楊小玲，仝雅娜，華明艷，宋蘭芳，馬洪英，張淑香

(1.天津農(nóng)業(yè)科學院，天津 300192；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081)

為追求高產(chǎn)高效，設施蔬菜復種指數(shù)高和施肥過量等問題普遍存在，多數(shù)設施土壤已出現(xiàn)了不同程度的酸化或次生鹽漬化現(xiàn)象，生態(tài)平衡受到嚴重的破壞，同時也誘導了病蟲害頻發(fā)，使產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1-3]。王麗英等[4]調(diào)研設施蔬菜肥料管理現(xiàn)狀時發(fā)現(xiàn)，盡管我國多省市的設施蔬菜土壤中普遍存在鹽漬化和板結等問題，但生產(chǎn)中仍采用盲目施肥方式，使施肥量遠遠超過蔬菜的養(yǎng)分吸收量[5]。因此，開展不同養(yǎng)分水平的土壤施肥技術研發(fā)和推廣，推動化肥零增長工作，對于提高我國土壤質(zhì)量綜合管理水平，保障設施土壤的可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。在農(nóng)作物單位面積化肥施用量上，黃瓜排列第三[6]，所以在設施黃瓜生產(chǎn)中如何合理施肥值得我們進行研究。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，也是衡量土壤質(zhì)量的重要指標[7]。隨著土壤環(huán)境破壞和污染問題的日益突出，微生物菌劑的研究與應用成為當前熱點之一。在功能上，微生物菌劑可分為拮抗病菌型、促生型和分解養(yǎng)分型的3種類型[7-8]。研究表明，微生物菌劑具有提高土壤肥力、增加土壤微生物菌群數(shù)量、抑制病原菌繁殖、增強植株抗病性、增產(chǎn)提質(zhì)等作用[9-11]。在應用方法上，主要有菌劑發(fā)酵有機肥形成微生物有機肥用作基肥、固態(tài)菌劑基施定植穴、化肥與菌液配合施用以及葉面噴施發(fā)酵活性菌液4種方法，有關在高肥力土壤用微生物菌液替代化肥進行追肥的生產(chǎn)實踐鮮有報道。蔡-18菌是放線菌、酵母、芽孢菌桿菌、醋酸桿菌等組成的復合菌群，是引進臺灣中興大學蔡東纂教授研發(fā)了18 a的菌種(稱蔡-18菌)，本研究在土壤肥力高(有機質(zhì)54.9 g/kg、有效磷574.05 mg/kg、速效鉀1 161.3 mg/kg)的溫室中，研究蔡-18菌發(fā)酵液替代化肥追肥對黃瓜產(chǎn)量、品質(zhì)和根際微生物菌群結構、土壤養(yǎng)分的影響，以期為老菜田土壤的修復和減肥生產(chǎn)技術提供方法，保障設施土壤的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗品種為德瑞特種業(yè)有限公司的博耐30油亮型黃瓜。

蔡-18菌液是天津設施農(nóng)業(yè)研究所葡萄中心從臺灣中興大學引進，以豆?jié){為有機載體經(jīng)過菌種擴繁與發(fā)酵形成，經(jīng)檢測，發(fā)酵液pH值4.12，有效活菌數(shù)﹥1×108個cfu/mL，游離氨基酸181.11 μmol/L、有機質(zhì)1.24%、全氮0.39%、全磷0.12%、全鉀0.14%，以及多胺類物質(zhì)3 078 ng/mL，IAA 784 ng/mL、GA33.8 ng/mL、ABA 3.3 ng/mL等次生物代謝產(chǎn)物等多種營養(yǎng)物質(zhì)。

