殷 實(shí),秦文昌,王 斌,楊柳青,周靖雯,李 鍵,2,3

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041；2. 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041；3. 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041；4. 西南民族大學(xué) 現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041)

組蛋白乙?；且环N重要的表觀遺傳調(diào)控方式,參與了細(xì)胞內(nèi)的多個生物學(xué)過程,例如調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄以及染色質(zhì)的構(gòu)象等[1]。細(xì)胞內(nèi)的組蛋白乙?；接蓛深悎?zhí)行相反功能的酶,組蛋白去乙?；?Histone deacetylases,HDACs)和乙酰基轉(zhuǎn)移酶共同調(diào)節(jié),其中HDACs負(fù)責(zé)去除組蛋白上已經(jīng)乙?；馁嚢彼釟埢?增加組蛋白表面的負(fù)電荷,進(jìn)而增強(qiáng)組蛋白與DNA的結(jié)合能力,使染色質(zhì)處于凝集狀態(tài)并抑制基因轉(zhuǎn)錄,而乙酰基轉(zhuǎn)移酶執(zhí)行的過程則正好相反[2]。

精子發(fā)生是一個包含有絲分裂、減數(shù)分裂以及細(xì)胞分化的復(fù)雜生物學(xué)過程[3],涉及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體構(gòu)象的重塑以及組蛋白的替換等[4-5]。Sirtuin 1 (SIRT1) 屬于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotine adenine dinucleotide, NAD)依賴性的Ⅲ 型HDACs Sirtuin 家族的成員之一[6],已有文獻(xiàn)報(bào)道SIRT1參與了多個生物學(xué)過程,例如組蛋白修飾、基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控以及衰老等[7-8]。目前多個敲除小鼠模型已被建立用來研究SIRT1在生殖系統(tǒng)的功能。全身性SIRT1敲除小鼠精子發(fā)生停滯,凋亡的粗線期精母細(xì)胞增多,支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的成熟發(fā)生異常,睪丸內(nèi)睪酮的含量降低[9],進(jìn)入減數(shù)分裂前的生殖細(xì)胞特異性敲除SIRT1的小鼠睪丸變小,精子數(shù)量減少,凋亡細(xì)胞增多,生育力降低[10],這些結(jié)果提示SIRT1可能在睪丸的不同細(xì)胞中通過不同的信號通路影響個體的生殖能力。

牦牛是生活在青藏高原上的特有畜種,能夠?yàn)槟撩裉峁┢浔匦璧母鞣N生產(chǎn)生活材料,因而對高原畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義[11]。然而牦牛繁殖能力較低,野生牦牛的生殖能力不到40%[12],雖然雄性牦牛在2歲前即能發(fā)生跨背交配行為,但直到4～5歲其才發(fā)育至性成熟并進(jìn)入配種高峰期[13]。因此,提高牦牛的生殖能力對于改善其生產(chǎn)性能,進(jìn)而促進(jìn)高原地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本研究克隆了牦牛SIRT1基因,通過多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測了其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,并檢測了SIRT1在不同發(fā)育時期牦牛睪丸中的表達(dá)和定位,為進(jìn)一步研究SIRT1在雄性生殖系統(tǒng)中的作用以及提高牦牛的生殖能力提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 組織樣本的采集

樣本采自成都市青白江區(qū)屠宰場,依據(jù)齒齡將牦牛劃分為幼年組(0.5～1歲)、青年組(2～3歲)及成年組(4～5歲)。試驗(yàn)動物斷頸放血后對其進(jìn)行剖腹,隨即用無菌剪刀采集各時間段牦牛(每組3頭)睪丸組織,同時采集成年組肝臟、心臟、脾臟、腦、小腸、胃、睪丸和卵巢組織,來源于同一組的3個不同樣本均視為生物學(xué)重復(fù)。取下的組織用無菌生理鹽水沖洗后,再用無菌剪刀剪成1 cm×1 cm×0.5 cm大小的組織塊,在-80 ℃條件下保存,另取各階段的睪丸組織,放置于無RNA酶的4% PFA中常溫下進(jìn)行固定。

