丁超杰 ，關(guān)園園 ，李成偉

(1.河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，然而在其生長過程中容易受到真菌、細(xì)菌和病毒等多種病原菌的感染，對小麥產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，如較嚴(yán)重的有白粉病、赤霉病等。小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麥?；?Blumeriagraminisf.sp.tritici(Bgt))引起的世界性真菌病害，在亞洲、非洲和歐美等主產(chǎn)麥區(qū)都有發(fā)生，中國的小麥產(chǎn)區(qū)也幾乎都有發(fā)生，并有日趨嚴(yán)重之勢[1]。小麥赤霉病是由鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引起的一種世界性病害，近年來，隨著全球氣候變暖以及耕作制度的變化，小麥赤霉病的發(fā)生頻率不斷增加，發(fā)生范圍也不斷擴(kuò)大。這些病害的發(fā)生都嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量[2]，因此，解決這些病害問題對小麥生產(chǎn)具有重要意義。由于小麥抗性品種比較少，目前，控制小麥病原菌發(fā)生的途徑主要是使用殺菌劑，而殺菌劑的大量噴施會造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，因此，培育小麥抗病品種成為解決小麥病害的理想途徑。而不管是野生型還是人工選育的小麥抗病品種都比較匱乏，因此，快速、高效培育抗病品種迫在眉睫。傳統(tǒng)雜交育種時(shí)間長、效率低，而利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，將抗病基因轉(zhuǎn)入栽培品種中使其獲得抗病性，是快速、有效獲得抗病品種的重要途徑，其中分子育種的關(guān)鍵是挖掘更多具有優(yōu)良抗性的基因[3-4]。

前人的研究中已克隆了一些小麥抗病相關(guān)基因[5-6]，但抗性基因資源仍非常有限，而且抗病基因抗性單一，有效抗原沒有充分利用，加之新的病原菌小種產(chǎn)生速度非常快，許多抗性基因喪失抗性。因此，需要進(jìn)一步尋找新的抗病基因資源。microRNA(miRNA)是一類生物體內(nèi)普遍存在的長度為21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，主要通過與目標(biāo)基因互補(bǔ)配對從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，導(dǎo)致mRNA降解或抑制翻譯而參與植物體內(nèi)多種生物學(xué)反應(yīng)，在整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用[7-8]。目前，已在許多植物中發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在，對其功能的研究也越來越廣泛和深入。越來越多的研究表明，miRNA在植物抗病中也起著重要作用[9-11]，其參與的抗病反應(yīng)主要是通過直接或間接調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。miRNA482/2118超家族中的miRNA能夠調(diào)控NBS-LRR家族基因(抗病蛋白基因)的沉默，當(dāng)番茄受到病原菌感染后，NBS-LRR家族基因的表達(dá)量迅速下降，植物抗病性發(fā)生變化[12]。此外，多主棒孢霉能夠引起黃瓜棒孢葉斑病，通過RNA-seq分析，當(dāng)多主棒孢霉侵染黃瓜時(shí)，miR164d、miR396b、Novel-miR1和Novel-miR7表達(dá)量發(fā)生變化，當(dāng)過量或抑制表達(dá)它們的靶基因時(shí)，黃瓜對多主棒孢霉的抗性會發(fā)生變化，因此，推測miRNA在黃瓜對多主棒孢霉抗性中起重要作用[13]。研究還發(fā)現(xiàn)，棉花中的miRNA168在棉花抗曲葉病毒中起著重要作用，其主要通過在轉(zhuǎn)錄水平或直接降解病毒中關(guān)鍵基因的表達(dá)量來影響病毒的復(fù)制，從而使棉花具有抗病毒性[14]。綜上表明，miRNA已成為植物與病原菌互作研究中的重要領(lǐng)域，通過抑制或誘導(dǎo)某種miRNA的產(chǎn)生，可以改變植物的抗病性，并且也從另一個(gè)角度應(yīng)用于植物的抗病研究和育種中。

研究發(fā)現(xiàn)，miR395家族成員在受到病原菌侵入的應(yīng)答反應(yīng)中起著重要作用[15]。蘋果中miR395的靶基因?yàn)镸dWRKY26，當(dāng)過量表達(dá)miR395時(shí)，MdWRKY26表達(dá)量下降，而WRKY可以和病程相關(guān)蛋白(PR)互作，因此抑制表達(dá)miR395時(shí)，PR基因表達(dá)量升高，蘋果的葉斑病抗性增強(qiáng)[16]。棉花中的miR395a和miR395b參與調(diào)控棉花與曲葉病毒的互作[15]。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR395a成熟序列在各物種間具有較高的相似性。因此，推測miR395在植物抗病性方面具有一定的保守性。而目前關(guān)于其在小麥抗病方面的研究尚未見報(bào)道，為此，克隆小麥miR395a的前體序列，構(gòu)建其過量表達(dá)載體并遺傳轉(zhuǎn)化小麥，同時(shí)分析其組織表達(dá)模式，以期為后續(xù)研究和解析miR395a在小麥抗病中的功能和作用機(jī)制提供材料來源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 供試材料為小麥栽培品種百農(nóng)207。