化肥為煙臺浩林生物肥料有限公司銷售的貴和大量元素水溶肥(N∶P∶K=20∶20∶20)和以色列海法保力豐2號水溶性肥(N∶P∶K=16∶8∶34)。

1.2 試驗設計

試驗在天津市武清區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地日光溫室內(nèi)進行，該溫室已經(jīng)連續(xù)種植番茄與黃瓜6 a，為2 a輪作一次。種植前施用有機肥37.5 t/hm2，施有機肥后旋地做畦，隨機采取試驗地土樣，分析土壤養(yǎng)分。其中全氮：3.91 g/kg，全磷：2.80 g/kg，全鉀：18.38 g/kg，水解氮：283.55 mg/kg，有效磷：574.05 mg/kg，速效鉀：1161.3 mg/kg，有機質(zhì)為54.9 g/kg。

3月1日定植，行株距為90 cm×30 cm，4月1日始收黃瓜，并在采收后第一次追肥，7月16日拉秧。全生育期采用滴灌澆水，3月份每3～4 d澆一次水，4月份以后每2～3 d澆一次水。7～10 d隨澆水追肥。

田間設置3種追肥處理，處理1：滴灌追施水溶性肥(WSF)，全生育期追施1 275 kg/hm2水溶性肥，其中貴和大量元素水溶肥(N∶P∶K=20∶20∶20)213 kg/hm2，以色列海法保力豐2號高鉀肥(N∶P∶K=16∶8∶34)1 062 kg/hm2，經(jīng)計算，純N用量為212.7 kg/hm2，P2O5用量93.6 kg/hm2，K2O用量 363.3 kg/hm2。處理2：滴灌追施蔡-18菌液(Cai-18)，全生育期共施3.552 m3/hm2，根據(jù)菌液營養(yǎng)成分含量分析，追施純N用量為13.85 kg/hm2，P2O5用量4.26 kg/hm2，K2O用量4.97 kg/hm2。處理3：對照(CK)，不追施肥料及其他物質(zhì)，僅澆水。每處理重復3次，區(qū)組隨機排列，小區(qū)面積26.72 m2。

1.3 試驗方法

Miseq高通量技術分析根際土壤微生物多樣性：隨機收集黃瓜拔秧后根系新鮮土壤樣本，送北京奧維森基因科技有限公司分析根際微生物的多樣性。土壤樣本通過DNA提取、擴增16S V3-V4和ITS1區(qū)域PCR擴增、熒光定量、Miseq文庫構建和Miseq上機測序、對原始數(shù)據(jù)進行過濾處理后進行序列拼接，得到優(yōu)化序列后去除嵌合體序列，然后進行97%序列相似度OTU聚類分析，用Alpha多樣性指數(shù)分析樣本的種群豐度、多樣性，并計算不同菌群的相對含量。

土壤養(yǎng)分分析：定植之前隨機采取0～20 cm混合土壤樣品和拔秧后隨機采取植株生長位置0～20 cm的混合土壤樣品，送天津市農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所土壤養(yǎng)分分析中心測定。有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀-硫酸加熱消化法測定；用濃硫酸消化-凱氏定氮法測定全量氮，氫氧化鈉堿融、鉬藍比色法測定全磷和火焰光度計測定全鉀；采用擴散吸收法測定水解氮，采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-硫酸鉬銻抗比色法測定有效磷，采用1 mol/L NH4OAC浸提-火焰光度計法測定速效鉀[12]。

果實質(zhì)地測定：每處理每次重復取6根黃瓜，取果實中段用TA.XT.Plus質(zhì)構儀測定果實彈性、果皮硬度、果肉硬度等質(zhì)地性質(zhì)。果實可溶性糖用蒽酮法測定[13]。

果實香氣測定：采用氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)法測定，利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(HS-SPME-GCMS) 分析。所用試劑為無水乙醇和2-辛醇。GC-MS色譜條件：載氣(高純氦氣)純度≥99. 999%，流速1.0 mL/min，分流比為5∶1；升溫程序：35 ℃保持 2 min，以4 ℃/min 升至 200 ℃，以30 ℃/min 升至250 ℃，保持5 min；進樣口溫度：250 ℃。質(zhì)譜檢測條件：離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電子轟擊源70 eV；掃描范圍30～300 amu。定性分析：對檢測的揮發(fā)性成分通過未知物分析軟件(美國 Agilent 公司)與 NIST 11． L譜庫(美國Agilent 公司)提供的標準譜圖進行匹配，如果匹配因子大于80(最高 100)，通過相同GC-MS 條件下標準品的保留時間和質(zhì)譜圖進一步比對確認。香氣相對含量=單個物質(zhì)峰面積×100%/峰總面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與繪圖，用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析、LSD進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對黃瓜產(chǎn)量的影響

