趙翔玥，張二芹，許倩茹，馬凡舒，王雅楠，牛香香，李雪洋，張申立，張同旭，鄧瑞廣，張以芳，張改平

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450046；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室 農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)開放實驗室，河南 鄭州 450002；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；5.吉林大學(xué)，吉林 長春 130012；6.河南南陽市第四職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，河南 南陽 473000)

禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)引起的一種以呼吸系統(tǒng)疾病為特征的傳染病，1878年首次在意大利暴發(fā)流行，當(dāng)時稱之為“雞瘟”，分為高致病性和低致病性禽流感[1-3]。H9N2亞型為低致病性禽流感，感染雞群后尤其是產(chǎn)蛋雞群，通常引起輕度呼吸道疾病，使蛋雞產(chǎn)蛋率急劇下降或者與其他病原體共同感染進(jìn)而出現(xiàn)高死亡率[4]，不僅給養(yǎng)雞業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，也給人類健康生活帶來了極大隱患。哈獸研禽流感研究室在2016年對我國雞場進(jìn)行的禽流感病原學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，禽流感陽性雞群中H9亞型陽性雞群占總數(shù)的37.12%，這表明了H9N2亞型禽流感在我國廣泛存在。

AIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒，共編碼10種蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2。其中HA蛋白是AIV粒子表面最主要囊膜糖蛋白，也是AIV最重要的保護(hù)性抗原，該蛋白產(chǎn)生的抗體不僅可以中和病毒，還可以刺激宿主產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。

目前，預(yù)防H9N2亞型AIV主要以傳統(tǒng)疫苗為主，即滅活苗和弱毒苗。滅活苗主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，不能抵抗異源毒株的感染，長期使用易導(dǎo)致不同亞型抗原間的重排和抗原變異，常出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。減毒活疫苗仍存在活病毒成分，有返毒風(fēng)險，而且疫苗的保存、成本、運(yùn)輸條件較高。因此，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究者們陸續(xù)投入新型疫苗的研發(fā)以彌補(bǔ)傳統(tǒng)疫苗的不足，如亞單位疫苗。HA是流感病毒亞單位疫苗研制的主要靶抗原，許多研究人員已在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)HA蛋白，進(jìn)行動物試驗，并評估HA蛋白免疫效果。李春紅等[5]、易華山等[6]分別在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)HA蛋白，雖然能與抗體發(fā)生反應(yīng)，但易以包涵體的形式存在，活性不高；何宏軒等[7]制備的DNA疫苗，可誘導(dǎo)雞群產(chǎn)生免疫保護(hù)，但接種的DNA有可能與宿主的基因組整合；徐一鳴等[8]將H9的HA基因在酵母中成功表達(dá)，但酵母系統(tǒng)表達(dá)蛋白分泌效率低，不適合高密度培養(yǎng)；張民秀等[9]、Lin等[10]、石霖等[11]在桿狀病毒(Baculovirus)-昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)了HA蛋白，且具有良好的生物學(xué)活性；陳平等[12]將HA基因插入雞痘病毒，制成的重組雞痘病毒疫苗，能明顯的抑制病毒排出；孫瑩等[13]構(gòu)建HA基因重組鴨腸炎病毒，免疫鴨能誘導(dǎo)產(chǎn)生AIV HI抗體效價，可阻止80%以上免疫鴨排毒；Liu等[14]重組火雞皰疹病毒-HA，也可預(yù)防病毒攻擊。

H9N2亞型禽流感亞單位疫苗的研究不計其數(shù)，但由于這些表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的重組蛋白存在產(chǎn)量較低、生產(chǎn)和后期純化成本較高以及存在重組蛋白的穩(wěn)定性和安全性等問題，基本上都處在研究階段，限制了這些表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)中的應(yīng)用[15]。有研究表明，通過水稻胚乳細(xì)胞高效表達(dá)平臺表達(dá)得到的狂犬病毒重組G蛋白、新城疫病毒重組HN蛋白和重組F蛋白具有成本較低、易于儲存、免疫活性較高的特點(diǎn)[16-19]。鑒于此，為了在體外得到表達(dá)量高、易儲存、易規(guī)?；?、成本低且免疫活性高的禽流感H9N2亞型HA蛋白，選擇水稻胚乳細(xì)胞高效表達(dá)平臺表達(dá)HA蛋白，且通過雜交提高蛋白的表達(dá)量，旨在為新型、高效H9N2亞型禽流感亞單位疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

