趙雄偉，吳年隆，喬佳輝，李旭凱，韓淵懷，邢國芳

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

磷作為維持植物生長發(fā)育等生命活動(dòng)必需的重要礦質(zhì)元素，對(duì)作物的新陳代謝、生長發(fā)育、高產(chǎn)及優(yōu)質(zhì)具有重要意義。土壤一旦缺磷，將會(huì)嚴(yán)重限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的提升。在我國，土壤有效磷低于10 mg/kg的土壤面積占總耕地面積的50%左右[1]。即使土壤中總磷含量較高，絕大部分有效磷也會(huì)很快被土壤膠體吸附或固定，只有20%～30%的磷酸鹽被植物吸收和利用[2]。雖然施用磷肥能緩解土壤中磷素供應(yīng)不足，但是磷礦資源枯竭已成為一個(gè)全球普遍關(guān)心的問題，而且過度施用磷肥會(huì)使水體富營養(yǎng)化。當(dāng)土壤磷含量較低時(shí)，磷高效型品種通過根系吸收、磷素的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和體內(nèi)對(duì)磷同化代謝的能力(代謝效率)獲取足夠的有效磷來維持植株的正常生長[3]。因此，利用分子生物學(xué)手段解析植物自身轉(zhuǎn)換有機(jī)磷的分子機(jī)制，對(duì)提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的生態(tài)環(huán)境意義。

酸性磷酸酶(Acid Phospoatase，ACP)是一種在酸性條件下水解磷酸酯并釋放出磷酸的酶，普遍存在于植物組織中，與植物體的有機(jī)磷分解再利用有著密切的關(guān)系。目前，關(guān)于低磷誘導(dǎo)的磷酸酶研究可分為2類：一類是分泌型酸性磷酸酶，能將衰老組織中的有機(jī)磷再活化并被轉(zhuǎn)運(yùn)至幼嫩組織中，如Robinson等[4]研究發(fā)現(xiàn)，紫色酸性磷酸酶AtPAP26可促進(jìn)擬南芥衰老葉片磷的再活化和再利用過程；而另一類是細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶，在磷饑餓條件下，細(xì)胞內(nèi)的活化酸性磷酸酶將液泡內(nèi)的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷，并通過液泡膜上的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而維持細(xì)胞質(zhì)中磷含量的動(dòng)態(tài)平衡。近10 a來，關(guān)于分泌型紫色酸性磷酸酶(PAP)的研究較多，主要集中在根系分泌紫色酸性磷酸酶的功能及其調(diào)控機(jī)制等領(lǐng)域[5]，而對(duì)細(xì)胞內(nèi)尤其是液泡內(nèi)的酸性磷酸酶研究較少。2014年，Zhang等[6]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析方法研究發(fā)現(xiàn)了酸性磷酸酶基因GmACP1，過表達(dá)GmACP1的大豆耐低磷特性顯著提高。由此可見，細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶在調(diào)控植物有機(jī)磷代謝過程中同樣起著非常重要的作用。

谷子(Setariaitalica)作為傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)雜糧作物之一，具有較強(qiáng)的耐貧瘠特性，其蘊(yùn)藏著豐富的種質(zhì)資源和重要的磷高效基因資源，如何快速鑒定耐低磷或磷高效基因的優(yōu)異等位位點(diǎn)，并應(yīng)用于作物遺傳改良是目前種質(zhì)資源和基因資源研究的中心任務(wù)之一。

鑒于ACP家族基因在植物耐低磷方面的重要性，本研究鑒定了谷子基因組的胞內(nèi)酸性磷酸酶ACP家族基因，并通過候選基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和單倍型分析，初步檢測到一個(gè)耐低磷的關(guān)鍵SiACP1基因及其優(yōu)異單倍型，旨在為谷子SiACP家族基因的功能研究和耐低磷分子育種提供新的基因遺傳信息。