從表1可以看出，對照CK在黃瓜生長期間沒有投入肥料，但收獲黃瓜產(chǎn)量106.6 t/hm2，表明土壤肥力高；WSF和Cai-18 2種處理之間產(chǎn)量差異不顯著，比CK分別提高了6.21%和6.59%，達到了5%顯著差異水平。根據(jù)Cai-18菌液和WSF所含N、P、K含量計算，Cai-18處理氮、磷、鉀的用量比WSF處理分別減少了93.48%，95.44%，98.63%。按每1 000 kg黃瓜計算，WSF處理氮、磷、鉀用量分別是Cai-18處理的15.4，21.8，73.0倍。Cai-18處理施入土壤的氮、磷、鉀含量極少，但其產(chǎn)量與WSF處理無顯著差異。因此，在高肥力土壤，Cai-18菌液具有較好的增產(chǎn)作用。

表1 不同處理純N、P、K施用量和黃瓜產(chǎn)量Tab.1 Pure N，P and K application amount and cucumber yield in different treatment

2.2 不同肥料處理對黃瓜品質(zhì)的影響

從表2可以看出，不同處理的黃瓜果皮硬度、果皮韌性和果肉硬度、果肉粘附性等質(zhì)地指標差異不顯著，但CK的可溶性糖含量顯著低于其他2種處理。

圖1表明了3種處理的果實香氣成分，3種處理在24 min前峰值差別不明顯，24 min后有一定的差別。酯類物質(zhì)是香氣主要成分之一，WSF處理在24 min后出現(xiàn)2種酯類物質(zhì)，其他2種處理分別檢出4種酯類物質(zhì)，但4種酯類物質(zhì)不完全相同。在相對含量上，Cai-18處理的酯類物質(zhì)相對含量分別是WSF、CK處理的1.69，1.50倍。3種處理在27～28 min均出現(xiàn)了半萜類香氣物質(zhì)蛇麻烯(Humulene，C15H24)，WSF和Cai-18處理的相對含量分別為0.012%和0.013%，是CK的1.4倍。

Cai-18處理的黃瓜可溶性糖含量較高，酯類香氣物質(zhì)多，酯類和半萜類香氣物質(zhì)的相對總含量最高，口感風味好。因此，Cai-18菌液提高了黃瓜品質(zhì)。

表2 不同肥料處理對黃瓜品質(zhì)的影響Tab.2 Effect of different fertilizer treatments on cucumber quality

圖1 不同肥料處理對黃瓜香氣物質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different fertilizer treatments on aroma substances of cucumber

2.3 不同處理對根際土壤細菌菌群豐富度、多樣性與結構均衡性的影響

Miseq高通量技術分析3種處理根際土壤細菌菌群多樣性指數(shù)見表3。OTU分組數(shù)以序列97%相似度分為一組，Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)越大表明菌種豐富度和群落多樣性越高。從表3可以看出，不同處理土壤樣本的細菌樣品庫覆蓋率在98%～99%，被測出細菌的堿基序列很高。3種處理的OTU分組數(shù)、Chao 1和Shannon指數(shù)比較：Cai-18處理>CK>WSF處理，但差異不顯著。因此，Cai-18菌液處理可提高根際土壤細菌菌群的豐富度和菌落多樣性，土壤微生物向“細菌型”轉化。

