劉坤舉，張小輝，*，龐有志，趙淑娟，祁艷霞，王乾昆

(1.河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003； 2. 洛陽市動物遺傳育種重點實驗室，河南 洛陽 471003)

羽色是家禽重要的質(zhì)量性狀，其遺傳效應是近年來研究的熱點。黑色素的數(shù)量、性質(zhì)與分布是導致家禽羽色多樣性的重要原因[1]。作為羽色形成的基本物質(zhì)，黑色素可分為真黑素和褐黑素。真黑素包括黑色和褐色，褐黑素包括黃色和紅色，2種黑色素之間的相互轉(zhuǎn)化影響羽色的形成[2]。影響黑色素形成的基因有很多，鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α亞基(guanine nucleotide-binding protein Gs subunit alpha，GNAS)是位于細胞膜內(nèi)側(cè)的一類信號傳導蛋白，參與細胞的多種生命活動[3]。在黑色素代謝通路中，GNAS與黑素皮質(zhì)素受體1(melanocortin receptor-1，MC1R)通過跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，ADCY)，催化ATP產(chǎn)生第二信使，影響細胞內(nèi)黑色素的合成[4]。

GNAS基因是影響烏骨雞黑色素沉積的候選基因，該基因位于20號染色體Fm區(qū)域的拷貝數(shù)重復區(qū)(copy number variations，CNVs)內(nèi)，與黑色素的沉積密切相關(guān)[5]。已有學者發(fā)現(xiàn)，GNAS基因突變可能會導致人類患黑色素瘤病[6-7]。綜上，GNAS基因可能與黑色素形成有關(guān)。

本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)探究栗羽和白羽朝鮮鵪鶉不同胚胎發(fā)育階段GNAS基因的mRNA相對表達量，并對GNAS基因單核苷酸多態(tài)位點(single nucleotide polymorphisms，SNPs)進行檢測，分析SNPs與朝鮮鵪鶉羽色性狀之間的關(guān)聯(lián)性，旨在為探究朝鮮鵪鶉及其他禽類羽色形成、變化等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

栗羽和白羽朝鮮鵪鶉受精蛋購自市場。取栗羽和白羽朝鮮鵪鶉受精蛋各60枚進行孵化，取孵化至6、8、10、12、14 d的鵪鶉胚胎翅尖組織置于液氮中保存，用于后續(xù)總RNA的提取；取栗羽和白羽朝鮮鵪鶉受精蛋各300枚，孵化至10 d，取胚胎翅尖組織置于液氮中保存，用于后續(xù)基因組DNA的提取。

1.2 主要試劑和儀器

Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒、總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pMD-19T質(zhì)粒載體、SYBR Green II RNA染料以及DL 2000 bp Maker均購置于北京索萊寶科技有限公司。

Nano Drop 2000C超微量分光光度計和冷凍高速離心機購于美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光定量PCR儀、梯度PCR儀、凝膠成像儀均購于美國BIO-RAD公司；水平電泳槽和垂直電泳槽購于北京六一生物科技有限公司。

1.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

分別取栗羽和白羽朝鮮鵪鶉不同胚胎時期的翅尖組織，將同羽色、同孵化期的3個樣品混合，用電動研磨器磨碎，采用Trizol法提取總RNA。取1.5 μL樣品滴于超微量分光光度計上檢測，合格后將樣品稀釋至500 ng·μL-1。取2 μL稀釋后RNA樣品混合1 μL 6×DNA Loading Buffer，進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA的質(zhì)量。

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。反應條件是：總RNA 3 μL、gDNA remover 1 μL、10×g DNA remover Buffer 1 μL，補RNase-free H2O至10 μL，42 ℃孵育2 min，60℃孵育5 min。第二步的合成體系及反應條件是：dNTP Mix 1μL、GoldenstarTMOligo(dT)171 μL、Randomer 1 μL、5×GoldenstarTMBuffer 4 μL、DTT 1 μL、GoldenstarTMRT6 1 μL、RNase-free H2O 2 μL，25 ℃孵育10 min，55 ℃孵育40 min，85 ℃孵育5 min，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。

