孫麗靜,李倩影,王培楠,孫 穎

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所,河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050035；2.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,分子細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050024)

細(xì)胞分裂素是一類重要的植物激素,在細(xì)胞分裂、芽的分化、葉綠素合成、葉片衰老、種子發(fā)育等生長發(fā)育過程[1-6]和應(yīng)對鹽漬、干旱、冷脅迫、營養(yǎng)脅迫等非生物脅迫的過程中[7-12],均發(fā)揮著重要作用。

組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Histidine phosphotransfer proteins, HPs)是細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分。HP上保守的組氨酸位點(diǎn)接受來自細(xì)胞分裂素受體(Histidine kinases, HKs)的磷酸基團(tuán)后,從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到定位于細(xì)胞核的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(Response regulators, RRs)上,從而激活下游基因的表達(dá)以完成信號傳遞[4,13-15]。

擬南芥中有5個含有保守組氨酸位點(diǎn)的AHP,單突變體和雙突變體在細(xì)胞分裂素的響應(yīng)上沒有缺陷,然而,ahp1,2,3在根的生長、葉綠素合成、下胚軸伸長等方面對細(xì)胞分裂素不敏感,表明AHP是細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正調(diào)節(jié)因子,并且AHP之間存在功能冗余現(xiàn)象[16]。ahp1,2,3,4,5則展現(xiàn)出主根變短、育性降低、種子增大等表型[16]。此外,研究表明,ahp2,3,5具有很強(qiáng)的耐鹽性和抗旱性,暗示擬南芥AHP2、AHP3、AHP5作為重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子參與了植物對鹽和干旱脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[17]。

水稻中只有2個含有保守組氨酸位點(diǎn)的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,OsAHP1和OsAHP2[18-20]。分子細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期通過RNA干擾的方法同時降低了轉(zhuǎn)基因植株中OsAHP1和OsAHP2的表達(dá),OsAHP-RNAi植株表現(xiàn)出細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷表型,包括矮化、側(cè)根生長增加、葉片提早衰老、分蘗數(shù)減少和育性下降等,并對外源細(xì)胞分裂素不敏感[21]。此外,OsAHP-RNAi幼苗對鹽脅迫處理表現(xiàn)超敏感表型,但是對干旱脅迫表現(xiàn)出抗逆表型[21]。這些結(jié)果表明,OsAHP在細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著正調(diào)節(jié)因子的作用,并且在水稻鹽和干旱脅迫中發(fā)揮著不同的作用。

本研究構(gòu)建了2個OsAHP2原核表達(dá)載體,通過比較篩選出融合蛋白表達(dá)量較高的pET-32a-OsAHP2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),優(yōu)化了蛋白表達(dá)條件并對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了分離純化,為后續(xù)研究OsAHP2與細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中其他蛋白的相互作用和磷酸化分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、Rosseta、XA90、水稻日本晴(Oryzasativassp.Japonica)、表達(dá)載體pET-32a、pGEX-4T-1為河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司；RNA提取試劑購自Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR所用Taq酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；His純化基質(zhì)購自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1OsAHP2基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建 利用TRIzol提取10 d水稻葉片總RNA,以1 μg RNA為模板,按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的基因序列(Os09g39400),設(shè)計(jì)OsAHP2基因特異引物,上游引物OsAHP2-F: 5′-CGGAATTCATGGCGGCCGCCGCTCTCCG-3′,下游引物OsAHP2-R:5′-CCCTCGAGTGCACACGCGCACACACTCT-3′,以水稻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后膠回收。將PCR產(chǎn)物與空載體pET-32a和pGEX-4T-1分別進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,重組子經(jīng)菌體PCR和酶切鑒定正確后,送生工生物工程(上海)有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pET-32a-OsAHP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosseta,pGEX-4T-1-OsAHP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株XA90。