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol購自Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix TapTMDNA聚合酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、pMD19-T載體由TaKaRa公司生產(chǎn)；DNA膠回收試劑盒由康寧生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)；DEPC、感受態(tài)細(xì)胞DH5α和DNA Marker均購自天根生化科技有限公司;Real-time PCR Master(ROX) 購自 Roche 公司;cOmpleteTMProtease Inhibitor Cocktail購自Roche公司;SIRT1 抗體購自Sigma公司;β-actin購自Bioss 公司;CISH試劑盒購自上海歌凡生物有限公司;其他無特殊說明的試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 牦牛各組織總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

依據(jù)TRIzol法從牦牛各個組織提取RNA,用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和OD值,按PrimeScriptTMRT Reagent Kit 說明書所述方法合成cDNA并將其凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牦牛SIRT1基因的克隆測序

參考GenBank中黃牛SIRT1基因序列(登錄號：NM_001192980.3),以牦牛肝臟cDNA為模板,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物(表1)。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：2×LA Taq Master Mix 12.5 μL；上、下游引物各1 μL；cDNA 模板1 μL；ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s,62 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,38個循環(huán)；72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,將目的條帶切下后進(jìn)行DNA膠回收。16 ℃金屬浴中將膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接15 h,之后與感受態(tài)細(xì)胞混合并在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h,離心后將沉淀菌液均勻涂到含有0.1%氨芐的LB固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃培恒溫培養(yǎng)箱中12 h,選取白色單菌落接種于液態(tài)LB培養(yǎng)基中,于搖床振蕩培養(yǎng)8 h后,選陽性菌株交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 牦牛SIRT1基因生物信息學(xué)分析

通過 DNAMAN 8軟件預(yù)測SIRT1基因的ORF(Open reading frame,開放閱讀框)以及其編碼的氨基酸序列,并進(jìn)行同源性比對分析,通過ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)、NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、NetOGlyc 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)、NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、 PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)、Pfam (http://pfam.janelia.org/)以及SWISS_MODE (https://swissmodel.expasy.org/interactive) 分別預(yù)測牦牛SIRT1蛋白的基本理化性質(zhì)、親疏水性、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、保守結(jié)構(gòu)域、二級以及三級結(jié)構(gòu)。

1.6 牦牛SIRT1基因組織表達(dá)譜

根據(jù)已克隆出的牦牛SIRT1基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR引物(表1),以ACTB作為內(nèi)參基因,內(nèi)參基因引物根據(jù)GenBank中黃牛GAPDH基因序列(登錄號：NM_173979.3)設(shè)計(jì)(表1),并通過實(shí)時熒光定量PCR儀檢測該基因在各組織的表達(dá)量。反應(yīng)總體系(10 μL)：Real-time PCR Master(ROX) 5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性10 s,60 ℃退火 31 s,72 ℃ 延伸30 s,其中退火和延伸共持續(xù)40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)檢測3次。

1.7 色素原位雜交(Chromogenicin situ hybridization,CISH)

將在無RNA酶的4% PFA中固定的睪丸組織進(jìn)行包埋切片,按照CISH試劑盒所述方法進(jìn)行原位雜交,其中檢測SIRT1的探針連接了地高辛,其序列為5′-TCATCACCAAACAGAAGGTTATCTCGGTA C-3′,一個具有來自線蟲的非特異性序列連接了地高辛的探針作為陰性對照,其序列為5′-UUGU ACUACACAAAAGUACUG-3′。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 PCR primer sequences and product length