1.4 基因組DNA提取與檢測

分別取栗羽和白羽朝鮮鵪鶉胚胎孵化至10 d時的翅尖組織，使用基因組DNA抽提試劑盒進行提取。取1.5 μL樣品滴在超微量分光光度計上檢測，取4 μL合格的DNA樣品混合1 μL 6×DNA Loading Buffer進行電泳，檢測基因組DNA的質(zhì)量。

1.5 GNAS基因mRNA表達檢測

采用克隆獲得的朝鮮鵪鶉GNAS基因序列設計引物mRNA序列信息，用Beacon Designer 8.0軟件設計引物，交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。反應體系為：2×TaqPlus Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，SYBR Green Ⅰ 1 μL，ddH2O 6.4 μL，cDNA模板1 μL。反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；延伸10 min；熔解曲線從65 ℃到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

1.6 GNAS基因CDS區(qū)克隆與分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫日本鵪鶉和原雞GNAS基因的保守序列設計2對引物(表2)。反應體系為：1.1×T3 Super PCR Mix 17.6 μL，上下游引物各0.7 μL，模板cDNA 1 μL。反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性15 s，退火15 s，72 ℃延伸15 s，36個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行膠回收，經(jīng)過膠回收的產(chǎn)物測序后運用SeqMan軟件對序列信息進行拼接獲得完整的CDS區(qū)序列?；厥蘸蟮漠a(chǎn)物連接到pMD-19T質(zhì)粒載體后，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細胞中，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃條件下培養(yǎng)8 h，藍白斑篩選后，選取陽性菌落進行PCR鑒定檢測，將鑒定為陽性的菌落送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果分別與NCBI的基因組進行BLAST分析，用ExPASy預測蛋白序列編碼氨基酸、等電點與分子質(zhì)量等。使用MEGA 7.0軟件對朝鮮鵪鶉進行生物種屬間比對，生成系統(tǒng)進化樹。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

表2 GNAS基因CDS區(qū)引物設計

1.7 朝鮮鵪鶉GNAS基因多態(tài)性檢測

1.7.1GNAS基因的不對稱PCR擴增

采用克隆獲得的朝鮮鵪鶉GNAS基因序列設計外顯子12部分引物，參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的日本鵪鶉GNAS基因序列信息設計3’非編碼區(qū)部分引物，用Primer 5.0軟件設計出2對引物，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成(表3)。

表3 朝鮮鵪鶉GNAS基因引物序列信息

采用不對稱PCR進行擴增，以提取的基因組DNA為模板，等濃度引物進行PCR擴增，擴增出目的片段的雙鏈，檢測產(chǎn)物質(zhì)量；再以PCR產(chǎn)物作為模板，利用其中的任意1條引物進行第2次PCR擴增，擴增出目的片段的單鏈。外顯子12部分片段的第1次PCR擴增反應體系為：基因組DNA 1 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 17.6 μL，上下游引物各0.7 μL；PCR擴增反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，得到目的條帶后進行第2次PCR擴增。第2次PCR擴增反應體系為：第1次PCR擴增產(chǎn)物1 μL，1.1×T3 Super PCR Mix18.3 μL，上游引物0.7 μL，反應條件同第1次PCR，循環(huán)數(shù)調(diào)整至20個。3′UTR部分擴增的反應體系和反應條件除退火溫度為59 ℃外，其他與外顯子12部分一致。

