羅 建，張國斌，車旭升，秦啟杰

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

抗壞血酸 (Ascorbic acid，AsA) 又稱維生素C (Vitamin C，Vc) ，1932年首次從植物和哺乳動物來源中分離出來[1-2]。植物體內(nèi)廣泛存在的高豐度小分子物質(zhì)，在高等植物的不同細(xì)胞中，都含有一定濃度的AsA，例如線粒體和葉綠體為10～300 mmol/L。AsA是植物體內(nèi)不可缺少的輔酶和抗氧化劑[3]，與植物生長發(fā)育代謝[4]、植物對逆境脅迫的抗性[5-7]以及參與乙烯和赤霉素等一些植物激素的生物合成密切相關(guān)[8]。由于人體內(nèi)無法合成AsA[9]，植物中天然的AsA與其他植化成分的互作效應(yīng)，是人類最好的AsA來源[10-11]。

目前研究中，L-半乳糖途徑 (Smirnoff-Wheeler途徑) 是高等植物中最早被發(fā)現(xiàn)和公認(rèn)的AsA生物合成主要途徑[12-13]。在該途徑中，GDP-甘露糖-3′，5′-差向異構(gòu)酶 (GDP-mannose-3′，5′-epimerase，GME)分別在2個方向進(jìn)行著反應(yīng)，分別形成GDP-L-半乳糖和GDP-L-古洛糖[14]，這是在糖核苷水平上植物抗壞血酸生物合成的第一步。GME已從擬南芥中純化和克隆[15]。GME酶含有NAD結(jié)合域，因此，被氧化的煙酰胺核苷酸(NAD+和NADP+)催化，被其還原形式(NADH和NADPH)抑制，將酶活性與細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)聯(lián)系起來。該酶活性還受GDP1，GDP-D-海藻糖、AsA抑制[16]。此外，Wolucka等[17]在純化GME試驗中，重組和天然酶都與熱激蛋白Hsp70(分別為擬南芥Hsc70.3和大腸桿菌His和GST)發(fā)生共純化現(xiàn)象，推測擬南芥Hsp70蛋白可能參與GME的折疊與調(diào)節(jié)。Valpuesta等[18]認(rèn)為熱激蛋白Hsp70與GME的共純化在一定程度上說明這種相互作用是植物在逆境條件下的一種調(diào)控機制。但如何調(diào)節(jié)GME活性未見報道。GME屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族中的一個成員。Running等[19]在擬南芥細(xì)胞懸浮培養(yǎng)試驗證明了抗壞血酸合成的“瓶頸”剛好發(fā)生在D-甘露糖和L-半乳糖之間，由于具有較低的Vmax值，該酶又被認(rèn)為是抗壞血酸生物合成的限速酶。Wolucka等[20]通過茉莉酸甲酯調(diào)控GME轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而使擬南芥和煙草BY-2懸浮細(xì)胞中AsA含量增加。Watanabe等[21]對水稻GME基因OsGME進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)水稻GME基因與擬南芥GME基因氨基酸序列同源性達(dá)到91%，同樣含有NAD結(jié)合域。Du等[22]對水稻進(jìn)行低溫誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，GME受低溫誘導(dǎo)。OsGME1、OsGME2在根莖葉中表達(dá)量都很高，但是在發(fā)育的種子中表達(dá)量很低，而且GA可能通過調(diào)控GME轉(zhuǎn)錄來影響AsA含量。同樣在Cui等[23]的試驗中也有同樣發(fā)現(xiàn)，在寒冷脅迫的水稻幼苗中GME含量積累增加。Zhang等[24]在番茄中過表達(dá)SlGME1和SlGME2基因后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)抗壞血酸含量顯著提高，且對環(huán)境脅迫的抵御能力也有著一定程度增加。Ma等[25]在研究脅迫對擬南芥影響時發(fā)現(xiàn)，植株體內(nèi)過表達(dá)GME基因有助于其對抗氧化能力的提升。Liu等[26]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓中GME基因的高表達(dá)使得果實中AsA含量上升。鄒禮平[27]利用RFLP方法將GME2基因定位在9-J區(qū)域。Stevens等[28]對3個不同番茄種群利用QTL對番茄果實AsA進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)3個群體有共同的QTL位點9-J，說明GME2與抗壞血酸含量有密切關(guān)系。作為AsA生物合成中的限速酶，GME基因的表達(dá)將是調(diào)節(jié)AsA水平的良好候選者。

目前，AsA生物合成機制主要集中在擬南芥[29]和煙草[30]等模式植物中，在辣椒中還尚未有關(guān)于GME基因的研究報道。本研究報道了2種辣椒GME基因，分別命名為CaGME1和CaGME2。通過對辣椒GME基因家族生物信息學(xué)分析以及不同脅迫處理下GME基因表達(dá)特性研究，為辣椒逆境脅迫機制和GME基因的特征研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育地方日光溫室主栽品種隴椒5號為供試材料。各差異脅迫處理在辣椒幼苗期真葉生長有6片以上展開葉時進(jìn)行。