1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)時間的優(yōu)化 將重組菌pET-32a-OsAHP2(Rosseta)和pGEX-4T-1-OsAHP2(XA90)分別接種于LB培養(yǎng)基(100 mg/L Amp),37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,按1∶50比例擴(kuò)培后培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8,加入IPTG(終濃度0.5 mmol/L),30 ℃誘導(dǎo)0,1,3,5 h,分別離心收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.3 融合蛋白的可溶性分析 按方法1.2.2優(yōu)化的結(jié)果,將重組菌pET-32a-OsAHP2(Rosseta)30 ℃ 220 r/min誘導(dǎo)3 h,離心收集菌體,用1/10體積的溶菌液(25 mmol/L Tris(pH值8.0),300 mmol/L NaCl,1 mmol/L DTT,1 g/L溶菌酶,0.2 mmol/L PMSF)重懸菌體,冰上靜置40 min后超聲破碎至溶液清亮。4 ℃ 12 000 r/min離心30 min收集上清和沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 融合蛋白的純化 按方法1.2.3中所述,收集超聲后上清,用0.45 μm濾膜過濾,用3倍體積的平衡液(25 mmol/L Tris(pH 值8.0),300 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑)平衡His純化基質(zhì),將過濾后的上清與His純化基質(zhì)于50 mL離心管中4 ℃混勻1 h。用洗滌緩沖液(25 mmol/L Tris(pH值 8.0),300 mmol/L NaCl,40 mmol/L咪唑)沖洗4次,用洗脫緩沖液(25 mmol/L Tris(pH值8.0),300 mmol/L NaCl,200 mmol/L咪唑)洗脫3次,SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白純化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsAHP2基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用OsAHP2基因上下游特異引物PCR擴(kuò)增獲得557 bp(包括ORF 450 bp,編碼149個氨基酸)的OsAHP2全長基因(圖1-A)。為了探索不同表達(dá)載體對蛋白表達(dá)的影響,分別將OsAHP2基因連接原核表達(dá)載體pET-32a和pGEX-4T-1,轉(zhuǎn)化DH5α。利用載體上游引物和基因下游引物進(jìn)行菌體PCR鑒定(圖1-B),陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定(圖1-C),均可得到557 bp的條帶。質(zhì)粒送公司測序,正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET-32a-OsAHP2和pGEX-4T-1-OsAHP2。

A.OsAHP2的PCR擴(kuò)增：M.Marker Ⅲ分子量標(biāo)準(zhǔn)；OsAHP2.OsAHP2基因；B. OsAHP2原核表達(dá)載體的菌體PCR鑒定：1-4. pET-32a-OsAHP2菌體PCR產(chǎn)物；M.Marker Ⅲ分子量標(biāo)準(zhǔn)；5-8.pGEX-4T-1-OsAHP2菌體PCR產(chǎn)物；C. OsAHP2原核表達(dá)載體的酶切鑒定：M. Marker Ⅲ分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-2.pET-32a-OsAHP2重組質(zhì)粒EcoRⅠ+ XhoⅠ雙酶切；3-4.pGEX-4T-1-OsAHP2重組質(zhì)粒EcoRⅠ+ XhoⅠ雙酶切。

2.2 不同原核表達(dá)載體和IPTG誘導(dǎo)時間對融合蛋白表達(dá)量的影響

將pET-32a-OsAHP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosseta,pGEX-4T-1-OsAHP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株XA90,分別用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)1,3,5 h后取樣；pET-32a空載體和pGEX-4T-1空載體則分別用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h取樣。SDS-PAGE結(jié)果表明,pET-32a空載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在21 ku處產(chǎn)生誘導(dǎo)條帶,為載體上的Trx+His+S標(biāo)簽；以未誘導(dǎo)和空載體為對照,pET-32a-OsAHP2重組菌株在35 ku處誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白,并且融合蛋白的表達(dá)量3 h最高(圖2-A)。pGEX-4T-1空載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在28 ku處產(chǎn)生誘導(dǎo)條帶,為載體上的GST標(biāo)簽；以未誘導(dǎo)和空載體為對照,pGEX-4T-1-OsAHP2重組菌株在42 ku處誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白,并且融合蛋白的表達(dá)量均隨著時間的增加而增多(圖2-B)。

A.IPTG誘導(dǎo)時間與pET-32a-OsAHP2融合蛋白表達(dá)量的關(guān)系：M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a空載體未誘導(dǎo)；2.pET-32a空載體IPTG誘導(dǎo)5 h；3.pET-32a-OsAHP2融合蛋白未誘導(dǎo)；4-6.pET-32a-OsAHP2融合蛋白IPTG誘導(dǎo)1,3,5 h；B.IPTG誘導(dǎo)時間與pGEX-4T-1-OsAHP2融合蛋白表達(dá)量的關(guān)系：M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pGEX-4T-1空載體未誘導(dǎo)；2.pGEX-4T-1空載體IPTG誘導(dǎo)5 h；3.pGEX-4T-1-OsAHP2融合蛋白未誘導(dǎo)；4-6.pGEX-4T-1-OsAHP2融合蛋白IPTG誘導(dǎo)1,3,5 h。

雖然pET-32a-OsAHP2和pGEX-4T-1-OsAHP2均能表達(dá)出融合蛋白,但pET-32a-OsAHP2融合蛋白的表達(dá)量整體高于pGEX-4T-1-OsAHP2。因此,選擇pET-32a-OsAHP2重組菌株IPTG誘導(dǎo)3 h進(jìn)行后續(xù)蛋白純化。