1.8 Western Blot檢測SIRT1蛋白在牦牛睪丸不同發(fā)育階段中的表達(dá)

將睪丸組織剪成細(xì)小的碎片,按每 20 mg 組織加入 150～250 μL 裂解液的比例加入裂解液(100 mmol/L Tris/HCl(pH值7.4)、3% 十二烷基硫酸鈉、10 mmol/L 二硫蘇糖醇、17.3% 甘油、0.15% 溴酚藍(lán)及1% cOmpleteTM Protease Inhibitor Cocktail),勻漿器勻漿直至完全裂解,裂解后的樣品4 ℃ 10 750 r/min離心15 min,取上清,BCA方法測定蛋白質(zhì)濃度。按照20 μg的上樣量進(jìn)行蛋白定量,使蛋白濃度調(diào)整至一致,用12% 的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) 電泳2 h,90 V轉(zhuǎn)膜50 min,5% 脫脂奶粉溶液室溫?fù)u床封閉2 h,加入SIRT1(稀釋比例：1∶500)和β-actin 抗體(內(nèi)參,稀釋比例：1∶1 000),4 ℃孵育過夜后,TBST緩沖液洗滌3次,加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗滌3次,加入ECL顯影液進(jìn)行顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用One-way ANOVA (Tukey′s 多重比較檢驗(yàn)) 。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以mean±SEM 的方式表示,P<0.05 被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛SIRT1基因的克隆及序列分析

利用DNAMAN軟件對測序得到的SIRT1序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明,牦牛SIRT1基因的ORF包括1 866 bp, 編碼621個氨基酸,編碼序列的起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA (圖1),將其基因以及編碼的氨基酸序列與部分其他物種進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)其與黃牛(Bostaurus)的基因及氨基酸序列相似度最高,分別達(dá)到99.44%和98.04%,與表中其他物種基因和氨基酸的序列相似度也均達(dá)到90% 以上(表2),由此可見,SIRT1基因在物種進(jìn)化過程中高度保守。

起始密碼子ATG用方框標(biāo)出；終止密碼子TAA用*標(biāo)出。The translation initiation codon ATG is boxed; The stop codon is marked by an asterisk.

2.2 牦牛SIRT1蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過ExPASy在線工具對SIRT1蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果表明,該蛋白分子量為68.99 ku,分子式為 C3034H4834N828O950S27,脂肪族系數(shù)、等電點(diǎn)以及不穩(wěn)定系數(shù)分別為85.57,5.00 以及 49.40。SIRT1蛋白包含20種氨基酸,其中出現(xiàn)頻率最高的前3位分別是 Glu(8.70%)、 Leu(8.53%)以及 Pro(8.05%)。 在所有氨基酸中,70個氨基酸(Arg+Lys)帶正電荷,97個氨基酸(Asp+Glu)帶負(fù)電荷,由此可得,SIRT1蛋白整體上帶負(fù)電。親疏水性分析表明，在其第108及109位氨基酸存在最小親水指數(shù),為-3.748,在其第124位氨基酸位點(diǎn)存在最大疏水指數(shù),為2.511,平均親水指數(shù)為-0.408,由此可知,該蛋白為疏水脂溶性蛋白。

表2 牦牛與部分其他物種SIRT1基因及氨基酸的序列同源性比對Tab.2 Alignment of SIRT1 gene and amino acid sequences between yak and some other species

A.預(yù)測的SIRT1二級結(jié)構(gòu),其中紅色、黃色和灰色分別代表α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲；B.預(yù)測的SIRT1保守結(jié)構(gòu)域；C.預(yù)測的SIRT1三級結(jié)構(gòu)。A.Predicted secondary structure of SIRT1, red,yellow and gray stand for alpha helix, beta sheet and random coil, respectively；B. Predicted conserved domain for SIRT1；C.Predicted tertiary structure of SIRT1.