脅迫處理：采用100 μmol/L赤霉素 (Gibberellin，GA3) 、200 μmol/L茉莉酸甲酯 (Methyl jasmona，MeJA) 和300 mmol/L NaCl分別噴灑辣椒葉片的正反面，以噴灑超純水為對照；對辣椒葉片進(jìn)行低溫 (Cold) 處理，光照培養(yǎng)箱的溫度降至4 ℃ (晝) /0 ℃ (夜) ；對照組白天溫度設(shè)置為28 ℃，晚上設(shè)置為26 ℃[31]。各種脅迫處理下的辣椒植株在光照強度為200 μmol/(m2·s) 的氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，光照周期分別為12 h的光照和12 h的暗處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 總RNA的提取：辣椒幼苗期真葉中總RNA的提取按照E.Z.N.A Plant RNA Kit試劑盒的說明書進(jìn)行。

RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的步驟：以mRNA為模板，使用試劑盒為TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) ，使用過程中嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.2 辣椒GME家族基因成員的檢索 根據(jù)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫( https://www.arabidopsis.org)中獲得的GME基因的編碼序列，以獲得的CDS為目標(biāo)序列，利用茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫(https：//solgenomics.net)中的BlastN程序?qū)υ撔蛄羞M(jìn)行搜索，獲取該片段序列在茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列的基因號、CDS及氨基酸序列，以確定其為GME基因家族的成員。

1.2.3 辣椒GME家族基因生物信息學(xué)分析 辣椒GME基因的各種理化特性通過ProtParam[32](http：//expasy.org/tools/protparam.html)在線計算。SignalP 4.1 Server 分析信號肽；ProtScale分析親水性/疏水性；TMHMM對蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測。WoLF PSORT(http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html)對亞細(xì)胞定位分析[33]。MEME進(jìn)行全長蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測。利用FGENESH-C[34]對得到的目的序列進(jìn)行內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)框架分析。采用Prabi在線對GME基因的二級結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行預(yù)測研究。通過PlantCARE軟件對辣椒GME基因的啟動子進(jìn)行分析整理。MEGA 5.0[35]和ClustalX[36]軟件對辣椒GME蛋白進(jìn)行分析比對繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 辣椒GME家族基因的qRT-PCR表達(dá)分析 提取辣椒幼苗期葉片RNA；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒除DNA純化以及反轉(zhuǎn)錄為cDNA；利用Primer premier 5.0設(shè)計引物，以辣椒Actin基因為內(nèi)參，應(yīng)用Bio-Rad iCycler iQ實時定量PCR儀，以不同脅迫處理下辣椒幼苗期葉片cDNA為材料，對不同脅迫處理辣椒GME基因家族進(jìn)行特異性表達(dá)分析。

qRT-PCR 反應(yīng)體系：含12.5 μL的SYBR Green Supermix，1.5 μL的 cDNA，0.5 μL的 10 μmol/L目的基因上下游引物，10.5 μL 的雙蒸水，體系總共 25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計算[36]。

熒光定量PCR所用引物序列見表1。

表1 辣椒GME基因家族表達(dá)分析的實時熒光定量引物Tab.1 qRT-PCR primers for expression on analysis of GME

1.2.5 統(tǒng)計分析與作圖 所有試驗均設(shè)3次生物重復(fù)，數(shù)據(jù)測定結(jié)果采用SPSS軟件Duncan多重比較法進(jìn)行方差分析，采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒GME基因家族信息及蛋白理化性質(zhì)分析

利 用 ProtParam 對2個CaGMEs基因家族成員進(jìn)行分析，結(jié)果表明：CaGME1和CaGME2基因分別定位于第3和第8染色體上，基因大小分別為4 170，2 730 bp，分別編碼376，375 aa，對應(yīng)的蛋白相對分子質(zhì)量分別為42 544.35，42 378.23 ku，等電點分別為6.05和6.04，均分別有6個外顯子(表2)。

表2 辣椒GME基因家族信息及理化性質(zhì)Tab.2 Physical and chemical property of CaGME

2.2 辣椒GME蛋白的親水性/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位

通過SignalP 4.1 Server軟件對CaGME蛋白所含有的信號肽預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，2個GME蛋白均不具有信號肽，因此，這2個蛋白都不屬于分泌蛋白類型。

