呂冰冰，代 暢，彭正松， YAMAMOTO Naoki，吳一超，魏淑紅，楊在君

(1.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2.西昌學(xué)院 農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013)

微衛(wèi)星DNA (Microsatellites) 或稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSRs)，是一種廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)單元一般由2～6個(gè)核苷酸組成[1]。與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有分布隨機(jī)、數(shù)量豐富、信息含量高、等位基因變異多、共顯性遺傳、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇育種、遺傳多樣性分析和品種鑒定等領(lǐng)域[2-4]。SSR標(biāo)記可以從保守程度較高的編碼區(qū)獲取，也可以從非編碼區(qū)獲取[5]。傳統(tǒng)的基因組SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)相對(duì)耗時(shí)，價(jià)格也比較昂貴?；诒磉_(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags，EST)或cDNA序列開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記被稱(chēng)為EST-SSR標(biāo)記[6]，EST-SSR標(biāo)記是基于已有的EST或轉(zhuǎn)錄組等公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源開(kāi)發(fā)，省去了SSR引物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的克隆和測(cè)序步驟，大幅度降低了開(kāi)發(fā)成本[3]。與傳統(tǒng)的基因組SSR標(biāo)記相比，EST-SSR反映了蛋白質(zhì)編碼區(qū)的信息，與基因的表達(dá)具有直接或間接的關(guān)系，是功能基因的“絕對(duì)”的標(biāo)記。因此，這類(lèi)標(biāo)記對(duì)于功能基因分離、基因組比較作圖和遺傳圖譜的構(gòu)建具有更為重要的作用[7-9]。

普通小麥(TriticumaestivumL.，2n = 6x = 42)是世界上重要的糧食作物之一。目前利用SSR標(biāo)記、SNP標(biāo)記和SRAP標(biāo)記已構(gòu)建了多張小麥的遺傳圖譜[10-12]，這些標(biāo)記也為小麥的分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。盡管從已公布的小麥的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中開(kāi)發(fā)了一些EST-SSR標(biāo)記[13-15]，但是與其他物種相比，利用小麥的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記還相對(duì)較少。西華師范大學(xué)西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期從小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊突變體(HTS-1)的正常雌蕊(P)、雌蕊化雄蕊(PS)和正常雄蕊(S)中獲得了40.88 G的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并從這些數(shù)據(jù)中心挖掘出8 389條EST-SSR序列[16]。本研究從8 389對(duì)EST-SSR引物中隨機(jī)選取了585對(duì)得分大于95分的引物進(jìn)行合成，并在小麥中檢測(cè)其有效性。以川麥42與川農(nóng)16雜交并自交后的RIL群體為作圖群體，利用篩選出的EST-SSR標(biāo)記，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期篩選的小麥基因組SSR標(biāo)記和SRAP標(biāo)記構(gòu)建了一張遺傳圖譜。本研究旨在豐富小麥功能分子標(biāo)記的數(shù)量，為小麥功能基因的定位、比較基因組學(xué)、小麥起源和進(jìn)化等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

川麥42與川農(nóng)16雜交后再自交構(gòu)建的重組自交系群體(RILs)，F(xiàn)14(2018年)，共125個(gè)家系，該群體由四川省農(nóng)業(yè)科院的楊武云研究員饋贈(zèng)。 每一個(gè)家系種植1行，行距0.2 m，株距0.2 m，常規(guī)大田水肥管理，次年3月采集3～4片新鮮嫩葉，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 利用植物DNA提取試劑盒(蘭博生物，中國(guó)浙江)提取川麥42、川農(nóng)16及其RILs家系幼葉的基因組DNA。具體操作參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，Nanodrop 2000微量紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，選擇無(wú)降解、純度高的DNA樣品用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 EST-SSR位點(diǎn)篩選及引物設(shè)計(jì) 從本實(shí)驗(yàn)室前期利用轉(zhuǎn)錄組分析篩選的8 389個(gè)SSR位點(diǎn)中選取585個(gè)位點(diǎn)用于引物設(shè)計(jì)[17]，選取原則為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)分別大于或等于10，7，5，4，3，SSR位點(diǎn)大于或等于20 bp，EST序列長(zhǎng)度大于150 bp。利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物得分大于95分，所有EST-SSR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及引物篩選 利用川麥42和川農(nóng)16的DNA對(duì)585對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行初步篩選。PCR反應(yīng)體系為10.0 μL：2×Taq Master Mix 5 μL；10 μmol/L的正向引物(F)和反向引物(R)各0.5 μL；30～50 ng/μL的模板DNA 1 μL；ddH2O 3 μL。為減少非特異性擴(kuò)展，本試驗(yàn)采用Touchdown PCR 程序：95 ℃預(yù)變性 3 min； 95 ℃變性 30 s，65 ℃退火60 s (每一循環(huán)減1 ℃)，72 ℃延伸60 s，共10個(gè)循環(huán)；95 ℃變性 30 s，55～62 ℃退火60 s (引物的退火溫度如表1所示)，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸5 min。首先，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增成功；其次，采用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選具有多態(tài)性的引物；最后選擇多態(tài)性引物對(duì)125個(gè)RIL家系進(jìn)行PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.4 遺傳圖譜的構(gòu)建 對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果的帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將與母本川麥42帶譜一致的標(biāo)記為“A”，與父本川農(nóng)16帶譜一致的表記為“B”，具有雙親帶譜(雜合體)的標(biāo)記為“H”，整合本實(shí)驗(yàn)室之前篩選的SRAP引物和SSR引物[18]，利用Jionmap 4.0軟件構(gòu)建遺傳圖譜，作圖函數(shù)為Kosambi，設(shè)置LOD>3.0，最大遺傳距離為50 cM，其他為默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物有效性和多態(tài)性分析