1 材料和方法

1.1 谷子SiACP家族基因的鑒定和生物信息學(xué)分析

為了篩選較為可靠的谷子SiACP家族基因，首先以功能已知的大豆GmACP1(Glyma08g20820)[6]蛋白序列為模板，在大豆基因組(Wm82.a2.v1)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列BlastP比對(duì)(同源性P<10e-10)，以找到大豆的所有ACP家族基因；再利用hmmbuild軟件對(duì)檢索到的大豆GmACP基因建立HMM模型(Hidden Markov Model，隱馬爾科夫模型)；然后使用Hmmsearch軟件搜索谷子基因組(https：//phytozome.jgi.doe.gov/，Setariaitalicav2.2)中的ACP家族基因；最后，利用SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)檢驗(yàn)谷子ACP家族基因的蛋白序列是否包括HAD保守結(jié)構(gòu)域(PF12710)，并將蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大于0.2 ku的谷子SiACP基因作為谷子酸性磷酸酶SiACP家族基因成員。此外，利用ExPASy ProtParam在線軟件(https：//web.expasy.org/protparam/)分析谷子SiACP家族蛋白的分子量、等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)。

1.2 谷子SiACP家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究谷子、擬南芥、水稻、玉米、高粱和二穗短柄草ACP家族基因的進(jìn)化關(guān)系，首先通過Clustal X2.1軟件[7]比對(duì)不同物種的ACP蛋白序列。并使用Mega 7.0軟件的Neighbor Joining方法展示不同物種ACP家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)Bootstrap值設(shè)為1 000次重復(fù)；并用FigTree軟件構(gòu)建不同物種間的ACP家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹；然后使用Gene Structure Display Server軟件[8]展示和繪制不同物種的ACP家族基因結(jié)構(gòu)；最后，使用在線網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/)[9]預(yù)測編碼保守結(jié)構(gòu)域的motif，motif的大小設(shè)定為5～300個(gè)氨基酸。

1.3 谷子SiACP家族基因的表達(dá)模式分析

基于水稻粳稻[10]、玉米B73[11]以及Phytozome數(shù)據(jù)庫(https：//phytozome.jgi.doe.gov)公布的高粱BT×623和谷子豫谷1號(hào)(Yugu 1)轉(zhuǎn)錄組(RNA-seq)數(shù)據(jù)，篩選出ACP家族基因的FPKM值。并利用R語言pheatmaps軟件包繪制基因表達(dá)的熱圖，比較谷子和其他禾本科植物ACP家族基因在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織表達(dá)模式的差異。

1.4 谷子SiACP基因變異位點(diǎn)與低磷相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析

為了鑒定到與耐低磷相關(guān)的谷子SiACP關(guān)鍵基因及其優(yōu)異變異位點(diǎn)，采用了候選基因關(guān)聯(lián)分析策略，基于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院刁現(xiàn)民研究員團(tuán)隊(duì)[12]提供的重測序核心谷子種質(zhì)，用TASSEL 3.0軟件提取出SiACP在不同種質(zhì)中的SNP和InDel，并將最小等位頻率(MAF)閾值設(shè)為0.05；然后分析多態(tài)性位點(diǎn)(SNP和InDel)在SiACP基因上的具體分布(啟動(dòng)子、5′-UTR、3′-UTR、內(nèi)含子、外顯子)和距離起始密碼子ATG的距離(變異位點(diǎn)信息)；最后結(jié)合160份核心谷子種質(zhì)在正常磷和低磷條件下的苗期株高、根長、地上干質(zhì)量和根干質(zhì)量表型數(shù)據(jù)[13]，使用TASSEL 3.0軟件的一般線性模型GLM+Q進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析[14-15]。當(dāng)表型與基因SiACP多態(tài)性位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)P值小于0.01時(shí)，可被認(rèn)為基因SiACP中對(duì)應(yīng)的多態(tài)性位點(diǎn)與谷子耐低磷相關(guān)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)。