利用ProtScal軟件對2個CaGMEs蛋白成員進(jìn)行親水性/疏水性的預(yù)測，結(jié)果(圖1)表明，CaGME1和CaGME2中多肽鏈不同位置(CaGME1為64和36位，CaGME2為63和35位)出現(xiàn)親水性和疏水性最強的氨基酸都相同分別是精氨酸(Arg)和異亮氨酸(Ile)且分值大小相近，親水性氨基酸在整條肽鏈中分布較整體來說相對均勻，且數(shù)目遠(yuǎn)大于疏水性氨基酸，故推測CaGME蛋白為親水性蛋白。這與根據(jù)平均疏水值預(yù)測的結(jié)果一致(CaGME1為-0.464， CaGME2為-0.430)。說明GME整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，但是沒有明顯的親水區(qū)域。

使用TMHMM對CaGMEs基因家族成員進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測得到這2個GME蛋白沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，都不屬于跨膜蛋白。

對CaGMEs蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測表明(表3)，CaGME1和CaGME2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)粒中均有表達(dá)，CaGME2在細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)。這2個蛋白在細(xì)胞質(zhì)粒中的得分最高，推測定位在細(xì)胞質(zhì)粒的可能性最高。

圖1 辣椒GME蛋白親水性/疏水性分析Fig.1 Hydrophilic/hydrophobic analysis of pepper GME protein

表3 辣椒GME蛋白的亞細(xì)胞定位Tab.3 Subcellular location prediction of GME proteins in pepper

2.3 辣椒GME基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME軟件對CaGMEs保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，該蛋白屬于NADB Rossmann 超級家族，GME基因家族的2個基因所包含的氨基酸保守序列都一致，都有著8個結(jié)構(gòu)域；N端主要是motif5，該氨基酸保守域結(jié)構(gòu)含有NAD binding，在序列中高度保守。C端主要是motif7，含有擴展SDR具有典型的Rossmann折疊，是底物結(jié)合位點(圖2)。對每個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖3)發(fā)現(xiàn)，motif1、motif3、motif5均含有50個保守氨基酸，motif7和motif8含保守氨基酸較少，分別有29，19個。

圖3 MEME預(yù)測的8個保守位點LOCOFig.3 LOCO of 8 conserved motif of domain

2.4 辣椒GME基因結(jié)構(gòu)分析

利用FGENESH-C 對獲得的辣椒GME基因的目的序列進(jìn)行內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)框架分析。結(jié)果表明(圖4)，CaGMEs基因家族成員都含有上游和下游基因序列，基因結(jié)構(gòu)完整。2個基因在長度上存在明顯差別外，其內(nèi)含子和外顯子在數(shù)目上保持一致，在結(jié)構(gòu)框架中都包含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)相似。

圖4 辣椒GME基因結(jié)構(gòu)Fig.4 Gene structures of GME in pepper

2.5 辣椒GME蛋白二級結(jié)構(gòu)對比分析

通過Prabi在線對CaGMEs基因所編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果表明(表4)，辣椒的2個CaGMEs蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)內(nèi)容包含較完整均有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、不規(guī)則卷曲，且不規(guī)則卷曲 (Random coil) >α-螺旋 (Alpha helix) >延伸鏈(Extended strand)>β-轉(zhuǎn)角 (Beta turn)。CaGMEs的二級結(jié)構(gòu)主要以不規(guī)則卷曲 (Random coil)和α-螺旋 (Alpha helix)為主。

表4 辣椒GME蛋白二級結(jié)構(gòu)對比分析Tab.4 The secondary structure of GME protein sequence in pepper %

Ca.辣椒；At.擬南芥；Os.水稻；Sl.番茄；Zm.玉米；Vv.葡萄；Gm.大豆；Ck.檸條；Mt.截型苜蓿；St.馬鈴薯。

2.6 辣椒GME基因順式作用元件分析

為深度解析CaGME家族成員的表達(dá)調(diào)控模式，將每條CaGME起始密碼子ATG上游3 000 bp作為啟動子區(qū)，通過采用PlantCare軟件對上游區(qū)域啟動子序列的相關(guān)順式調(diào)控元件進(jìn)行研究分析，進(jìn)而鑒別到多種對環(huán)境因子和植株生長激素類信號物質(zhì)能夠形成應(yīng)激響應(yīng)的順勢元件，結(jié)果表明，CaGME表達(dá)可能受到多種因素制約影響進(jìn)而使得其表達(dá)調(diào)控機制變得復(fù)雜化，極有可能受到植株體內(nèi)和外界環(huán)境因素的雙重應(yīng)激調(diào)節(jié)。結(jié)果(表5)顯示，2條CaGME具有的順式作用元件主要分為植物激素響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件 (ABRE)、生長素響應(yīng)元件 (TGA-element)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件 (CGTCA-motif)、乙烯響應(yīng)元件(ERE)、赤霉素響應(yīng)元件 (P-box)等；植物生長發(fā)育相關(guān)順式作用元件，如O2-site、CAT-box等；生物和非生物脅迫響應(yīng)順式作用元件，如干旱誘導(dǎo)元件 (MBS)、機械損傷信號響應(yīng)元件(WUN-motif)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、光響應(yīng)元件(ACE)等。預(yù)測結(jié)果表明，辣椒CaGME在調(diào)節(jié)生長發(fā)育、激素信號物質(zhì)和應(yīng)對環(huán)境脅迫方面有重要作用。