1.7.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳與分析

取1 μL SYBR Green II RNA染料加入1 mL滅菌雙蒸水中混合，再加入1 mL 6×Loading buffer緩沖液與其混勻，取5 μL上述工作液加入到20 μL電泳樣品中，94 ℃變性使兩者充分結(jié)合。取8 μL混合液，于常溫下濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，185 V電泳10 min后轉(zhuǎn)換為85 V繼續(xù)電泳8 h，結(jié)束后在凝膠成像儀上進行拍照保存。通過電泳結(jié)果對單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)分析，相同基因型對應個體各選取3份PCR擴增產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果使用DNAMAN軟件和Ensembl網(wǎng)站進行對比分析，以確定突變位點。根據(jù)基因型統(tǒng)計結(jié)果，計算基因型頻率、基因頻率和多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)，采用卡方檢驗檢測朝鮮鵪鶉群體是否處于Hardy-Weinberg平衡。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析

用2-ΔΔCt法計算相對表達量，運用SPSS 20.0進行樣本t檢驗，Graphpad Prism 8.0軟件作圖，用SPSS 20.0的χ2檢驗SNP位點與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性和群體Hardy-Weinberg平衡。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA和基因組DNA質(zhì)量檢測

經(jīng)超微量分光光度計檢測，提取的總RNA的濃度在2 000～3 500 ng·μL-1，A260/A280均在2.0左右，A260/A230均在2.2左右。1.2%瓊脂糖凝膠檢測如圖1，可清晰看到28S、18S、5S 3條帶，表明所提取的總RNA質(zhì)量良好。

1～5：RNA驗證結(jié)果。1-5：RNA verification results.圖1 總RNA凝膠成像Fig.1 Gel imaging of total RNA

對提取的基因組DNA檢測，A260/A280均在1.9左右，A260/A230均在2.2左右。0.8%瓊脂糖凝膠檢測如圖2，條帶清晰明亮且長度符合DNA要求，表明所提取的DNA質(zhì)量良好。

1～5：DNA驗證結(jié)果。1-5：DNA verification results.圖2 基因組DNA凝膠成像Fig.2 Gel imaging of genomic DNA

2.2 GNAS基因mRNA表達水平

朝鮮鵪鶉不同發(fā)育階段胚胎中GNAS基因mRNA相對表達水平見圖3。如圖所示，GNAS基因在朝鮮鵪鶉胚胎發(fā)育至6 d時的表達水平低于發(fā)育到8～14 d；當發(fā)育至8 d時，表達量達到最高；GNAS基因在栗羽鵪鶉胚胎組織中的表達水平整體高于白羽朝鮮鵪鶉，其中胚胎發(fā)育到8～14 d時，GNAS基因在栗羽鵪鶉胚胎組織中的表達水平極顯著(P<0.01)高于白羽鵪鶉。

**表示相同發(fā)育階段不同羽色鵪鶉胚胎間差異極顯著(P<0.01)。** means great significant difference(P<0.01) between different plumage color Korean quail embryos at same developmental stage.圖3 朝鮮鵪鶉不同發(fā)育階段胚胎中GNAS基因mRNA相對表達水平Fig.3 Relative expression of GNAS gene mRNA in different developmental stages of Korean quail embryos

2.3 GNAS基因CDS區(qū)克隆及序列分析

GNAS基因CDS區(qū)的PCR擴增結(jié)果如圖4所示，其片段大小分別為1 001、439 bp，產(chǎn)物條帶清晰，可以用于DNA測序分析。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，成功獲得GNAS基因CDS區(qū)完整序列(GenBank No. MT649634)，其中開放閱讀框(open reading frame，ORF)長1 140 bp。GNAS基因位于鵪鶉20號染色體上，有14個外顯子，編碼的蛋白含379個氨基酸，等電點6.43，分子質(zhì)量為44 399.47 Da，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)為54，帶負電荷氨基酸殘基數(shù)為56，GRAVY值為-0.593，該蛋白為穩(wěn)定親水性蛋白。