2.3 pET-32a-OsAHP2融合蛋白的可溶性分析

將pET-32a-OsAHP2重組菌株IPTG誘導(dǎo)3 h的菌體進(jìn)行超聲波破碎,離心收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明,OsAHP2融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于菌液裂解后的上清中,包涵體中也有一定量的表達(dá)(圖3)。由于可溶性蛋白具有活性、純化簡單等優(yōu)點(diǎn),因此,選擇從可溶性蛋白中進(jìn)行后續(xù)蛋白純化。

1.未誘導(dǎo)；2.誘導(dǎo)后全蛋白；3.誘導(dǎo)后裂解上清；4.誘導(dǎo)后裂解沉淀；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。1.Total protein without IPTG induction; 2.Total protein with IPTG induction; 3.Supernatant of lysate; 4.Precipitation of lysate; M.Protein Marker.

2.4 pET-32a-OsAHP2融合蛋白的純化

將pET-32a-OsAHP2重組菌株IPTG誘導(dǎo)3 h的菌體進(jìn)行超聲波破碎,離心后的上清用His鎳離子親和層析柱進(jìn)行蛋白純化,通過4次洗滌和3次洗脫,獲得了大量大小約為35 ku的純度較好的OsAHP2融合蛋白(圖4)。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)；2.誘導(dǎo)后全蛋白；3.上柱液；4.流出液；5.第1次洗滌液；6.第4次洗滌液；7-9.洗脫液E1～E3。

3 結(jié)論與討論

組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分,負(fù)責(zé)將細(xì)胞分裂素受體的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到下游的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子上,從而激活下游基因的表達(dá)。水稻中HP家族由2個OsAHP(Authentic His-containing phosphotransfer protein)和3個OsPHP(Pseudo His-containing phosphotransfer proteins)組成[18-20]。OsAHP具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中用于進(jìn)行磷酸基團(tuán)傳遞的保守的His位點(diǎn)；而OsPHP中保守的His位點(diǎn)被Glu替代,因無法進(jìn)行信號傳遞而被稱為假磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明,OsAHP參與了水稻細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并且在鹽和干旱脅迫中也發(fā)揮著重要作用[21]。為了進(jìn)一步研究OsAHP2與細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中其他蛋白的相互作用和磷酸化分析,本研究構(gòu)建了OsAHP2原核表達(dá)載體,優(yōu)化了蛋白表達(dá)條件并對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了分離純化。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)周期短、遺傳背景清楚、目的基因表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)[22-24]。然而,外源基因能否在大腸桿菌中高效表達(dá)受許多因素影響,包括目標(biāo)蛋白自身編碼基因、表達(dá)載體、表達(dá)宿主菌和誘導(dǎo)表達(dá)的條件等[25-27]。常用的原核表達(dá)載體有pET系列載體(His標(biāo)簽)和pGEX系列載體(GST標(biāo)簽)[28-30]。為了研究不同表達(dá)載體對OsAHP2蛋白表達(dá)的影響,本研究將OsAHP2基因分別連入pET-32a和pGEX-4T-1載體,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosseta和XA90,SDS-PAGE結(jié)果顯示,0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時間,pET-32a-OsAHP2中融合蛋白的表達(dá)量均高于pGEX-4T-1-OsAHP2。因此,選擇pET-32a-OsAHP2重組菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)?？扇苄苑治鲲@示,OsAHP2融合蛋白在上清和包涵體中均有一定量的表達(dá),因?yàn)榘w中多肽鏈往往由于折疊錯誤而使蛋白失去活性,需要經(jīng)過復(fù)雜的變性復(fù)性過程才能得到有活性的蛋白,所以本研究采取了從可溶性蛋白中純化OsAHP2融合蛋白的策略。

OsAHP2開放閱讀框全長450 bp,編碼149個氨基酸,為了設(shè)計(jì)引物的匹配性,本研究設(shè)計(jì)了OsAHP2基因上下游特異引物,PCR擴(kuò)增獲得557 bp(包括開放閱讀框450 bp及終止密碼子下游的107 bp)的OsAHP2全長基因。本研究選取的原核表達(dá)載體pET-32a和pGEX-4T-1上的融合蛋白標(biāo)簽均位于目的基因5′端,并且由于目的基因3′端包含了終止密碼子,因此,多擴(kuò)增出的107 bp不會表達(dá)出蛋白,從而保證了融合蛋白的正確性。pET-32a-OsAHP2在Rosseta中誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白約為35 ku,與理論值基本一致。

本研究構(gòu)建了2個OsAHP2原核表達(dá)載體,通過His鎳離子親和層析柱從融合蛋白表達(dá)量較高的pET-32a-OsAHP2重組菌中純化到了大量純度較高的OsAHP2融合蛋白,為后續(xù)研究OsAHP2與細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中其他蛋白的相互作用和磷酸化分析奠定了基礎(chǔ)。