多個生物信息學(xué)軟件預(yù)測表明,SIRT1 蛋白包含59個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、7個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)、16個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn), 43個O-糖基化位點(diǎn)以及2個N-糖基化位點(diǎn)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，SIRT1蛋白中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲分別占30.11%,9.82%,60.06%,同時該蛋白是一個不具跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽的非分泌蛋白(圖2-A),另外,該蛋白含有一個保守的Sir2結(jié)構(gòu)域(圖2-B)。SIRT1蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步驗(yàn)證了二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測(圖2-C)。

2.3 牦牛SIRT1 mRNA的組織表達(dá)譜

利用qRT-PCR檢測SIRT1mRNA在牦牛各組織中的表達(dá),如圖3所示,SIRT1mRNA在所檢測的8個組織中均有表達(dá),其中在睪丸、卵巢及肝臟中的表達(dá)較高,極顯著高于心臟、胃、脾臟、小腸和腦中的表達(dá)。

相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異極顯著(P<0.01)；One-way ANOVA (Tukey′s 多重比較檢驗(yàn))。圖5同。

2.4 SIRT1在牦牛不同發(fā)育時期睪丸中的表達(dá)和定位

為了進(jìn)一步研究SIRT1在牦牛睪丸中的作用,首先采用CISH檢測SIRT1mRNA 在牦牛不同發(fā)育階段睪丸中的定位,發(fā)現(xiàn)SIRT1mRNA廣泛存在于各階段牦牛睪丸中的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、支持細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中,然而在幼年期及成年期睪丸的精細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)SIRT1的表達(dá)(圖4),隨后利用Western Blot檢測 SIRT1蛋白在牦牛不同發(fā)育時期(幼年期、青年期以及成年期)睪丸中的表達(dá),結(jié)果表明,SIRT1蛋白在幼年期牦牛睪丸中的表達(dá)量最高,隨年齡增長其表達(dá)極顯著下調(diào)(圖5)。

SIRT1 mRNA在幼年期、青年期及成年期睪丸中的定位。綠色箭頭(實(shí)線).精原細(xì)胞；綠色箭頭(虛線).精母細(xì)胞；紅色箭頭(實(shí)線).支持細(xì)胞；紅色箭頭(虛線).間質(zhì)細(xì)胞；黃色箭頭(實(shí)線).精細(xì)胞。一個帶有線蟲非特異序列的探針被作為陰性對照(NC)。

A.Western Blot分析SIRT1 蛋白在幼年期、青年期及成年期牦牛睪丸中的表達(dá)；B.通過光密度分析對A中結(jié)果進(jìn)行定量。A.Western Blot analysis of SIRT1 in yak testis of calve, juvenile and adult stages；B.Protein levels in A were quantified by measuring optical density.

3 結(jié)論與討論

組蛋白乙?；且环N由組蛋白乙酰化酶和去乙?；腹餐{(diào)控的,參與多個重要生物學(xué)過程的表觀修飾方式[14-15]。SIRT1 屬于NAD依賴的Ⅲ型去乙?；?已有報(bào)道其對小鼠、大鼠及豬的生殖能力是必需的[16-18],然而牦牛SIRT1基因及蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,以及其在雄性牦牛生殖系統(tǒng)中的表達(dá)定位依舊未知。本研究克隆了SIRT1基因,對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了預(yù)測,并分析了其在不同發(fā)育時期牦牛睪丸中的表達(dá)定位。

序列比對結(jié)果表明,牦牛SIRT1基因序列和其他物種高度同源,表明該基因在進(jìn)化過程中高度保守,這與其保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果相吻合。預(yù)測的牦牛SIRT1蛋白包含一個保守的Sir2催化結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域廣泛存在于Sirtuins家族的不同成員中,負(fù)責(zé)結(jié)合NAD以及乙酰化的賴氨酸殘基[19]。有文獻(xiàn)表明, SIRT1的去乙?；钚允艿窖趸斑€原形式NAD (NAD+/NADPH)比例的影響[20],表明該結(jié)構(gòu)域?qū)IRT1的功能是必需的。此外,蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明,牦牛SIRT1含有多個磷酸化及糖基化位點(diǎn),提示該蛋白可能受到翻譯后修飾的調(diào)控。有文獻(xiàn)報(bào)道c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase 2,JNK2)能夠磷酸化人SIRT1 蛋白第27位的絲氨酸位點(diǎn),這一過程可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中SIRT1的穩(wěn)定性和表達(dá),并可最終抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[21]。在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)O-糖基化可以增強(qiáng)SIRT1的去乙酰化酶活性,并保護(hù)細(xì)胞免受壓力誘導(dǎo)的凋亡[22]。本研究預(yù)測的牦牛SIRT1蛋白結(jié)構(gòu)對于未來尋找牦牛SIRT1的新功能和調(diào)控機(jī)制有一定的幫助。