施肥影響根際土壤細菌不同菌群的相對含量。從表4可以看出，根際土壤細菌菌群在門分類水平上，按菌群豐富度分成5類，分別為優(yōu)勢菌群(>35%)、大量菌群(11%～30%)、中量菌群(5%～10%)、少量菌群(1%～4%)和其他微量菌群(<1%)。在優(yōu)勢菌群上，CK的變形菌門(Proteobacteria)相對含量顯著高于WSF處理，Cai-18處理與其他2種處理差異不顯著。在大量菌群上，WSF處理的酸桿菌門(Acidobacteria)相對含量顯著高于其他2種處理。Miseq高通量微生物多樣性分析將介于細菌和絲狀真菌而更接近細菌的放線菌原核微生物劃分為細菌類型，因此中量菌群包括綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)4種菌群。Cai-18處理的中量菌群相對含量總和比WSF處理和CK分別高11.45，8.48百分點，其中，綠彎菌群含量顯著高于其他2種處理，擬桿菌群含量顯著高于WSF處理，與CK差異不顯著；在具有抗病特性的菌群上，WSF處理的放線菌群含量顯著低于其他2種處理，芽單胞菌群相對含量差異不顯著。少量菌群包括4種菌群，3種處理的少量菌群相對含量總和分別為6.6%，4.5%，4.8%，沒有顯著差異，且除厚壁菌外單個菌群之間的相對含量也沒有顯著差異。3種處理的其他微量菌群相對含量在2.37%～2.64%，差異也不顯著。因此，追施Cai-18生物菌液可以降低根際大量菌群的含量，提高中量菌群含量，使門分類水平上的菌群數(shù)量結構均衡。CK優(yōu)勢菌群含量過多，菌群的數(shù)量結構均衡性比Cai-18處理差。

表3 不同處理對根際土壤細菌豐度和多樣性的影響Tab.3 Effect of different treatments on bacterial abundance and diversity in rhizosphere soil

表4 不同處理根際土壤門分類水平不同細菌菌群相對含量 Tab.4 Relative content of bacterial flora at phylum-level of rhizosphere soil in different treatments %

2.4 不同處理對根際土壤真菌豐富度、多樣性與均衡性的影響

不同處理對根際土壤真菌多樣性指標影響見表5。由表5可見，OTU分組數(shù)為WSF處理>CK>Cai-18處理，Chao 1指數(shù)WSF處理最高，其次為Cai-18;Shannon指數(shù)為CK>WSF處理>Cai-18處理，但各指標在處理間差異均不顯著。因此，WSF處理和CK的根際土壤真菌豐富和多樣性比Cai-18處理高，進一步表明施用蔡-18菌劑土壤微生物向“細菌型”優(yōu)化。

在門分類水平上，3種處理根際土壤檢測出6類真菌菌群。其中，子囊菌門(Ascomycota)占89%以上，其他5種菌群相對含量均<5%，很難判斷不同處理根際土壤真菌菌群在數(shù)量結構上的差異。在目分類水平上，3種處理分別檢測出23，22，23個目分類級菌群。從表6可以看出，根際土壤的真菌菌群以糞殼菌目(Sordariales)為主，WSF處理顯著提高糞殼目菌群數(shù)量，其相對含量超過總數(shù)的50%；肉座菌目(Hypocreales)是根際土壤的第二大類菌群，Cai-18處理的相對含量比其他2種處理高，但差異不顯著。WSF處理和Cai-18處理的其他菌群相對含量均低于10%，其中，WSF處理后相對含量在5%～10%的菌群有2種，Cai-18處理有3種。CK不同菌群相對含量較均衡，糞殼菌目數(shù)量最多，其相對含量不足28%，相對含量10%～20%的菌群有3種，5%～10%的菌群也有3種。說明CK真菌菌群數(shù)量結構均衡性>Cai-18處理>WSF處理。

因此，追肥降低根際土壤真菌數(shù)量結構的均衡性，但追施Cai-18菌液比追施化肥均衡性更好。

2.5 不同處理對土壤養(yǎng)分含量的影響

從表7可以看出，在多年培肥和施肥條件下，連續(xù)種植6 a果類蔬菜設施土壤養(yǎng)分含量大幅度增加，其中土壤有機質(zhì)含量是大田土壤(建造溫室前)的2.97倍，水解氮、有效磷、速效鉀含量分別是大田土壤的4.8，133.8，4.4倍，有效磷和速效鉀的含量已遠遠超出了蔬菜正常生長的土壤養(yǎng)分參考值，表明當前設施蔬菜施肥過量和設施土壤養(yǎng)分狀況失衡的現(xiàn)象十分嚴重，需要改善現(xiàn)有的施肥模式。