1.1.2 質(zhì)粒及菌種 大腸桿菌菌種DH5α、農(nóng)桿菌菌種GV3101、克隆載體質(zhì)粒pMD19-T、表達(dá)載體質(zhì)粒pCambia1301。

1.1.3 酶和化學(xué)試劑 FastPfu酶購自全式金公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ、Marker DL 2000和T4DNA連接酶、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit均購自TaKaRa公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥基因組DNA的提取 采用CTAB法[17]從小麥葉片中提取基因組DNA。

1.2.2 小麥miR395a前體基因的克隆 在NCBI上查找小麥miR395a的前體序列，設(shè)計(jì)引物，并在上、下游引物上分別加上BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列如下：上游引物TmiR395-F為5′-GGATCCCTAGAGTTCCCTTGACCGCT-3′，下游引物TmiR395-R為5′-TCTAGAACGATATGTTAACATCGAAT-3′。30 μL PCR反應(yīng)體系：5×Pfu Buffer 6 μL，F(xiàn)astPfu酶0.6 μL，上、下游引物各1.5 μL，dNTP 3 μL，小麥基因組DNA模板2 μL，ddH2O 15.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收與測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收，連接至克隆載體pMD19-T上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，之后送至武漢金開瑞公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-miR395a。

1.2.4 小麥miR395a前體的過量表達(dá)載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ對載體pCambia1301和pMD19-T-miR395a分別進(jìn)行雙酶切，完全酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(天根瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)進(jìn)行純化回收后連接，10 μL連接體系如下：miR395a前體序列片段6 μL，線性化質(zhì)粒1 μL，10×Buffer 1 μL，T4DNA連接酶0.2 μL，ddH2O 1.8 μL。16 ℃連接12 h后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR和酶切鑒定，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，即過量表達(dá)載體，將其命名為pCambia1301-miR395a。

1.2.5 過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 將3 μL pCambia1301-miR395a質(zhì)粒和100 μL農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞混勻，在冰上靜置30 min，之后液氮中放置5 min，取出后立即放入37 ℃培養(yǎng)箱5 min，隨后加入YEB(不含抗生素)800 μL，在28 ℃恒溫?fù)u床中復(fù)蘇3～5 h，用涂布棒均勻涂在YEB固體培養(yǎng)基(含Rif和Kan抗生素)上。將平板放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，通過菌落PCR鑒定，篩選出陽性菌落，備用。

1.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化 小麥的遺傳轉(zhuǎn)化方法，參照Supartana等[18]的報(bào)道。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因小麥的PCR檢測 采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因當(dāng)代小麥葉片的基因組DNA，使用嵌合引物，即在過量表達(dá)載體中啟動子序列上設(shè)計(jì)上游引物S1：5′-CTCCTACAAATGCCATCATT-3′，miR395a前體序列上設(shè)計(jì)下游引物S2：5′-AGAACTTCACAGTGGTCTTA-3′，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增片段長度約為580 bp，PCR陽性對照模板為質(zhì)粒pCambia1301-miR395a，陰性對照為水對照和未轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.8 組織表達(dá)部位分析 總RNA的提取采用TRIzol法，反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa的miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit，按照操作說明進(jìn)行。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，進(jìn)行熒光定量分析，熒光定量試劑盒使用TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，按照操作說明進(jìn)行。每個(gè)組織部位3個(gè)重復(fù)；上游引物為miR395a的特異引物：5′-GTGAAGTGTTTGGGGGAACTC-3′，下游引物為前體序列引物S2：5′-AGAACTTCACAGTGGTCTTA-3′；內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。熒光定量的結(jié)果采用2-ΔΔCT方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR395a成熟序列比對分析

從miRBase(http：//www.mirbase.org)中分別獲得不同物種的miR395a成熟序列，分析發(fā)現(xiàn)，miR395a在不同物種中具有較高的保守性，其中小麥與擬南芥、番茄以及大豆中的miR395a成熟序列具有高度一致性(圖1)，推測其功能上也具有保守性。

圖1 miR395a成熟序列比對分析Fig.1 Alignment analysis of mature miR395a sequence

2.2 小麥miR395a前體序列的克隆

根據(jù)在miRBase和NCBI上獲得的miR395a的前體序列，設(shè)計(jì)引物，擬擴(kuò)增出384 bp的片段。以小麥葉片的基因組DNA為模板，以TmiR395-F和TmiR395-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。對該條帶進(jìn)行回收、連接至克隆載體pMD-19T上，并進(jìn)行測序。對測序結(jié)果在DNAMAN上進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)所獲片段與NCBI中獲得的miR395a前體序列的堿基完全一致，表明已成功克隆該序列。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1，2.miR395a擴(kuò)增結(jié)果。M.Marker；1，2.Products of pre-miR395a.