組織表達(dá)譜的分析結(jié)果表明,SIRT1mRNA 廣泛表達(dá)在各類組織中,除睪丸外,SIRT1還高表達(dá)于卵巢及肝臟。已有文獻(xiàn)表明在多個物種中SIRT1對卵巢的功能是必需的。例如在大鼠中SIRT1通過調(diào)控叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O3(Forkhead box O3A,Foxoa3)的表達(dá)影響卵泡發(fā)育[23],在豬和大鼠的卵巢中SIRT1還可以調(diào)控雌激素的合成[24-25]。SIRT1在肝臟中的作用同樣不可替代,通過對幾種抑制脂肪肝疾病的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行去乙酰化,SIRT1可以調(diào)節(jié)肝脂代謝、控制肝氧化應(yīng)激以及介導(dǎo)肝炎發(fā)生[26],牦牛卵巢及肝臟中高表達(dá)的SIRT1暗示其可能在這些組織中發(fā)揮重要的作用。

SIRT1的mRNA在牦牛睪丸的精母細(xì)胞、精原細(xì)胞、支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中均有定位,提示SIRT1可能在這些細(xì)胞中發(fā)揮作用。在小鼠未分化的精原細(xì)胞中條件性敲除SIRT1會導(dǎo)致其睪丸變小、精子數(shù)量減少、凋亡細(xì)胞增多以及生育力下降,表明SIRT1 在精原細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要作用[10],與其相比,全身性敲除SIRT1的小鼠出現(xiàn)了支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的成熟障礙,同時睪丸內(nèi)睪酮的含量降低[9],表明SIRT1在這些細(xì)胞中同樣不可替代。需要指出的是牦牛睪丸的精細(xì)胞中缺少SIRT1的表達(dá),這與小鼠中的結(jié)果一致[10]。研究表明：精母細(xì)胞向精子轉(zhuǎn)變時核心組蛋白H3及H4 會被高度乙酰化,這一過程能夠促使核小體形成寬松的結(jié)構(gòu), 使組蛋白易于被魚精蛋白所替代[27]。推測精細(xì)胞中缺少去乙?；窼IRT1的表達(dá)很可能是為了保證組蛋白H3及H4 的高度乙?；?從而保證組蛋白替換的順利進(jìn)行。

SIRT1蛋白在牦牛睪丸中高表達(dá)于幼年期,其表達(dá)隨年齡的增長而持續(xù)降低,一個可能的解釋是這一表達(dá)趨勢與睪丸中的細(xì)胞組成有關(guān),幼年期的牦牛睪丸中缺少成熟的精細(xì)胞,而隨著個體年齡的增加,越來越多的生殖細(xì)胞完成減數(shù)分裂形成精細(xì)胞[28],因此,青年期和成年期睪丸中SIRT1 蛋白水平的持續(xù)下調(diào)很可能是由于這2個階段睪丸中成熟精細(xì)胞比例的增高所致。

本研究成功的克隆了牦牛SIRT1基因,生物信息學(xué)預(yù)測表明,SIRT1蛋白是一個不存在跨膜區(qū)、無信號肽的疏水脂溶性蛋白質(zhì),并且其包含多個糖基化和磷酸化位點(diǎn)以及一個保守的Sir2結(jié)構(gòu)域,SIRT1mRNA在牦牛睪丸組織中高表達(dá),且定位于睪丸內(nèi)除精細(xì)胞之外的各類細(xì)胞中。在不同年齡的牦牛睪丸中SIRT1蛋白的表達(dá)隨其年齡的增長而持續(xù)下降,本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究SIRT1對牦牛雄性生殖系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制提供了一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。