李 鑫，何小芳，張 浩，鄭建瑩，王雨雪，林亞秋，王 永，朱江江

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部，四川省重點實驗室，四川 成都 610041； 2.西南民族大學 生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041)

人們對肉產(chǎn)品的質(zhì)量要求隨著生活水平的提高而越來越高，山羊肉因其低膽固醇，富含人體必需的各種氨基酸和脂肪酸等特點而深受消費者青睞[1]。肌肉pH值、肉色、系水力、肌肉嫩度等肉質(zhì)性狀直接受動物體內(nèi)糖原的含量影響[2]。磷酸化酶激酶(Phosphorylase kinase，PHK)參與糖原分解，是催化分解的限速酶，其活性受到Ca2+的調(diào)節(jié)，Ca2+通過其內(nèi)源性鈣調(diào)蛋白亞基(δ)導致變構(gòu)活化，而外源性鈣調(diào)蛋白(δ′)依賴于Ca2+的結(jié)合進一步激活。磷酸化激活糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase)將糖原降解，在肝臟中可以維持血糖，而在肌肉中維持肌肉收縮[3-4]。PHK是由α、β、γ、δ 4種亞基組成的全酶(αβγδ)4[5]，其中α、β、δ為調(diào)控亞基，γ為催化亞基(包括γ1和γ2)，γ1和γ2亞基分別由磷酸化酶激酶γ1(Phosphorylase kinase γ1，PHKG1)基因和磷酸化酶激酶γ2(Phosphorylase kinase γ2，PHKG2)基因編碼[6-7]。

研究表明，PHKG1基因在糖原分解的級聯(lián)激活中發(fā)揮調(diào)控作用[8]，通過磷酸化激活糖原磷酸化酶，從而介導糖原分解的神經(jīng)和激素調(diào)節(jié)。Winchester等[4]提出PHKG1基因存在弱的多聚腺苷酸化和第 6 內(nèi)含子切割位點，因此，將PHKG1的第6外顯子鑒定為3′復合末端外顯子。Camus等[9]確定PHK為激酶抑制劑化合物的靶標，且發(fā)現(xiàn)PHKG1在人類腫瘤樣品中上調(diào)，證實其參與血管生成和作為抗腫瘤治療的潛在靶點的價值。Ma等[8]對豬PHKG1進行深度測序，發(fā)現(xiàn)其第9內(nèi)含子剪接受體位點發(fā)生一個點突變(C> A)，異常轉(zhuǎn)錄物導致動物體內(nèi)蛋白質(zhì)水平下降和酶活性減弱，且使豬肉持水量減少> 20%。Zappaterra等[10]表示PHKG1剪接突變(g.8283C>A)對大白豬的豬肉持水力呈累加效應且對肉色呈顯性影響。Liu等[11]證明杜洛克×陸川雜交豬的PSE肉是由PHKG1的剪接突變引起的，該研究結(jié)果進一步支持了PHKG1致病突變對肉質(zhì)的影響。Xue等[12]發(fā)現(xiàn)PHKG1在雞生長發(fā)育3個階段存在差異表達，可作為雞生長差異的潛在候選基因。以上研究說明PHKG1參與機體內(nèi)許多生物學過程，對動物肉質(zhì)具有重要影響，但尚未見羊方面的報道。

因此，本研究以簡州大耳羊為研究對象，擬通過克隆獲得山羊PHKG1基因的序列并進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR技術(shù)(Quantitative Real-time PCR，qPCR)檢測該基因在不同組織及不同分化階段脂肪細胞中的表達變化，為進一步研究該基因在脂肪沉積中發(fā)揮的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與樣品采集 以成年(1周歲)健康簡州大耳羊為試驗動物(n=8，購自四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司)。屠宰后收集羊的心、肝、脾、腎、肺、皮下脂肪、背最長肌等組織樣品，使用DEPC水清洗樣品后迅速裝入RNase free凍存管中，置于液氮中保存。

1.1.2 試驗試劑 TRIzol、SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)試劑盒、pMD-19T Vector購自TaKaRa公司，DNA回收試劑盒、DNA聚合酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 山羊PHKG1基因克隆 根據(jù)GenBank上山羊PHKG1基因預測序列(XM_018040602.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物(表1)。