M：DNA marker 2 000；1～2：CDS區(qū)擴增產(chǎn)物。M: DNA marker 2 000；1-2: CDS region amplification products.圖4 朝鮮鵪鶉GNAS基因CDS區(qū)產(chǎn)物的電泳檢測Fig.4 Electrophoresis detection of PCR product of GNAS CDS in Korean quail

2.4 GNAS基因編碼蛋白的系統(tǒng)進化分析

由圖5可知，朝鮮鵪鶉GNAS基因編碼蛋白與日本鵪鶉和原雞同源性最高，表明GNAS基因在物種進化過程中保持了較高的保守性。

圖5 基于GNAS蛋白的朝鮮鵪鶉種屬間系統(tǒng)進化樹Fig.5 Interspecific phylogenetic tree of Korean quail based on the protein of GNAS

2.5 GNAS基因特定序列PCR擴增產(chǎn)物檢測

圖6為不同羽色朝鮮鵪鶉GNAS基因外顯子12和3′UTR的PCR擴增結(jié)果。外顯子12片段擴增長度254 bp，3′UTR的擴增產(chǎn)物長度為190 bp，產(chǎn)物條帶清晰且無雜帶，可以用于回收測序。

2.6 GNAS基因型分析

經(jīng)PCR-SSCP分析，GNAS基因外顯子12和3′UTR均有3種基因型(圖7)。圖中，左側(cè)是外顯子12基因型，右側(cè)為3′UTR基因型。

分別選取外顯子12和3′UTR的3種基因型個體PCR產(chǎn)物進行測序。如圖8所示，外顯子12區(qū)域和3′UTR區(qū)域均有1個突變位點，分別是g.119221T>A和g.121181A>G。

2.7 突變位點遺傳信息分析

如表4所示，朝鮮鵪鶉群體中GNAS基因的g.119221T>A的優(yōu)勢等位基因為B，優(yōu)勢等位基因頻率為0.75；g.121181A>G突變位點的優(yōu)勢等位基因是A，頻率為0.71。通過對朝鮮鵪鶉群體多態(tài)信息含量計算可知，GNAS基因的2個突變位點均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.250.05)。

1～4、9～12：栗羽鵪鶉PCR擴增產(chǎn)物；5～8、13～17：白羽鵪鶉PCR擴增產(chǎn)物；M：DNA marker 2 000。1-4， 9-12: PCR amplification products of maroon plumage quail; 5-8， 13-17: PCR amplification product of white plumage quail;M: DNA marker 2 000.圖6 朝鮮鵪鶉GNAS基因外顯子12和3′UTR PCR產(chǎn)物電泳Fig.6 Electrophoresis detection of PCR product of exon 12 and 3′UTR in GNAS gene of Korean quail

圖7 朝鮮鵪鶉GNAS基因擴增產(chǎn)物不對稱PCR-SSCP分析Fig.7 Genotypes of GNAS gene in Korean quail by ASPCR-SSCP analysis

圖8 朝鮮鵪鶉GNAS基因的突變檢測Fig.8 Detections of GNAS mutation in Korean quail

2.8 GNAS基因多態(tài)性與羽色性狀的關(guān)聯(lián)分析

如表5所示，在g.119221T>A位點，栗羽朝鮮鵪鶉3種基因型的頻率分布與白羽朝鮮鵪鶉差異不顯著(P>0.05)；在g.121181A>G突變位點，栗羽朝鮮鵪鶉的3種基因型的頻率分布與白羽朝鮮鵪鶉差異極顯著(P<0.01)，等位基因A能顯著提高羽色沉積度，其中AA基因型個體>AB基因型個體>BB基因型個體。由此可以推斷，GNAS基因3′UTR的g.121181A>G突變位點與朝鮮鵪鶉羽色性狀具有關(guān)聯(lián)性。