2.3 小麥miR395a前體過量表達(dá)載體的構(gòu)建

將以上測序正確的pMD-19T-miR395a重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pCambia1301質(zhì)粒同時(shí)用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，將目的基因片段和線性化的pCambia1301切膠回收、連接，菌落PCR初步鑒定陽性轉(zhuǎn)化子pCambia1301-miR395a，進(jìn)一步通過酶切鑒定，能夠切割出預(yù)期連入的miR395a前體片段396 bp(圖3)，證明過量表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1，2.重組載體酶切鑒定結(jié)果。 M.Marker；1，2.Products of pCambia1301-miR395a digested by restriction enzyme.

2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化小麥

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將miR395a前體過量表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化小麥，獲得56株T0轉(zhuǎn)基因植株(圖4)，并已收獲種子。

圖4 小麥轉(zhuǎn)基因T0植株表型Fig.4 Phenotype of T0 transgenic wheat

2.5 轉(zhuǎn)基因小麥植株的PCR檢測

提取56株小麥T0植株的基因組DNA，同時(shí)以構(gòu)建好的過量表達(dá)質(zhì)粒作陽性對照，水和未轉(zhuǎn)基因植株作陰性對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，在56株轉(zhuǎn)基因植株中，11株轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出和陽性質(zhì)粒大小一致的約580 bp片段，且與預(yù)期大小一致，而其余45株轉(zhuǎn)基因植株、水對照和未轉(zhuǎn)基因植株均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(圖5)。同時(shí)也進(jìn)行了GUS染色，與PCR結(jié)果一致，說明miR395a前體已成功轉(zhuǎn)入小麥中，陽性率約20%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；P.過量表達(dá)載體質(zhì)粒對照；WT.未轉(zhuǎn)基因植株；ddH2O.水對照；1-11.T0轉(zhuǎn)基因植株。M.Marker；P.Plasmid；WT.Wild type；ddH2O.Double distilled water；1-11.11 lines of T0 transgenic plants.

2.6 小麥miR395a的組織表達(dá)模式分析

利用RT-qPCR技術(shù)，分析miR395a在小麥不同組織部位中的表達(dá)量(圖6)，結(jié)果顯示，miR395a為組成型表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量有差異，其中在三葉期和抽穗期葉片中的表達(dá)量較高，葉鞘中次之，旗葉中表達(dá)量最低。

圖6 小麥miR395a的組織表達(dá)模式分析Fig.6 Analysis of tissue expression pattern of miB395a in wheat

3 結(jié)論與討論

病害嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量，小麥與病原菌互作是目前小麥研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。miRNA在植物抗病中的功能越來越多地被報(bào)道，如當(dāng)番茄受到致病疫霉菌的感染時(shí)，其中的一些miRNA表達(dá)量發(fā)生明顯變化，分析它們的靶基因均為一些植物病程相關(guān)蛋白，說明miRNA參與番茄對致病疫霉菌的防御反應(yīng)[19]。前期的試驗(yàn)結(jié)果表明，小麥中一些miRNA的表達(dá)量也能夠響應(yīng)白粉菌的誘導(dǎo)，其中包括miR395a。而有關(guān)miR395家族成員的功能，早期的研究主要集中在其對硫酸鹽吸收中的作用[20-21]，發(fā)現(xiàn)其能夠調(diào)控?cái)M南芥對SO2的抗性，也即其能參與非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。最近相關(guān)的研究表明，miR395也參與植物抗病反應(yīng)[14]。

序列分析發(fā)現(xiàn)，miR395a的成熟序列在不同物種中具有較高的保守性，推測其功能也具有保守性。而miR395a在小麥抗病中的功能還未見報(bào)道。為了進(jìn)一步研究其功能，本試驗(yàn)克隆了小麥miR395a前體序列，并將其過量表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化至小麥中，在基因組水平設(shè)計(jì)嵌合引物，通過PCR擴(kuò)增鑒定出陽性植株，同時(shí)通過GUS染色，進(jìn)一步確定陽性植株。目前這些植株已經(jīng)成熟并收獲種子。同時(shí)本研究還對miR395a的組織表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，其為組成型表達(dá)，其中在三葉期和抽穗期的葉中表達(dá)量最高，表明其在小麥生長各個(gè)階段都可能發(fā)揮作用，但主要在葉片中起作用。下一步將篩選陽性T0植株的種子，并對T1葉片接種白粉菌等病原菌，進(jìn)行小麥抗性鑒定試驗(yàn)，研究miR395a是否具有對白粉病等的抗性反應(yīng)，并在穗期對轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，進(jìn)一步深入研究miR395a在小麥廣譜抗病中的功能及作用機(jī)制。