表1 PCR和熒光定量PCR(qPCR)引物信息Tab.1 Primers information for PCR and quantitative real-time PCR(qPCR)

PCR反應體系為：Taq酶12.5 μL，背最長肌cDNA 1 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，反應總體系為25 μL。PCR擴增程序：預變性(94 ℃，4 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(58 ℃，45 s)，延伸(72 ℃，2 min)，38個循環(huán)；延伸(72 ℃，10 min)，4 ℃保溫。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用DNA回收試劑盒對目的片段進行回收和純化，將純化產(chǎn)物連接至pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化至熱激后的DH5α感受態(tài)細胞，隨后接種到含有 Amp 的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，對陽性菌落進行菌落PCR鑒定后送至成都擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 山羊PHKG1基因生物學特性 山羊PHKG1基因生物學特性分析及方法參見表2。

表2 分析內(nèi)容及相應分析工具Tab.2 Analytical contents and the corresponding analysis tools

1.2.3 山羊PHKG1基因組織表達差異分析 根據(jù)克隆獲得的PHKG1基因設(shè)計qPCR引物(表1)。利用qPCR技術(shù)檢測PHKG1在各個組織中表達的差異，TBP為內(nèi)參基因以矯正基因的相對表達水平。qPCR反應體系：10 μmol/L上、下游引物各1 μL ，SYBR?Premix Ex TaqTM (2×)10 μL， cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，總體系為20 μL，每個組織樣本設(shè)置3個重復。反應條件：預變性(95 ℃ 3 min)；變性(95 ℃ 10 s)，退火(60 ℃ 10 s)，延伸(72 ℃ 15 s)，共38個循環(huán)。

1.2.4PHKG1基因在山羊不同部位前體脂肪細胞分化過程中的表達差異分析 復蘇青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部，四川省重點實驗室前期保存的山羊肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞，待長至F380%時進行誘導分化，分別收集不同階段(0，12，24，36，48，60，96 h)的細胞提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以UXT基因為內(nèi)參基因，利用qPCR檢測PHKG1基因在各個階段的表達水平。反應體系和程序與1.2.3相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊PHKG1基因的克隆

以簡州大耳羊背最長肌cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得與預期目的產(chǎn)物大小相符的片段(圖1)，測序得到PHKG1基因片段長度1 233 bp，其中CDS區(qū)1 164 bp，無5′UTR序列，3′UTR 69 bp，共編碼387個氨基酸。

M.DL2000 DNA Marker；1.PHKG1目的條帶。M.DL2000 DNA Marker；1.PHKG1 target strip.

2.2 山羊PHKG1基因序列分析

2.2.1 氨基酸序列同源性 利用DNAMAN對不同物種PHKG1基因所編碼的氨基酸序列進行比對，顯示簡州大耳羊與綿羊(XP_027817635.1)、牛(NP_001039951.1)、豬(NP_001280073.1)、馬(XP_001493403.2)、人(AAH69655.1)的PHKG1氨基酸序列相似性依次為99%，98%，94%，96%和93%，說明該基因在不同的物種間具有較高的保守性(圖2)。

2.2.2 蛋白理化性質(zhì)分析 用ExPASy在線工具對山羊PHKG1氨基酸序列進行分析，其預測蛋白分子式為C2016H3156N544O580S18，分子質(zhì)量為44.87 ku；在氨基酸組成中，亮氨酸(Leu)含量為9.6%，是占比最高的氨基酸殘基；帶正電荷(Arg+Lys)和帶負電荷(Asp+Lys)的氨基酸殘基總數(shù)分別為50和51，表明山羊PHKG1蛋白可能帶負電荷；理論等電點(Protein isoelectric point，pI)為6.81，親水性總平均值為-0.330，不穩(wěn)定指數(shù)為45.83，因此，預測PHKG1蛋白屬于酸性親水不穩(wěn)定蛋白。磷酸化位點預測顯示，山羊PHKG1蛋白有31個磷酸化位點，其中包括絲氨酸(Ser)磷酸化位點18個，蘇氨酸(Thr)磷酸化位點10個，酪氨酸(Tyr)磷酸化位點3個。糖基化位點預測顯示，該蛋白有4個O糖基化位點，分別位于2，6，12和329位點；無N糖基化位點。山羊PHKG1蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域且無信號肽；亞細胞定位表明其主要存在于細胞質(zhì)(73.9%)中，其次為細胞核(13.0%)和線粒體(13.0%)。

黑色.同源性=100%；粉色.同源性>75%；藍色.同源性>50%；白色.同源性<50%。Black.Homology=100%；Pink.Homology>75%；Blue.Homology>50%；White.Homology<50%.