2.7 辣椒GME蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為了揭示辣椒GME基因家族的進(jìn)化關(guān)系，以擬南芥、水稻、番茄、玉米、葡萄、大豆、檸條、截型苜蓿、馬鈴薯GME家族基因作為參考。利用MEGA 5.0和ClustalX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明(圖5)，根據(jù)親緣關(guān)系將該蛋白分為2個分支，其中SlGME1、SlGME2、StGME、CaGME1、CaGME2、AtGME、MtGME、CkGME、GmGME、OsGME1為一支，其余的為另一支。CaGME2與SlGME1和StGME的親緣關(guān)系最近，其次是CaGME1與SlGME2。CaGME1和CaGME2在同一個分支當(dāng)中，說明這2種蛋白質(zhì)可能在辣椒中起到相似作用。

表5 辣椒GME家族成員啟動子序列順式作用元件分析Tab.5 Analysis of cis-acting elements of promoter sequence of pepper GME family members

2.8 辣椒GME基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR分析了辣椒GME家族基因在逆境脅迫條件下的表達(dá)情況(圖6)，包括鹽脅迫 (NaCl)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、赤霉素(GA3)和冷脅迫 (Cold)。CaGME1在冷、鹽脅迫和MeJA處理下，基因表達(dá)量上調(diào)且呈先上升后下降的趨勢，分別于12，12，6 h時達(dá)到最大值，其中冷、鹽脅迫上調(diào)表達(dá)為0 h的1.8，1.6倍左右；但在GA3脅迫下，表達(dá)量下調(diào)且呈先下降后上升的趨勢，12 h時達(dá)到最小值，表達(dá)量下降到0 h的30%左右。CaGME2在脅迫環(huán)境下表達(dá)情況與CaGME1相似。

圖6 辣椒GME基因?qū)ι锓巧锩{迫響應(yīng)Fig.6 Response of pepper GME gene to abiotic stress

3 結(jié)論與討論

目前，對GME基因家族有許多研究，在水稻[22]、棉花[37]、茶樹[38]、番茄[39]等植物中有均有報道；Voxeur等[40]研究表明，GME不僅是L-半乳糖途徑中Vc合成的關(guān)鍵限速酶，而且植物還會因GME失活導(dǎo)致細(xì)胞的分裂減慢和發(fā)育遲緩。Major等[41]研究表明，GME可以差向異構(gòu)化，生成GDP-L-半乳糖和GDP-L-古洛糖。AsA生物合成是在GME水平上進(jìn)行的。關(guān)于植物體內(nèi)如何去分配和調(diào)節(jié)GME而控制AsA的合成，目前沒有詳細(xì)報道。

本研究通過生物信息學(xué)方法，對辣椒中得到的2個GME基因進(jìn)行鑒定與表達(dá)分析，2個GME基因序列有較高的同源性，屬于NADB Rossmann 超級家族，同時含有NADB結(jié)構(gòu)域、NAD-dependent epimerase/dehydratase結(jié)構(gòu)域和底物特異性結(jié)合位點，且在功能域上都是高度保守的。Watanabe等[21]對水稻GME基因OsGME進(jìn)行研究，同樣含有NAD結(jié)合域。2個GME基因的功能特征在理化性質(zhì)、親疏水性和二級結(jié)構(gòu)等多個方面均高度相似，在發(fā)育樹中處于同一分支，可能這2個基因在調(diào)控辣椒AsA合成中起到相似作用；啟動子順勢元件分析中表明，辣椒CaGME在調(diào)節(jié)生長發(fā)育、激素信號和應(yīng)對環(huán)境脅迫方面有重要作用。

本試驗研究表明，在鹽脅迫、冷脅迫和MeJA處理后，CaGME1和CaGME2在辣椒葉片中的相對表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢，這與Du等[22]和王美珍等[42]的研究結(jié)果基本相似；在GA3處理后，CaGME1和CaGME2在辣椒葉片中的相對表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢，這與王江英等[37]在對棉花進(jìn)行GA3處理后發(fā)現(xiàn)，GME基因的表達(dá)量顯著下降，及Du等[22]對水稻的GME基因GA3處理3 h后，發(fā)現(xiàn)OsGME1和OsGME2基因的表達(dá)量都下降的結(jié)果基本一致。

通過對辣椒GME基因家族的生物信息學(xué)分析和脅迫下基因表達(dá)特性的研究，可以為辣椒CaGME基因特征的探索以及在非生物脅迫下調(diào)節(jié)機制的下一步研究提供基礎(chǔ)。