利用親本川麥42與川農(nóng)16對(duì)585對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行有效性檢測(cè)，其中555對(duì)引物在雙親中能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定的條帶，其條帶大小在100～300 bp，有效性達(dá)94.87%。其余30對(duì)被視為無(wú)效引物，其中2對(duì)引物的擴(kuò)增條帶太大(超過(guò)500 bp)，6對(duì)引物的擴(kuò)增條帶小于50 bp， 22對(duì)引物在雙親中均無(wú)擴(kuò)增條帶。555對(duì)有效引物中有69對(duì)引物在川麥42和川農(nóng)16中表現(xiàn)出多態(tài)性，占12.43%。隨機(jī)選取20個(gè)RILs單株進(jìn)一步驗(yàn)證引物的多態(tài)性，結(jié)果有44對(duì)引物表現(xiàn)出清晰的、穩(wěn)定的多態(tài)性條帶，多態(tài)性率為7.93%，comp584引物擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。這些引物可作為小麥新的EST-SSR標(biāo)記(部分引物序列如表1所示)。

M.川麥42；N.川農(nóng)16；P.pBR322 Marker；缺少編號(hào)為21和84的株系。M. Chuanmai 42；N. Chuannong 16；P. pBR322 Marker；Missing lines with numbers 21 and 84.

2.2 標(biāo)記偏分離分析

親本之間具有多態(tài)性的EST-SSR標(biāo)記的2種基因型在RILs作圖群體中的比例應(yīng)符合1∶1，對(duì)44個(gè)EST-SSR標(biāo)記2種基因型在作圖群體中的分布進(jìn)行χ2檢驗(yàn)表明，在0.05水平上有13個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為偏分離，占總的EST-SSR標(biāo)記的29.5%。在13個(gè)偏分離標(biāo)記中有12個(gè)標(biāo)記偏向川麥42，僅1個(gè)偏向川農(nóng)16。

2.3 遺傳圖譜構(gòu)建

利用上述44個(gè)EST-SSR標(biāo)記擴(kuò)增RILs群體的125個(gè)系，并整合本實(shí)驗(yàn)室前期的SSR標(biāo)記和SRAP標(biāo)記數(shù)據(jù)構(gòu)建小麥遺傳圖譜。該圖譜由163個(gè)標(biāo)記組成，這些標(biāo)記分布在12個(gè)連鎖群上，其中新開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記17個(gè)，SSR標(biāo)記和SRAP標(biāo)記各73個(gè)。這些標(biāo)記覆蓋小麥基因組長(zhǎng)度1 551.5 cM，相鄰標(biāo)記之間的平均距離為13.11 cM(圖2)。其中位于B染色體組上標(biāo)記最多，共95個(gè)，包括SRAP標(biāo)記43個(gè)，SSR標(biāo)記44個(gè)，EST-SSR標(biāo)記8個(gè)，覆蓋長(zhǎng)度707.4 cM；D染色體組上標(biāo)記最少，僅11個(gè)，包括2個(gè)SRAP標(biāo)記，7個(gè)SSR標(biāo)記和2個(gè)EST-SSR標(biāo)記，覆蓋長(zhǎng)度為231.5 cM。新開(kāi)發(fā)的17個(gè)EST-SSR標(biāo)記在1B染色體上最多，有4個(gè)；其次是1A和4A染色體，各2個(gè)EST-SSR標(biāo)記分布；在2B、3A、3B、3D、4B、5A、5B、6A、6D染色體上各有1個(gè)。在具有多態(tài)性的EST-SSR標(biāo)記中能夠定位到染色體上的標(biāo)記為38.6%(表2)。

圖距在染色體的左邊，標(biāo)記名稱(chēng)在染色體的右邊；本研究新開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記加下劃線(xiàn)。Map distances are indicated on the left side of each chromosome，and the name of markers on the right side; The newly developed EST-SSR markers in this study were underlined.