2.2.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及蛋白相互作用預測 用ExPASy預測蛋白二級結(jié)構(gòu)，顯示PHKG1蛋白有138個(35.66%)氨基酸可能形成α-螺旋(Alpha helix)，167個(43.15%)氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲(Random coil)，82個(21.19%)氨基酸可能形成延伸鏈(Extended strand)(圖3-A)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果基本一致(圖3-B)。相互作用分析顯示，PHKG1蛋白可能與CALM1、PHKA1、PYGM、PHKB、PHKG2、PHKA2和PYGL等蛋白存在相互作用(圖3-C)。

A.PHKG1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測，其中藍色豎線表示α螺旋，紅色豎線表示延伸鏈，紫色豎線表示無規(guī)卷曲；B.PHKG1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測；C.PHKG1蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡。A.The second-order structure prediction of PHKG1 protein， α-hehix indicated with the blue， extended strand indicated with the red，random coil indicated with the purple；B.PHKG1 protein tertiary structure prediction；C.PHKG1 protein interaction network.

2.3 山羊PHKG1的系統(tǒng)進化樹分析

為了研究山羊PHKG1蛋白的進化過程，用MEGA 5.0構(gòu)建進化樹。結(jié)果(圖4)顯示，山羊與綿羊首先聚為一類，親緣關(guān)系最近，因與牛同屬反芻動物聚類在同一分支，與原雞的親緣關(guān)系最遠，符合物種的進化規(guī)律。

GenBank登錄號：小鼠.NP_035209.1；大鼠.NP_113761.1；兔.NP_001095175.1；豬.NP_001280073.1；狗.XP_0222275227.1；貓.XP_023102031.1；牛.NP_001039951.1；山羊.XP_017896091.1；斑馬魚.NP_001018868.1；綿羊.XP_027817635.1；馬. XP 001493403.2；人.AAH69655.1；原雞.XP_015151218.1。

2.4 山羊PHKG1基因組織表達分析

利用qPCR方法檢測PHKG1基因在山羊各個組織中的表達水平，結(jié)果表明，PHKG1基因在所檢測的7個組織中均有表達，以背最長肌中的表達最高，極顯著高于其他的組織(P<0.01)，在皮下脂肪、腎、心、肝、肺和脾組織表達量相對較低，組織間差異不顯著(圖5)。

不同大寫字母表示數(shù)據(jù)間差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6同。

2.5山羊PHKG1基因時序表達分析

qPCR檢測PHKG1基因在山羊肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞分化不同階段的相對表達水平。結(jié)果表明，在肌內(nèi)前體脂肪細胞分化過程中該基因的相對表達水平呈上升-下降-上升-下降的趨勢，在60 h時達最高，顯著高于0 h(P<0.05)(圖6-A)；在皮下前體脂肪細胞的時序表達中，該基因的相對表達水平先維持穩(wěn)定且均處于較低水平，在48～96 h相對表達量升高，96 h時表達量極顯著高于前期表達量(P<0.01)(圖6-B)。