表4 不同基因型群體分析

表5 朝鮮鵪鶉GNAS基因多態(tài)性與羽色性狀的相關(guān)性分析

3 討論

羽色的遺傳效應是近年來許多學者研究的重點。類胡蘿卜素類色素和黑色素類色素是沉積在皮膚中的2種主要色素，其相互影響形成了動物界豐富多彩的顏色。類胡蘿卜素類色素主要沉積在皮膚和卵巢中[8]；真黑色素和褐黑素統(tǒng)稱黑色素，主要存在于黑色素細胞中，黑色素細胞主要分布于結(jié)締組織、骨骼以及骨膜等各種組織中[9]，黑色素細胞在真皮層和表皮層沉積的位置不同對膚色影響也不盡相同[10]。

在黑色素皮質(zhì)素代謝途徑中，MC1R與配體結(jié)合后被激活，催化產(chǎn)生第二信使cAMP，促進真黑素的形成[4]。當黑色素細胞中的MC1R含量不足或者活動受阻時，黑色素的含量就會減少，動物的皮膚等顏色就表現(xiàn)為淺色[11-12]。本研究結(jié)果表明，GNAS基因在栗羽朝鮮鵪鶉組織中表達水平高于白羽朝鮮鵪鶉，與趙新[14]提出的GNAS基因mRNA在黑色綿羊皮膚中表達水平極顯著高于白色綿羊皮膚組織的觀點一致。GNAS基因在朝鮮鵪鶉胚胎發(fā)育至8 d時表達量達到最大，此時該基因處于活躍時期，催化激活第二信使并促進真黑素的合成，當色素的合成和沉積達到一定水平后會影響到動物的膚色表型。朝鮮鵪鶉GNAS基因的CDS區(qū)序列與其他物種同源性對比，發(fā)現(xiàn)GNAS基因CDS區(qū)序列與日本鵪鶉和原雞等禽類具有非常高的同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹上先聚合，緊接著與哺乳類以及其他物種再聚合，反映出GNAS基因編碼蛋白存在著物種間的差異但同時保持了高度保守性。

據(jù)報道，與GNAS同屬一個家族的GNAQ和GNA11基因的變異與惡性黑色毒瘤的發(fā)生有密切的相關(guān)性[14-15]，說明基因在體內(nèi)黑色素細胞的代謝通路中，發(fā)揮著重要作用。Weinstein等[3]報道，McCune-Albright綜合征患者的GNAS基因第8外顯子產(chǎn)生了錯義突變，造成皮膚黑色素增多并出現(xiàn)咖啡樣色素斑。同時人的GNAS基因的第5外顯子上的突變位點與黑色素瘤、膀胱癌以及肺癌等惡性腫瘤患者的生存期顯著相關(guān)[16-17]。通過以上報道可以得知GNAS基因與黑色素的形成有密切的關(guān)系。本次試驗在朝鮮鵪鶉GNAS基因上檢測到了2個SNP位點，2個突變位點均表現(xiàn)為中度多態(tài)，且都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。由于體內(nèi)的黑色素形成和作用機理異常復雜，因此，在這一過程中黑色素的合成和沉積，以及GNAS基因的表達和變異都會對羽色多樣性產(chǎn)生影響。經(jīng)對比可看出這2個SNP位點均未能引起氨基酸的改變，但外顯子12區(qū)域的g.119221T>A突變?yōu)橥x突變，可能會引起RNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進而導致立體結(jié)構(gòu)改變而影響其理化性質(zhì)，從而可能會影響后續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程[18]；目前對于MicroRNA的研究集中在3′UTR區(qū)域[19]，本試驗的3′UTR區(qū)域的g.121181A>G的突變位點與MicroRNA結(jié)合有關(guān)，進而會影響基因轉(zhuǎn)錄活性等變化。在g.121181A>G突變位點，栗羽朝鮮鵪鶉3種基因型的頻率分布與白羽朝鮮鵪鶉差異極顯著(P<0.01)，等位基因A能顯著提高羽色沉積度，說明該突變位點與朝鮮鵪鶉羽色性狀具有一定的關(guān)聯(lián)性。