3 討論與結(jié)論

利用諸如基因組文庫(kù)篩選法、富集法、序列標(biāo)簽微衛(wèi)星分析法(STMP)和選擇性擴(kuò)增微衛(wèi)星分析法(SAM)等傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法往往是一項(xiàng)耗時(shí)長(zhǎng)且成本高的工作[19]。隨著二代測(cè)序技術(shù)的迅速崛起，不僅測(cè)序錯(cuò)誤率大幅度下降，準(zhǔn)確率提高，且測(cè)序成本也極大降低，這為SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。加之以NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)為代表的公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源的開(kāi)發(fā)共享，使得EST序列的查詢(xún)更為方便，這些都為EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了廣闊的前景?；诟咄繙y(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)，可獲取樣品在特定時(shí)間下特定組織所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本序列信息，且不受參考基因組有無(wú)的影響，因此，RNA-Seq已成為發(fā)掘基因功能的重要手段之一。除此之外，RNA-Seq技術(shù)也是挖掘EST-SSR標(biāo)記的有效手段。目前，我國(guó)學(xué)者在利用EST序列進(jìn)行小麥EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方面已取得較大的成就，如Gao等[20]利用71 495條EST序列設(shè)計(jì)出688對(duì)EST-SSR引物，其中483個(gè)引物對(duì)有擴(kuò)增產(chǎn)物；陳軍方等[21]利用ITEC上公布的10 380條EST序列設(shè)計(jì)出135對(duì)EST-SSR引物，其中有效引物82對(duì)，并將32對(duì)引物定位到除2D、4B和4D外的18條小麥染色體上；潘海濤等[3]利用GenBank/dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中的265 362條小麥EST序列設(shè)計(jì)出596個(gè)EST-SSR引物對(duì)，選擇其中95分以上的194個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，165個(gè)引物對(duì)能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的條帶，并將其中的23個(gè)EST-SSR位點(diǎn)整合到已有的小麥遺傳圖譜上。本實(shí)驗(yàn)室的Yang等[17]從小麥HTS-1突變體的RNA-Seq數(shù)據(jù)中鑒定出8 389個(gè)潛在的SSR序列，并進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)；對(duì)隨機(jī)挑選出的300對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明有177個(gè)引物對(duì)能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的條帶。上述EST-SSR標(biāo)記可以作為小麥及其近緣物種的分子標(biāo)記。本研究是在Yang等[17]的基礎(chǔ)上從8 389個(gè)SSR引物對(duì)中隨機(jī)選取585對(duì)得分大于95分的EST-SSR引物進(jìn)行合成，其中555對(duì)引物在川麥42和川農(nóng)16中均能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的條帶，其大小在50～300 bp，其有效性為94.87%。

在555對(duì)有效引物中有44對(duì)EST-SSR引物在川麥42和川農(nóng)16中表現(xiàn)出明顯的、穩(wěn)定的多態(tài)性，多態(tài)性率為7.93%。其多態(tài)率顯著低于SRAP標(biāo)記和SSR標(biāo)記[18，22]。這主要是由于EST-SSR來(lái)源于表達(dá)序列，這些序列具有較高的保守性，但也正是由于這個(gè)原因使得EST-SSR標(biāo)記成為一種有功能的分子標(biāo)記[23]。利用這44個(gè)EST-SSR標(biāo)記，以川麥42與川農(nóng)16雜交后并自交獲得的RILs群體為作圖群體，結(jié)合了本實(shí)驗(yàn)室前期的SRAP和SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一張小麥遺傳圖譜。含有本次新開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記的連鎖群共12個(gè)，這12個(gè)連鎖群由163個(gè)標(biāo)記組成，包括EST-SSR標(biāo)記17個(gè)，SSR標(biāo)記和SRAP標(biāo)記73個(gè)。覆蓋小麥基因組長(zhǎng)度1 551.5 cM，相鄰標(biāo)記間的平均遺傳距離為13.11 cM。除1B、1A和4A染色體外，其余的9條染色體上僅1個(gè)EST-SSR標(biāo)記分布，在具有多態(tài)性的EST-SSR標(biāo)記中能夠定位到染色體上的標(biāo)記為38.6%。普通小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，含有A、B、D 3個(gè)染色體組，其遺傳圖譜應(yīng)包含21個(gè)連鎖群，但本次利用EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜只包含了其中的12個(gè)連鎖群。在1D、2A、2D、4D、6B、7A、7B和7D 9個(gè)連鎖群上沒(méi)有篩選到與之連鎖的EST-SSR標(biāo)記。這可能與EST-SSR標(biāo)記本身的多態(tài)性較低和本試驗(yàn)篩選的標(biāo)記數(shù)量偏少有關(guān)。因此，下一步應(yīng)繼續(xù)篩選和開(kāi)發(fā)新的EST-SSR標(biāo)記，不斷完善和豐富各連鎖群上的分子標(biāo)記。嘗試將本研究獲得的圖譜與本試驗(yàn)之前構(gòu)建的遺傳圖譜進(jìn)行整合，但由于本次開(kāi)發(fā)的標(biāo)記數(shù)量偏少，且缺乏中間連鎖標(biāo)記，因此，只有極個(gè)別EST-SSR標(biāo)記能整合。但本研究豐富了小麥EST-SSR標(biāo)記的數(shù)目。而這些EST-SSR標(biāo)記作為基因的一部分其信息含量高、保守性好、在物種間具有良好的通用性等優(yōu)點(diǎn)[22]，因此，在功能基因的定位、比較基因組學(xué)和小麥起源和進(jìn)化研究方面具有重要的價(jià)值。