，每個樣重復3次。在收集熒光信號的過程中，通過熔解曲線分析引物擴增的特異性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

目的基因相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt-對照組ΔCt的平均值，表達量以平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)經(jīng)過Microsoft Excel整理后利用SAS8.2進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取結果分析

提取的總RNA通過NanoPhotometer-N60超微量分光光度計檢測，結果顯示，RNA濃度在200～600 ng·μL-1，D260/D280均在1.8～2.0，D260/D230值大于2.0，說明所提取的RNA濃度、純度較高。此外，提取的總RNA利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖1所示，RNA的3條帶清晰可見，分別為28S、18S、5S，無明顯降解，說明提取的RNA樣品完整、質(zhì)量較好、濃度高且無污染，符合要求，可進行后續(xù)試驗。

2.2 不同毛色灘羊MC1R基因在皮膚組織表達差異

本研究采集的灘羊皮膚組織均來自飼養(yǎng)方式相同的同一養(yǎng)殖場內(nèi)，通過實時熒光定量PCR反應，都以GADPH作為內(nèi)參基因。MC1R基因在不同組織中的表達量如圖2所示，可見MC1R基因在3種不同毛色灘羊皮膚組織中均有表達，表達量由大到小依次為黑斑>褐斑>全白。MC1R基因在黑斑灘羊皮膚組織中的表達量極顯著高于于純白色灘羊(P<0.01)，顯著高于褐斑灘羊(P<0.05)，褐斑灘羊皮膚組織中的表達量與純白灘羊皮膚組織表達量相比差異不顯著(P>0.05)。MC1R基因在黑斑灘羊皮膚組織中的表達量最高，為22.32±4.67；其次是褐斑灘羊，為9.69±2.27；最低的是純白色灘羊，為7.14±1.45。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.1 The results of agarose gel electrophoresis of total RNA

*和**分別表示差異達顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。* and ** indicated significant differences at the level of 0.05 and 0.01， respectively.圖2 MC1R mRNA在不同毛色灘羊皮膚組織中的定量表達Fig.2 The expression level of MC1R mRNA in skin of Tan sheep with different coat color

2.3 不同毛色灘羊TCF25基因在皮膚組織表達差異

TCF25基因在不同組織中的表達量如圖3所示，TCF25基因在3種不同毛色灘羊皮膚組織中均有表達，其中表達量最高的純白色灘羊組，表達量為1.68±0.47；其次為褐斑組，表達量為1.32±0.21；最低的是黑斑組，表達量為0.99±0.15。3組間差異均不顯著(P>0.05)。

圖3 TCF25 mRNA在不同毛色灘羊皮膚組織中的定量表達Fig.3 The expression level of TCF25 mRNA in skin of Tan sheep with different coat color

3 討論

MC1R基因是G蛋白耦合受體—黑色素皮質(zhì)激素受體家族成員之一，在機體中有多種效用，可與α-促黑素(α-melanocyte stimulating hormone， α-MSH)、腎上腺皮質(zhì)激素(adreno cortico hormones，ACTH)結合，使細胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶活化，三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化為環(huán)腺苷酸(cAMP)，cAMP激活酪氨酸激酶，酪氨酸激酶激活酪氨酸，進而影響真黑素和褐黑素的產(chǎn)生。當黑色素細胞中活化的酪氨酸過量，細胞合成真黑素；當活化的酪氨酸含量較少，細胞合成褐黑素[3-6]。

有研究報道，哺乳動物MC1R基因主要在毛囊和皮膚黑色素細胞中表達[7]。王樂等[8]在哺乳動物中研究發(fā)現(xiàn)，MC1R基因表達量在毛囊和皮膚黑色素細胞中最高，與毛色和膚色色素沉積密切相關。MC1R基因的高表達有利于黑色素細胞中真黑素的形成，細胞中真黑素的含量較高就會使動物表現(xiàn)黑或褐的毛色表型[9]。高澤成[10]對MC1R基因在不同顏色牦牛皮膚組織中的表達量進行研究，結果顯示，MC1R基因在純黑色大通牦牛皮膚組織中的表達量極顯著高于純白色天祝白牦牛，是天祝白牦牛的2.4倍(P<0.01)。任玉紅等[11]利用RT-PCR技術在對不同毛色羊駝個體皮膚組織中MC1R基因的表達量研究中發(fā)現(xiàn)棕色被毛個體該基因表達量是白色被毛的4.32倍，差異極顯著(P<0.01)。景炅婕等[12]對MC1R基因在不同毛色(純黑、純白、黃褐和黑斑白)太行山羊皮膚中表達量進行比較的研究中發(fā)現(xiàn)：MC1R基因在純黑個體中表達量最高，在黃褐色個體中表達量次之，純白色較低。大量的研究證明，MC1R基因與羊的毛色性狀有關，本研究結果顯示，MC1R基因在黑斑灘羊皮膚組織中的表達量最高(22.32±4.67)，極顯著高于純白色灘羊(P<0.01)，顯著高于褐斑灘羊(P<0.05)，這與MC1R基因高表達會使動物產(chǎn)生深色毛發(fā)的結果相一致，與高澤成[10]、任玉紅等[11]、景炅婕等[12]在不同毛色動物皮膚組織中MC1R基因mRNA表達量深色大于淺色的研究結果相符。同時也證明了MC1R基因與寧夏鹽池灘羊的毛色性狀相關。

TCF25基因是胚胎發(fā)育中十分重要的轉(zhuǎn)錄因子[13]，屬于基本—螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)結構。近年來有關TCF25基因的研究不多，幾乎都集中在醫(yī)學領域，與毛色相關的報道就更為鮮見。Li等[14]利用隨機森林法在對42只綿羊(18只黑色，24只白色)進行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)有86%的黑色羊在位點s26449處發(fā)生堿基突變，而此位點距離TCF25基因419 bp，這表明TCF25基因與毛色存在潛在關聯(lián)。Kim等[15]對3種韓牛群體(濟州黑牛、斑紋韓牛、棕色韓牛)進行基因組選擇信號檢測，利用群體分化分析(FST法)檢測斑紋牛基因組中的受選擇區(qū)域，定位候選基因MC1R和TCF25。Hysi等[16-17]在人類發(fā)色研究中，對數(shù)萬個歐洲人的幾類頭發(fā)顏色(金色、紅色、淺棕、深棕、黑色)進行全基因組關聯(lián)分析，定位到多個影響發(fā)色的候選基因中就包括TCF25基因。本研究發(fā)現(xiàn)，TCF25基因在不同毛色灘羊皮膚組織中均有表達，但表達量差異不顯著?？赡苁怯捎跇颖竞枯^小和統(tǒng)計分析誤差所致。其中，純白色灘羊皮膚組織中表達量最高，褐斑組次之，在黑斑皮膚組織中表達量較低。

4 結論

試驗表明，MC1R與TCF25基因在灘羊不同毛色皮膚組織中均有表達，且MC1R基因的mRNA表達量組間具有顯著性差異，其中頭部黑斑個體表達量最高，褐斑灘羊次之，純白色灘羊最低，TCF25基因mRNA表達量在3組毛色灘羊之間有差異但差異不顯著(P>0.05)。這驗證了目的基因與灘羊毛色間的關系，證實了MC1R基因表達量對黑色素顆粒的形成起著重要的調(diào)控作用，其高表達有利于真黑素形成進而使細胞中黑色素含量增高，表現(xiàn)出黑色或深色毛色的結論[9-10]，為今后灘羊毛色選育與品種改良提供參考。