表5 不同處理對根際土壤真菌豐度和多樣性指標的影響Tab.5 Effect of different treatments on fungi abundance and diversity in rhizosphere soil

表6 不同處理目分類水平不同真菌菌群相對含量Tab.6 Relative content of fungi flora at order-level of rhizosphere soil in different treatments %

由表7可知，在氮、磷、鉀養(yǎng)分富積的土壤上生產(chǎn)單季黃瓜(135 d)，與定植前土壤養(yǎng)分相比，3種處理根際土壤的全鉀、全磷含量變化不顯著，而全氮、水解氮、有效磷、速效鉀和有機質(zhì)含量顯著下降，其中，水解氮降幅30%左右，有效磷降幅49%～59%，速效鉀降幅29%～54%。不同處理間的全氮、水解氮和有機質(zhì)含量差異不顯著，而有效磷和速效鉀含量差異顯著，其中，CK有效磷和速效鉀含量比其他2個處理分別低24.30，33.4 mg/kg和285.70，144.85 mg/kg，達到了顯著差異水平；WSF處理和Cai-18處理有效磷含量差異不顯著，但前者速效鉀含量比后者高140.85 mg/kg，達到5%的顯著水平。

表7 不同處理對土壤養(yǎng)分含量的影響Tab.7 Effect of different treatments on soil nutrient content

3 討論與結論

土壤微生物群落的變化不僅受地上部植物種類、品種、氣候條件的影響，也受地下管理措施的影響[14]。秦越等[15]研究表明，隨著馬鈴薯連作年限的增加，根際土壤細菌多樣樣水平降低，真菌多樣性水平升高，土增微生物生態(tài)環(huán)境惡化。吳斌等[16]發(fā)現(xiàn)，小麥黃花葉病毒病發(fā)病嚴重地塊的真菌種類增加。長期施用微生物發(fā)酵的有機肥可改善土壤理化性狀，提高土壤中速效養(yǎng)分含量，增加土壤微生物數(shù)量和酶活性，特別是增加有益菌數(shù)量，抑制病菌繁殖[9，17]。陳文等[18]研究表明，施用生物有機肥或EM菌劑配施化肥比施純化肥的土壤微多樣性更高、均一度更好。本研究結果表明，追施蔡-18生物菌液提高根際土壤細菌的豐富度和多樣性，降低真菌的豐富度和多樣性，且菌群數(shù)量結構的均一度得到了較好的改善，促進土壤微生物向“細菌型”土壤優(yōu)化。李維炯[19]、楊宇虹等[20]認為施生物菌肥提高土壤放線菌含量，與本研究追施蔡-18菌液所獲得的結果一致；楊宇虹等[20]認為追施化肥的土壤放線菌含量比不施肥處理高，而本研究不追肥處理比追施化肥處理的土壤放線菌含量提高38%，達到了顯著差異。因此，追施蔡-18菌液改善了根際土壤微生物生態(tài)環(huán)境。

