潘雷雷,紀(jì)紅昌,黃建斌,淮東欣,雷 永,隋炯明,唐艷艷,朱 虹,姜德鋒,王晶珊,喬利仙

(1.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,湖北 武漢 430062;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東省花生產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 青島 266109)

隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為研究基因功能和植物改良的重要途徑,高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立便成為影響物種間功能基因發(fā)掘及研究利用的限制條件。目前，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中普遍應(yīng)用的轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和DNA直接導(dǎo)入法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡單、成本低、轉(zhuǎn)化頻率高等優(yōu)點,但需依賴于物種高效的再生體系,存在再生周期長等缺點[1-2]。DNA 直接導(dǎo)入法主要包括基因槍轟擊法以及花粉管通道法。其中基因槍轟擊法受體類型廣泛,無物種限制,但存在轉(zhuǎn)化頻率低、價格昂貴以及后代遺傳不穩(wěn)定等缺點[1-2]?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ怯晌覈茖W(xué)家周光宇[3]于1979年首先提出和設(shè)計的,與其他方法相比,該法操作簡便,無需昂貴的儀器和化學(xué)藥品,注射后直接收獲種子，無須經(jīng)過組織培養(yǎng)再生,且轉(zhuǎn)化周期短,其首先在棉花上獲得成功應(yīng)用[4]。

花生屬于比較難于轉(zhuǎn)化的作物,目前花生遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法,使用的外植體有胚小葉、子葉節(jié)、胚軸、幼葉等[5-8]。王鳳歡等[9]對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生胚小葉遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化,使抗性叢生芽誘導(dǎo)率可達(dá)到15%～93%。賈宇臣等[10]以子葉節(jié)為外植體進(jìn)行研究,獲得最佳轉(zhuǎn)化條件。邱金梅等[11]利用農(nóng)桿菌EHA105菌株侵染花生胚軸外植體,認(rèn)為外植體在真空中侵染利于轉(zhuǎn)化。鐘育海等[12]研究認(rèn)為在農(nóng)桿菌菌液中添加煙草提取物,以及超聲波處理,可使子葉外植體的分化率達(dá)到86%?；ǚ酃芡ǖ婪ㄗ畛跤糜谕庠碊NA的轉(zhuǎn)移,如申馥玉等[13]和梁炫強等[14]提取高抗銹病的花生野生種Arachisglabrata基因組DNA,通過花粉管通道法導(dǎo)入栽培品種白沙1016中,結(jié)果獲得抗銹病性及其他性狀明顯轉(zhuǎn)移的株系。王亞等[15]、范乾程等[16]通過花粉管通道法將攜帶外源基因的重組農(nóng)桿菌導(dǎo)入花生,PCR檢測陽性率分別為34.7%和18.0%。

CRISPR-Cas9 技術(shù)是最新發(fā)展的基因編輯技術(shù),可以對特定DNA 進(jìn)行定點切割,并進(jìn)一步引起靶基因的定點突變。運用 CRISPR/Cas9 技術(shù)已經(jīng)在水稻、小麥、玉米三大作物上實現(xiàn)了高效精確的單堿基定點突變[17],并顯著提高了水稻白葉枯病抗性[18]。但基因編輯同樣要依賴于成熟高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系,由于基因編輯是在外源質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)生,所依賴的遺傳轉(zhuǎn)化體系需要具有更高的轉(zhuǎn)化效率,方可提高編輯的效率。因此,簡單高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立也成為基因編輯有效利用的途徑。

花生是重要的油料作物,花生油富含多種脂肪酸,主要包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸,分別占到總脂肪酸含量的20%和80%。由于飽和脂肪酸被認(rèn)為對人體有害,故降低飽和脂肪酸含量成為花生育種的目標(biāo)之一。高等植物中的FatB(acyl-ACP thioesterase, ?；?ACP 硫脂酶)主要編碼生成飽和脂酰碳鏈的硫酯酶,催化飽和脂肪酸的合成釋放。采用RNA干涉技術(shù)沉默F(xiàn)atB基因的表達(dá)使棉籽油中的C16∶0含量從最初的20%下降到8%；過表達(dá)C12∶0-ACP硫酯酶的轉(zhuǎn)基因擬南芥和油菜中月桂酸含量顯著增加[19]。在亞麻薺中將FAD2基因突變則獲得油酸含量由16%增加到50%的籽粒[20]。因此,通過調(diào)控FatB的催化活性,可以對花生籽粒飽和脂肪酸的合成進(jìn)行調(diào)控。