1.5 谷子耐低磷SiACP基因的單倍型分析

基于候選基因關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，對(duì)耐低磷相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的基因SiACP進(jìn)行單倍型分析。從160份種質(zhì)中挑選出SiACP基因的多態(tài)性位點(diǎn)，使用獨(dú)自開發(fā)的Perl腳本CandiHap.pl(https://github.com/xukaili/CandiHap)進(jìn)行單倍型統(tǒng)計(jì)，并對(duì)不同單倍型的核心種質(zhì)進(jìn)化劃分歸類，去除掉位點(diǎn)為N(未知)的單倍型；最后用R語言的Ggplot2和Ggsignif軟件包繪制對(duì)應(yīng)的表型箱線圖，并對(duì)不同單體型的耐低磷相關(guān)表型進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子與其他3種禾本科植物ACP家族基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

以大豆酸性磷酸酶GmACP1基因的蛋白序列為靶序列[4]，通過HMM模型預(yù)測和同源序列比對(duì)，從谷子和其他3種禾本科植物(水稻、高粱、玉米)的全基因組中共鑒定出13個(gè)ACP家族基因(表1)，按照與大豆GmACP基因的序列同源性順序進(jìn)行編號(hào)，并根據(jù)物種拉丁文名稱將4種禾本科ACP基因編號(hào)為SiACP1、SiACP2、SiACP3、ZmACP1、ZmACP2、ZmACP3、ZmACP4、SbACP1、SbACP2、SbACP3、OsACP1、OsACP2、OsACP3。通過生物信息學(xué)方法對(duì)所有禾本科植物ACP基因的染色體分布、編碼區(qū)和氨基酸長度、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)進(jìn)行分析。由表1可知，禾本科植物的ACP基因數(shù)目和染色體分布具有一定的規(guī)律性，谷子(基因組大小為491 Mb)、水稻(466 Mb)和高粱(730 Mb)基因組上均鑒定到3個(gè)ACP家族成員，均分布在2條染色體上。其中，不同物種同一條染色體上的2個(gè)ACP基因距離為6.40～7.95 Mb；而玉米基因組(2 300 Mb)上共鑒定到4個(gè)ACP基因，在3號(hào)染色體上也鑒定到2個(gè)ACP基因，其相互間距離為21.67 Mb。

表1 谷子和其他3種禾本科植物酸性磷酸酶ACP家族基因成員信息Tab.1 Information of phosphatase ACP family genes in foxtail millet and other three gramineous plants

從編碼區(qū)長度來看，4種禾本科植物的ACP基因編碼區(qū)長度為825～984 bp，其中，最長編碼區(qū)的基因和最短編碼區(qū)的基因均出現(xiàn)在同一條染色體上。例如位于谷子第5號(hào)染色體上的SiACP2基因編碼區(qū)長度為957 bp，SiACP2蛋白質(zhì)由318個(gè)氨基酸組成；而SiACP3基因編碼區(qū)長度為828 bp，其蛋白質(zhì)由275個(gè)氨基酸組成。除位于5號(hào)染色體上的玉米ZmACP2基因等電點(diǎn)大于7外，其他禾本科植物的ACP蛋白質(zhì)等電點(diǎn)均小于7，推測其編碼弱酸性蛋白質(zhì)，在酸性環(huán)境中發(fā)揮著一定的作用。鑒定到的所有ACP蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為29.81～35.80 ku，平均為32.01 ku，且不同ACP蛋白質(zhì)間的分子質(zhì)量差異較小。

由此可見，ACP家族基因在禾本科植物的數(shù)量和分布具有一定的規(guī)律性。玉米的基因組大小(2 300 Mb)明顯大于其他禾本科植物基因組大小(466～730 Mb)，其含有4個(gè)ZmACP基因；而其他的禾本科植物只有3個(gè)ACP基因，其中有2個(gè)ACP基因位于同一條染色體上，其編碼區(qū)長度和氨基酸長度均存在明顯的差異。所鑒定到的大部分ACP基因可能在酸性環(huán)境中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。