根據(jù)GenBank的HA基因序列，重組質(zhì)粒pUC57-HA由南京金斯瑞公司合成。中間載體pMP3、植物表達(dá)載體pCAMBIA1300、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105等均由武漢禾元生物技術(shù)有限公司提供。Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)購自瑞士Roche公司；10×Loading Buffer、DL10000 DNA Marker、PremixTaq、dNTPs等均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自美國Axygen公司；NC膜、PVDF膜均購自美國Millipore公司；潮霉素B、卡那霉素(Kan)、特美汀等均購自美國Phyto Technology公司；所有限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；乙酰丁香酮(AS)、植物激素6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚；3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、6-糖基氨基嘌呤(KT)等均購自Biosharp公司。LB、農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基等均參照武漢禾元科技股份有限生物公司提供的方法配制。商品化桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)的H9N2亞型禽流感HA蛋白和兔多抗血清等均購自北京義翹神州科技有限公司；辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1HA基因序列優(yōu)化及引物設(shè)計 從GenBank中獲得HA氨基酸序列，根據(jù)水稻密碼子偏愛性優(yōu)化基因序列，由南京金斯瑞公司將HA基因序列合成到pUC57上，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計1對特異性引物和2對qPCR引物和1對內(nèi)參(RBE4)引物(表1)。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 合成的引物Tab.1 Synthetic primer

1.2.2 中間載體和植物表達(dá)載體的構(gòu)建MlyⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pUC57-HA，NaeⅠ和XhoⅠ雙酶切中間載體pMP3；經(jīng)膠回收、T4DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，然后進(jìn)行PCR和重組質(zhì)粒酶切鑒定，最后送到公司測序鑒定HA基因序列；分別用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切pMP3-HA和植物載體pCAMBIA1300，切膠回收、連接轉(zhuǎn)化，并用PCR和雙酶切鑒定將重組質(zhì)粒送到公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.3HA基因的水稻遺傳轉(zhuǎn)化 通過電轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-pMP3-HA轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)8～9 d水稻愈傷組織30～40 min，其次將愈傷組織接種到共培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)3 d 后用頭孢水沖洗，置于無菌濾紙上晾干后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基，26 ℃暗培養(yǎng)30～35 d，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30 d，再轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待根系完全長出后，移栽至溫室煉苗。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測 采取煉苗期間水稻植株葉片，通過CTAB法提取水稻的總DNA。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：PremixTaq2.5 μL，HA-F(0.01 mol/L)1 μL，HA-R(0.01 mol/L)1 μL，水稻總DNA 1 μL，H2O 16.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。最后用1%瓊脂糖凝膠核酸電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.5 T1水稻種子HA蛋白的表達(dá)鑒定 將獲得的轉(zhuǎn)基因水稻種子進(jìn)行切半粒研磨成粉，按1∶5加入HA蛋白提取液(20 mmol/L Tris-HCl，25 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH值8.5)。室溫下攪拌1 h，然后12 000 r/min離心20 min，吸取上清液至新的離心管中，保存于4 ℃?zhèn)溆?。分別用Dot Blot和Western Blot的方法檢測HA蛋白的表達(dá)。Dot Blot檢測：裁剪合適大小的NC膜，取提取好的蛋白點(diǎn)在NC膜上，每點(diǎn)1 μL，待其完全風(fēng)干，經(jīng)封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯色，鑒定HA蛋白的反應(yīng)活性。Western Blot檢測：取適量取提取好的蛋白，通過10% SDS-PAGE電泳，利用轉(zhuǎn)印電泳將蛋白到合適大小的PVDF膜上，經(jīng)封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯色，鑒定HA蛋白的反應(yīng)活性。

1.2.6 純合子植株的篩選 利用熒光定量PCR的方法[20-21]，篩選轉(zhuǎn)HA蛋白的純合子株系。用水稻的內(nèi)源基因水稻淀粉分支酶基因(Rice starch branching enzyme，RBE4)(單拷貝)作為內(nèi)參，通過比較Ct(2-ΔΔCt)值進(jìn)行篩選。純合子的2-ΔΔCt值為雜合子的2倍，所以依據(jù)2-ΔΔCt值來判定純合子植株。首先用qPCR篩選出引物，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，然后用CTAB法提取T2水稻的新鮮葉片DNA，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：DNA模板2 μL，2×SYBR Green mix 5 μL，QHA-F和QHA-R各0.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，53 ℃ 20 s，35個循環(huán)；95 ℃ 15 s，53 ℃ 20 s。每個反應(yīng)重復(fù)3次。

1.2.7 高表達(dá)雜交植株的篩選 利用溫湯殺雄剪穎授粉法[22]，將含有HA蛋白的TP309水稻與低谷蛋白雜交，經(jīng)過T1和T2檢測和種植，最終在T3獲得純合低谷蛋白水稻，通過觀察雜交前后種子外觀發(fā)生的變化、SDS-PAGE和Western Blot檢測，判斷雜交前種子和雜交后種子HA蛋白表達(dá)量。