本研究擬構(gòu)建花生AhFatB基因的CRISPR/Cas9編輯載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花粉管注射法轉(zhuǎn)化花生,在成功轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上獲得AhFatB位點被成功編輯的花生籽粒,進(jìn)一步篩選出飽和脂肪酸含量降低的突變材料,旨在為花生基因編輯的有效展開提供依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 花生品種為花育23號,由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究中心保存。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒、載體和試劑藥品 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101購自上海唯地生物技術(shù)有限公司(Veidi,中國上海)。CRISPR/Cas9載體構(gòu)建試劑盒購自杭州百格生物技術(shù)有限公司(Biogle,中國杭州)?？敲顾?Kanamycin)、利福平(Rifampin)、乙酰丁香酮(AS)、MES、MgCl2·6H2O、質(zhì)粒提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon,中國上海)。2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技有限公司(Vazyme,中國南京)。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 試驗所用引物及其序列列于表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CS4-F/CS4-R用于Cas9基因的擴(kuò)增及測序；A1-F/A1-R用于Aradu.ZG6C0基因的擴(kuò)增及測序；B1-F/B1-R用于Araip.SBA9Y基因的擴(kuò)增及測序；U6-F用于靶位點測序；Oligo1、Oligo2用于構(gòu)建重組載體。

表1 引物及序列Tab.1 Primers and sequences used in experiments

1.1.4 培養(yǎng)基及侵染液 LB液體培養(yǎng)基+50 mg/L 卡那霉素；YEB液體培養(yǎng)基+50 mg/L卡那霉素+50 mg/L利福平；侵染液：MS液體培養(yǎng)基+100 μmol/L 乙酰丁香酮+10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2·6H2O。

1.2 試驗方法

1.2.1 CRISPR/Cas9編輯載體的構(gòu)建 設(shè)計花生AhFatB編輯位點,根據(jù)靶位點合成1對Oligos(Oligo1和Oligo2，表1),使用杭州百格生物技術(shù)有限公司CRISPR/Cas9載體試劑盒,將合成的編輯位點DNA Oligo通過Buffer Anneal連接到PX458載體上(圖1),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選單克隆菌落,利用CS4-F和CS4-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證,對擴(kuò)增陽性的菌落利用U6啟動子引物U6-F進(jìn)行測序驗證。

LB.T-DNA左側(cè)；RB.T-DNA右側(cè)；U6.大豆U6啟動子；SG.sgRNA(導(dǎo)向RNA)；e35S.35S強啟動子； Cas9.優(yōu)化過的Cas9；NOS Ter.NOS終止子；35S.花椰菜花葉病毒的35S啟動子；Bar.Bar選擇標(biāo)記基因；PolyA Ter.PolyA終止子。LB.Left border of T-DNA; RB. Right border of T-DNA; U6.Soybean U6 promoter; SG.sgRNA; e35S.Enhanced 35S promoter; Cas9.Optimized Cas9; NOS Ter.NOS terminator; 35S.CaMV 35S promoter; Bar.Bar selection marker gene;PolyA Ter.PolyA terminator.

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 取-80 ℃冰箱保存的農(nóng)桿菌于超凈工作臺室溫融化,取100 μL加入2 μL質(zhì)粒DNA,用手彈打管底混勻,依次于冰上靜置5 min,液氮5 min,37 ℃水浴5 min,冰浴5 min；加入600 μL的無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基,于28 ℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h；6 000 r/min離心1 min,棄上清液,加入100 μL的無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基,槍頭吸打混勻,吸取100 μL的菌液涂布于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEB平板上,倒置培養(yǎng)3 d；挑單克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增驗證,保存陽性克隆菌液。