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)與糖原分解有關(guān)的PHKG1基因功能喪失，導致糖原分解酶的缺乏，從而導致豬的糖原累積病(Glycogen storage disease，GSD)，而消除該基因的不良突變將大大降低GSD的發(fā)病率并改善豬肉質(zhì)量[13]，因此，該基因在動物肉質(zhì)研究中被引起重視。為了闡明山羊PHKG1基因特性，本研究克隆獲得包括完整CDS的PHKG1基因序列，經(jīng)蛋白質(zhì)相互作用預測發(fā)現(xiàn)，其與CALM1、PHKA1、PYGM、PHKB、PHKG2、PHKA2和PYGL等蛋白可能存在相互作用。PHK的α亞基具有調(diào)控作用，其中磷酸化酶激酶α1(Phosphorylase kinase α1，PHKA1)基因編碼肌肉組織特異表達的αM型，PHKA2基因編碼肝臟特異表達的αL型；PHKB基因編碼其β亞基；CALM1、CALM2和CALM33個基因共同編碼的δ亞基為鈣調(diào)節(jié)蛋白，可以在不同 Ca2+濃度的條件下調(diào)節(jié)酶活性[14-16]。Bali等[17]報道，由PHKA2、PHKB和PHKG2基因的突變引起的PHK缺乏是糖原貯積病(糖原貯積病Ⅸ型)最常見的原因之一。糖原磷酸化酶(PYGM)通常以去磷酸化狀態(tài)存在而不具活性，在PHK和鈣離子存在時，被磷酸化而獲得活性[18-19]。而PYGM基因缺陷可引起人類Ⅹ型糖原貯積病[20]。對PHKG1超表達后，檢測到PHKG2和磷酸甘油酸變位酶基因(PGAM2)表達量亦上調(diào)[21]。綜上所述，本試驗預測的蛋白質(zhì)互作的結(jié)果輔證了PHKG1參與糖原代謝。

A.PHKG1在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量；B.PHKG1在山羊皮下前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量。A .The relative expression of PHKG1 during the differentiation of intramuscular preadipocytes in goat；B. The relative expression of PHKG1 during the differentiation of subcutaneous preadipocytes in goat.

前人對多個物種間PHK家族基因進行了研究，結(jié)果表明，其家族成員在多種動物以及人的組織中存在廣泛表達[8，22]。為探究該基因是否在山羊各組織中廣泛表達，本試驗構(gòu)建了山羊PHKG1基因組織表達圖譜，結(jié)果表明，PHKG1在山羊的心、肝、脾、腎、肺、背最長肌、皮下脂肪組織中均有表達，并且在背最長肌中相對表達量最高，其次為皮下脂肪，說明PHKG1在山羊的各組織中廣泛表達且具有組織特異性。糖原主要集中于肝臟和肌肉[23]，肌肉對維持機體運動時的血糖平衡起著重要作用[24]，運動時肌漿網(wǎng)釋放的鈣離子可變構(gòu)激活PHK，使磷酸化酶b轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牧姿峄竌[25-26]。王圓圓[21]發(fā)現(xiàn)，PHKG1在從江香豬和大白豬背最長肌組織中的表達量最高，在脂肪中的表達量較高，在其他組織中表達水平較低，與本研究結(jié)果類似。綜合以上推測PHKG1基因在動物肌肉組織糖原代謝中發(fā)揮重要作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)，PHKG1在肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞分化過程中的表達模式有區(qū)別，可能是由于皮下脂肪位于真皮之下，肌內(nèi)脂肪位于肌纖維之間，二者所處的部位和發(fā)育環(huán)境不同[27]，且皮下脂肪為儲能組織，而肌內(nèi)脂肪多與肉質(zhì)性狀相關(guān)[28]，屬功能性組織，另外在豬中的研究證明，不同部位脂肪沉積具有明顯的時序性和組織特異性，肌內(nèi)脂肪的沉積晚于皮下脂肪[29]。本研究還發(fā)現(xiàn)，PHKG1基因在誘導分化后第60小時的肌內(nèi)脂肪細胞和誘導分化后第96小時的皮下脂肪細胞內(nèi)表達水平分別顯著和極顯著高于分化前表達水平，推測該基因可能具有促進分化的作用。隨著前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，糖代謝水平也發(fā)生改變，細胞會攝取利用葡萄糖為維持正常生命活動提供能量，亦通過轉(zhuǎn)化作用生成甘油三酯的合成底物[30]如丙酮酸、乙酰輔酶A(CoA)和3-磷酸甘油等。因此，PHKG1基因可能通過對糖原代謝的調(diào)控而在山羊脂肪細胞分化過程起重要作用，但如果要全面深入的闡明PHKG1基因?qū)ι窖蛑炯毎只恼{(diào)控作用則需要進一步進行功能研究。

本試驗克隆得到山羊PHKG1基因CDS全長1 164 bp，編碼387個氨基酸，無跨膜結(jié)構(gòu)、無信號肽且主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。PHKG1基因在山羊背最長肌中表達最高，在分化后的脂肪細胞中的表達水平顯著高于未分化的前體脂肪細胞。