1.2.8 HA蛋白活性檢測 將提取的水稻源的HA蛋白和商品化的HA蛋白(桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá))分別稀釋6個組，即：0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0，2.000 0 mg/L。通過雙抗夾心ELISA的方法對比檢測2個蛋白的活性[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定與分析

MlyⅠ和XhoⅠ雙酶切pUC57-HA(圖1)及NaeⅠ和XhoⅠ雙酶切中間載體pMP3(圖2)，分別經(jīng)膠回收、連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定pMP3-HA，并送到公司測序，結(jié)果正確。用Hind Ⅲ和EcoRⅠ分別酶切重組質(zhì)粒pMP3-HA(圖2)和植物載體pCAMBIA1300，分別經(jīng)膠回收、連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α菌中，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定pCAMBIA1300-HA(圖3)，并送到公司測序，與預(yù)期結(jié)果相符。

M. DL10000 DNA Marker；1.重組質(zhì)粒pUC57-HA雙酶切產(chǎn)物。M. DL10000 DNA Marker；1.Recombinant plasmid pUC57-HA double digestion product.

M. DL10000 DNA Marker；1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒pMP3-HA雙酶切產(chǎn)物。M. DL10000 DNA Marker；1.PCR amplification products；2.Recombinant plasmid pMP3-HA double digestion product.

M. DL10000 DNA Marker；1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-HA雙酶切產(chǎn)物。M. DL10000 DNA Marker；1.PCR amplification products；2.Recombinant plasmid pCAMBIA1300-HA double digestion product.

2.2 HA陽性植株的篩選與分析

經(jīng)農(nóng)桿菌EHA105將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300導(dǎo)入到水稻愈傷組織中，經(jīng)過暗培養(yǎng)、篩選、分化、生根移栽，提取葉片DNA，經(jīng)PCR檢測，共檢測到66株為陽性植株(圖4)。

M. DL10000 DNA Marker；1-48，51-111.轉(zhuǎn)基因植株的檢測；49.陽性對照；50.陰性對照。M. DL10000 DNA Marker；1-48，51-111.Detection of transgenic plants；49.Positive control；50.Negative control.

2.3 HA蛋白表達(dá)鑒定與分析

取檢測為陽性的4株植株種子，研磨，加提取液，攪拌，離心，取上清，通過Dot Blot和Western Blot檢測。結(jié)果顯示，NC膜上出現(xiàn)特異性蛋白圓點(diǎn)(圖5)，PVDF膜上顯示出一條大小約為130 ku的特異性蛋白質(zhì)條帶(圖6)。說明HA蛋白已在水稻胚乳中表達(dá)，且具有良好的反應(yīng)原性。

1-4.水稻源重組HA蛋白。圖6同。1-4.Rice-derived recombinant HA protein.The same as Fig.6.

M.蛋白質(zhì)Marker。M.Protein Marker.

2.4 T1HA純合子植株的篩選與分析

設(shè)計2對qPCR引物，利用陽性質(zhì)粒篩選2對引物的特異性，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)和溶解曲線(圖8)，最終確定引物QHA-F2：5′-ACAAGATCACCAGCAAGGTCA-3′；QHA-R2：5′-TTGTTGATCATGTTGAGGCG-3′。應(yīng)用RBE4作為內(nèi)參，檢測陽性植株HA基因的Ct值，每個樣品重復(fù)3次，通過比較RBE4和HA基因的Ct值，根據(jù)公式2-ΔΔCt進(jìn)行篩選純合子。純合子的2-ΔΔCt值約為雜合子的2倍，107株中篩選到31株純合子植株，部分結(jié)果如表2所示。

圖7 QHA-F2/R2引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve for QHA-F2/R2 primers

圖8 QHA-F2/R2引物的熔解曲線Fig.8 Melting curve of QHA-F2/R2 primer

表2 熒光定量PCR檢測HA的T1植株的純合子Tab.2 Detection of homozygotes T1 generation of HA by fluorogenic quantitative PCR

2.5 高表達(dá)雜交植株的鑒定與分析

利用溫湯殺雄剪穎授粉法，將含有HA蛋白的TP309水稻與低谷蛋白雜交，T1、T2經(jīng)檢測后種植，在T3篩選到含HA蛋白的純合低谷蛋白水稻。通過Western Blot檢測4株雜交后HA蛋白，結(jié)果在130 ku附近出現(xiàn)單一且很粗的條帶(圖9)。通過外觀觀察發(fā)現(xiàn)，雜交前種子多數(shù)呈土黃色；雜交后種子的顏色為白色，且顆粒飽滿(圖10)。通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)， HA蛋白表達(dá)量提高較多(圖11)。

M.蛋白質(zhì)Marker；1-1，2-1，3-1，4-1.雜交后的HA蛋白。M.Protein Marker；1-1，2-1，3-1，4-1.Hybridized HA protein.