1.2.3 注射浸花法轉(zhuǎn)化花生 將花育23號成熟種子進(jìn)行催芽處理后播種于花盆中,每盆4粒,出苗后,保留長勢良好的2棵植株。于花生始花期開始每天早晨摘去尚未完全開放的花朵,持續(xù)7～10 d使其達(dá)到盛花期時開始注射。注射前1 d將保存在冰箱中的農(nóng)桿菌菌液取出,吸取200 μL轉(zhuǎn)入含有50 mg/L卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)基中,28 ℃,200 r/min,搖菌約10～12 h后,取適量菌液于紫外分光光度計中測量OD600值,待 OD600=0.6～0.8時,先取1 mL菌液保存在4 ℃冰箱待次日搖菌備用,剩余菌液經(jīng)離心后收集沉淀,加入提前制備好的等體積侵染液,充分混勻后得到菌體注射液。注射于當(dāng)日8:00之前進(jìn)行,使用1 mL的醫(yī)用注射器吸取注射液注入開放花朵的龍骨瓣內(nèi)(或者花萼管),連續(xù)注射10 d,之后再連續(xù)摘花7～10 d,對新生果針進(jìn)行綁繩標(biāo)記。待莢果發(fā)育成熟后收獲綁繩標(biāo)記的花生莢果。

1.2.4 收獲籽粒的分子鑒定 取注射后收獲的花生莢果籽粒,使用SDS法提取基因組DNA為模板[21],以CS4-F和CS4-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。擴(kuò)增體系為：總體積25 μL,包括正反向引物各10 μmol/L,2×Taq Plus Master Mix Ⅱ 12.5 μL,DNA模板50 ng。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35次循環(huán)：95 ℃變性40 s,64 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果,對檢測的陽性籽粒DNA,再用A1-F/A1-R及B1-F/B1-R引物進(jìn)行擴(kuò)增后測序,驗證靶位點編輯情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9編輯載體的構(gòu)建

以轉(zhuǎn)化后的單克隆大腸桿菌為模板,CS4-F、CS4-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出產(chǎn)物為1 249 bp的條帶(圖2-A),說明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入。再取部分陽性克隆送公司測序,測序結(jié)果含有靶位點DNA序列的為陽性克隆(圖2-B)。對測序成功的重組載體命名為PX458-Cas9-FatB。

A.重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增驗證：M.DL2000；1.陽性對照(1 249 bp)；2-6.單克隆。B.重組質(zhì)粒的測序峰圖,橫線部分為靶位點序列。A. PCR amplification verification of recombinant plasmid：M.The molecular weight Marker of DL2000;1. Positive control (1 249 bp); 2-6. Every monoclonal. B. The sequencing peak map of the recombinant plasmid, with the horizontal line as the target sequence.

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

挑選在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEB平板上的單克隆菌落,利用CS4-F、CS4-R引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增驗證,能擴(kuò)增出1 249 bp目的片段的均為陽性菌落,說明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(圖3)。

M.DL2000；1.空白對照；2.陽性質(zhì)粒對照；3-7.農(nóng)桿菌單克隆。M.The molecular weight Marker of DL2000; 1.Blank control;2.Positive plasmid control; 3-7.Agrobacterium tumefaciens monoclonal.

2.3 注射浸花法轉(zhuǎn)化花生

使用1 mL的無菌注射器吸取農(nóng)桿菌注射液,每次吸取之前先將離心管中的注射液搖勻。選擇當(dāng)日盛開的花朵(圖4-A),從花生花瓣的龍骨瓣處進(jìn)行注射,一只手拖住花瓣,另一只手持注射器扎破龍骨瓣進(jìn)行注射(圖4-B),直到花萼管中充滿水柱,并且打開翼瓣后看到注射液浸滿整個花朵(圖4-C)。每朵花大約注射0.1 mL注射液,每天6：00-8：00進(jìn)行注射,持續(xù)7～10 d。隨后對新生果針進(jìn)行綁繩標(biāo)記(圖4-D)。待莢果發(fā)育成熟后收獲綁繩標(biāo)記的花生莢果(圖4-E、F)。

2.4 注射后收獲籽粒的分子鑒定

圖5結(jié)果顯示,注射后收獲的籽粒中,能成功擴(kuò)增出了相應(yīng)目的條帶的籽粒含有外源重組質(zhì)粒,未能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶的為轉(zhuǎn)基因陰性籽粒。在被檢測的274粒籽粒中,共檢測獲得108粒陽性籽粒,轉(zhuǎn)基因陽性率為39.42%。對擴(kuò)增陽性的108粒籽粒進(jìn)行測序驗證,發(fā)現(xiàn)有1粒在靶位點外發(fā)生了編輯,在部分陽性籽粒的自交后代中,發(fā)現(xiàn)了靶位點發(fā)生編輯的籽粒。