當土壤有機質(zhì)>30 g/kg、堿解氮>160 mg/kg、有效磷>130 mg/kg、速效鉀>250 mg/kg時，土壤被視為高肥力水平[21-22]。肖國勝等[23]認為土壤有效磷含量>130 mg/kg時，蔬菜生產(chǎn)當季可以不施無機磷肥。赫新洲等[24]認為土壤速效鉀含量大于225.4 mg/kg時，不施鉀肥不會降低菜心的產(chǎn)量。本研究的土壤有效磷、速效鉀含量分別是高肥力土壤推薦值的4.4，4.65倍，盡管沒有追化肥或生物菌液可收獲106.6 t/hm2的產(chǎn)量，但仍顯著低于施化肥處理和施生物菌液處理的產(chǎn)量。楊猛等[25]研究表明，EM菌堆肥可提高黃瓜根系鮮質(zhì)量、側根數(shù)和根系活動。本研究經(jīng)檢測到，蔡-18菌發(fā)酵液含有游離氮基酸、植物激素和精胺、亞精胺、腐胺類物質(zhì)等營養(yǎng)成分，這些物質(zhì)具有促進根系和植株生長的作用。筆者認為追施蔡-18菌液可通過菌液中的營養(yǎng)物質(zhì)刺激植株根系生長旺盛，形成根深苗壯的生長態(tài)勢，不僅能吸收表層土壤的礦質(zhì)營養(yǎng)，而且能利用深層土壤礦質(zhì)營養(yǎng)；同時，蔡-18菌發(fā)酵液含有多種活性功能菌和有機酸(pH值4.12)，均有溶磷解鉀的作用，使根區(qū)有效磷和速效鉀含量增加；不追肥對照處理根系較淺，所吸收的礦質(zhì)營養(yǎng)主要來自表層0～20 cm土壤，這可能是導致了不追肥對照處理0～20 cm土壤有效磷和速效鉀含量顯著低于追施蔡-18菌發(fā)酵液處理，具體原因有待進一步驗證。

黃瓜盛瓜期營養(yǎng)生長與生殖生長同時進行，需肥量較大，當植株生長期達100 d左右，根系開始逐漸衰退，根量減少，此時養(yǎng)分不足極易導致植株早衰。筆者認為少量多次追施化肥，特別是結瓜后期及時追肥或補充功能性營養(yǎng)可以促進根系生長，防止植株早衰，提高產(chǎn)量。本試驗在盛瓜后期將追施化肥處理的高鉀肥(N∶P∶K=16∶8∶34)改為追施平衡肥(N∶P∶K=20∶20∶20)1～2次，以提高肥料氮、磷含量，促進根系的生長，防止早衰。而蔡-18菌發(fā)酵液中含有促根生長所需的功能營養(yǎng)，如氨基酸181.11 μmol/L、多胺類物質(zhì)3 078 ng/mL、IAA 784 ng/mL、GA33.8 ng/mL等，也可較好地促進根系生長與更新，使之達到防止早衰、提高產(chǎn)量的目的。楊猛等[25]研究表明，施用EM菌發(fā)酵有機肥能顯著提高大棚黃瓜產(chǎn)量和果實VC含量，但不影響可溶性糖含量。張敏碩等[26]研究表明，微生物菌劑顯著提高馬鈴薯VC、可溶性蛋白和可溶性糖含量，改善品質(zhì)。張佼等[27]研究表明，有機肥+復合肥+微生物菌劑可以增強土壤肥料利用率，促進番茄光合作用及干物質(zhì)積累，最終提高果實產(chǎn)量和品質(zhì)(果實可溶性總糖、維生素C、還原糖質(zhì)量分數(shù)分別提高62.50%，21.30%，97.31%)。本研究從影響黃瓜口感的質(zhì)地指標和香氣味覺指標研究蔡-18菌發(fā)酵液對黃瓜品質(zhì)的影響，結果表明，追施菌發(fā)酵液后果實的可溶性糖、香氣成分及其含量提高，產(chǎn)量與追施化肥效果相同。筆者在金蜜龍?zhí)鸸仙a(chǎn)中進一步驗證了追施蔡-18菌發(fā)酵液具有增產(chǎn)提質(zhì)的作用，所獲得的結論與黃瓜一致。

綜合而言，在肥力高的土壤中追施蔡-18菌液改善根際土壤微生物生態(tài)環(huán)境，緩解過量施肥導致的根區(qū)土壤養(yǎng)分狀況失衡問題，營造根系良好的生態(tài)環(huán)境，提高作物產(chǎn)品品質(zhì)與產(chǎn)量。因此，在高肥力設施土壤生產(chǎn)兩茬蔬菜，推薦至少可以有一茬蔬菜生產(chǎn)用蔡-18菌液替代化肥進行追肥。