圖10 雜交前后種子外觀變化Fig.10 Seeds appearance changes before and after hybridization

M.蛋白質(zhì)Marker；1.陰性對照；2.雜交前HA蛋白；3.雜交后HA蛋白。M.Protein Marker；1.Negative control；2.HA protein before hybridization；3.HA protein after hybridization.

2.6 HA蛋白ELISA檢測分析

將水稻源HA蛋白和商品化桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)的HA蛋白分別稀釋6組，即0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0，2.000 0 mg/L。通過雙抗夾心ELISA法檢測2個蛋白的活性。結(jié)果表明，水稻源重組HA蛋白活性高于昆蟲源重組HA蛋白(圖12)。

圖12 ELISA方法檢測水稻源和昆蟲源HA蛋白活性Fig.12 Detection activity of HA protein from rice and insect respectively by ELISA

3 結(jié)論與討論

植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白在生產(chǎn)成本、規(guī)模化和產(chǎn)品安全方面具有優(yōu)勢，與所有的生物反應(yīng)器相比，植物是最廉價的“工廠”[24]。而水稻作為嚴(yán)格的自花授粉植物，很好地避免了田間污染的問題。水稻本身使用廣泛、過敏性低，這一點(diǎn)不同于煙草，且已經(jīng)被FDA公證過，對動物體沒有任何的傷害；不攜帶任何的動物源性疾病，用水稻胚乳作為反應(yīng)器更安全[25]。水稻作為單子葉真核植物，細(xì)胞內(nèi)可以進(jìn)行完整的蛋白修飾和加工，這也有利于對目的蛋白進(jìn)行設(shè)計轉(zhuǎn)入后的復(fù)制和擴(kuò)增，可以很好地提高目的蛋白的表達(dá)量[26]。

HA蛋白是AIV疫苗研制的主要靶抗原，所以本研究選擇HA基因作為靶基因，利用水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)H9N2亞型HA蛋白。將優(yōu)化的HA基因成功構(gòu)建到植物載體pCAMBIA1300上，使pCAMBIA1300-HA植物表達(dá)載體上不僅含有中間載體pMP3上利于外源基因在水稻中表達(dá)的GT13特有啟動子、信號肽SP和終止子，還能夠通過根癌農(nóng)桿菌成功地將HA基因轉(zhuǎn)入水稻的愈傷組織中。愈傷組織經(jīng)過篩選、分化、生根和田間種植，經(jīng)PCR結(jié)果顯示，T0有66株水稻的HA基因已經(jīng)整合到水稻基因組上。通過Dot Blot和Western Blot方法檢測T0水稻種子，HA基因已在水稻胚乳中的成功表達(dá)。為了確保HA蛋白在水稻中能夠穩(wěn)定遺傳，利用qPCR篩選了107株T1成功表達(dá)HA的株系，獲得了31株穩(wěn)定遺傳的HA蛋白水稻株系；為了提高HA蛋白在水稻胚乳中的表達(dá)量，采用溫湯殺雄剪穎授粉法，將含有HA蛋白的TP309水稻與低谷蛋白水稻雜交，經(jīng)過3代種植篩選后，用SDS-PAGE和Western Blot方法檢測T3雜交種子，獲得了HA表達(dá)量更高的雜交后水稻種子。利用夾心ELISA法比較水稻源和昆蟲源HA蛋白的活性，結(jié)果表明，在水稻胚乳中表達(dá)的HA蛋白活性高于桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞。

Qiu等[27]用致死小鼠的H9N2亞型AIV毒株表達(dá)的HA和NA基因的核酸疫苗免疫小鼠；Pushko等[28]將擴(kuò)增的H9N2亞型AIV的HA、NA和M1基因，獲得大量表達(dá)的HA﹑NA和M1蛋白，并自動組裝成病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒具有AIV的HA和NA活性，能有效阻止AIV在上呼吸道和肺部的復(fù)制，但是后續(xù)研究沒有與實際應(yīng)用直接相連，只是處于研究階段。雖然本研究利用水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)得到的HA蛋白純化的條件還需進(jìn)一步摸索，以及動物試驗還未開展，但已經(jīng)在體外獲得表達(dá)量高、儲存容易、成本低、免疫活性高、安全性好、易規(guī)模化、生產(chǎn)工藝簡單且綠色環(huán)保的禽流感H9N2亞型的HA蛋白。本研究為后續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化和動物試驗提供了依據(jù)，也為后期新型H9N2亞型禽流感亞單位疫苗的研發(fā)提供了可能。