A.待注射的花朵；B.注射龍骨瓣；C.侵染液包滿雄蕊且在花萼管有一段水柱；D.尼龍繩捆綁果針；E.收獲植株；F.收獲的莢果和籽粒。A.Flowers to be injected; B.Carina injected; C.Infection medium covered with stamens and a column of water in the calyx tube; D. Pod needles tied with nylon cord; E.Harvested plants; F.Harvested pods and seeds.

M.DL2000；1.陽性質(zhì)粒對照；2.空白對照；3.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?-34.轉(zhuǎn)化后收獲的籽粒。M.The molecular weight Marker of DL2000;1.Positive plasmid control;2.Blank control;3.Non-transgenic control;4-34. Seeds harvested after transformation.

3 結(jié)論與討論

利用浸花法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化在擬南芥以及油菜等植物上獲得了巨大成功[22-23]。花生屬于較難轉(zhuǎn)化的作物,青島農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究中心十多年來堅持對該法進(jìn)行摸索優(yōu)化,建立了簡單高效的注射浸花法遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。根據(jù)以往經(jīng)驗,影響轉(zhuǎn)化效率最關(guān)鍵的因素是農(nóng)桿菌的活力,因此,注射液必須要現(xiàn)用現(xiàn)配,具體為注射前1 d晚上搖菌,第2天早上離心后用侵染液重懸菌體,用于當(dāng)日注射效果最好,第2日注射需要第2日早上再重新配置注射液,如使用第1日的注射液,轉(zhuǎn)化成功率會降低50%～80%。另外在注射過程中,直接注射花萼管雖然可行,但因花萼管較細(xì)長,直接用注射器扎破后容易造成花萼管受損折彎,影響受精過程進(jìn)而降低轉(zhuǎn)化效率。因此,應(yīng)該盡量選擇注射龍骨瓣,注射龍骨瓣直到雄蕊被浸透,農(nóng)桿菌可隨著花粉管通道直接進(jìn)入胚囊而提高轉(zhuǎn)化效率。有研究者直接利用花粉管注射法轉(zhuǎn)化外源DNA也能達(dá)到很好的轉(zhuǎn)移效果,但由于同時導(dǎo)入大片段的序列而引起受體很多基因及性狀的改變,而直接注射農(nóng)桿菌可以保證外源基因的單一進(jìn)入而增加了轉(zhuǎn)化后代的定向選擇效果。因此,使用注射浸花法,將攜帶外源基因的重組農(nóng)桿菌通過花粉管通道完成整個轉(zhuǎn)化過程,與其他的遺傳轉(zhuǎn)化方法相比較,該法不需要依賴其他設(shè)備,操作簡單,可以大大降低成本和節(jié)約時間。利用此法將花生nsLTPs、Lea-D、WRKY75等基因?qū)牖ㄉ?分別獲得35%～56%的陽性轉(zhuǎn)化率[24-25]。如果能夠更好地控制摘花時間,而且即時標(biāo)記果針,預(yù)計可提高轉(zhuǎn)化率到70%以上。本研究首次使用該轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行CRISPR/Cas9基因編輯,雖然產(chǎn)生較高的陽性籽粒(39.42%),但是經(jīng)測序結(jié)果驗證,只有1粒在靶位點外發(fā)生編輯,說明應(yīng)用此法未能實現(xiàn)高效率的基因編輯。有報道說非同源性的啟動子會抑制編輯效率[26],本研究使用了大豆的U6啟動子對花生進(jìn)行了編輯,這種非同源性的差異可能是造成編輯效率低的原因之一,目前正在嘗試用花生的啟動子來替代大豆U6啟動子來提高編輯效率。此外,FatB基因在植物的發(fā)育過程中起到非常重要的作用[19-20],基因被編輯失活可能會影響到種子的正常發(fā)育而被選擇淘汰,因而顯示出極低的編輯效率。高效的注射浸花法轉(zhuǎn)化技術(shù)是否能更有效地用于花生基因編輯,仍需進(jìn)一步的研究證實。