1) 雖然中國是世界第一大竹子生產(chǎn)國，但國內(nèi)許多地區(qū)仍然沒有意識(shí)到竹林的巨大效益。竹建筑將會(huì)使農(nóng)村居民意識(shí)到竹子的巨大潛力，并將其發(fā)展成一種產(chǎn)業(yè)。

2.2 谷子和其他物種的ACP基因進(jìn)化和結(jié)構(gòu)分析

為了研究谷子SiACP家族基因的進(jìn)化關(guān)系，利用谷子SiACP(Yugu 1)、水稻OsACP(粳稻)、玉米ZmACP(B73)、高粱SbACP(BT×623)、擬南芥AtACP(Col)、大豆GmACP(Williams 82)基因的蛋白序列構(gòu)建了一個(gè)單子葉和雙子葉物種間的進(jìn)化關(guān)系樹。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)構(gòu)可將ACP基因家族成員劃分為2個(gè)亞家族，含6個(gè)簇(Ⅰ～Ⅵ)(圖1-A)。其中，第1亞族包含了所有雙子葉植物的大豆GmACP和擬南芥AtACP蛋白，除了大豆Glyma08g03350蛋白外，其他的大豆GmACP基因不僅蛋白序列的相似性較高，而且均被聚類到第1簇中；而第2亞族中包含了所有單子葉的禾本科植物，包括谷子SiACP、水稻OsACP、高粱SbACP和玉米ZmACP蛋白；第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ簇中至少包含一個(gè)SiACP、SbACP、ZmACP和OsACP基因家族成員。由此可見，單子葉植物與雙子葉植物的ACP基因在進(jìn)化過程中有著明顯的序列差異，從而形成了單子葉植物ACP基因與雙子葉植物ACP基因分支。從單子葉禾本科植物親緣關(guān)系來看，C4植物中ZmACP蛋白與SbACP蛋白親緣關(guān)系最近，與SiACP蛋白親緣關(guān)系次之，而與C3植物水稻ACP蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。由此可見，在禾本科植物間ACP家族基因的親緣關(guān)系劃分符合植物分類學(xué)特性。

通過繪制不同單子葉植物和雙子葉植物的ACP基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(圖1-B)，在單子葉植物中，第Ⅴ簇水稻、高粱、玉米和谷子的ACP基因不含內(nèi)含子，大豆Glyma08g03350和水稻OsACP3基因只含一個(gè)內(nèi)含子。由此推測，這些ACP基因可能產(chǎn)生或分化的時(shí)間較晚，其功能相對(duì)專一。而其他單雙子葉植物的ACP基因至少含有2個(gè)內(nèi)含子，例如SbACP3、ZmACP2和ZmACP3均含2個(gè)內(nèi)含子 ，大豆Glyma15g02670基因含有5個(gè)內(nèi)含子。谷子SiACP1、SiACP3、SiACP2基因分別含有2，0，3個(gè)內(nèi)含子，表明SiACP基因在進(jìn)化過程中其生物學(xué)功能具有明顯的差異。

圖1 單雙子葉植物ACP家族基因進(jìn)化關(guān)系(A)、基因結(jié)構(gòu)分析(B)和蛋白motif組成成分分析(C)Fig.1 The analysis of phylogenetic relationships (A)，gene structure (B) and motif compositions (C) within ACP family genes in monocotyledon and dicotyledonous

從不同單雙子葉植物ACP基因的蛋白序列中共檢測到7～9個(gè)假定的保守基序(motif)(圖1-C)，包括motif 1、motif 2和motif 3編碼的磷酸酶結(jié)構(gòu)域。所有的ACP蛋白均包含3～4個(gè)磷酸酶結(jié)構(gòu)域，同一簇的ACP蛋白保守基序類型及排列順序基本一致。但是每個(gè)簇之間motif數(shù)目和組成成分存在一定的區(qū)別，例如第Ⅰ簇除了Glyma15g02670和Glyma13g42770蛋白序列包含motif 8外，其他的大豆GmACP蛋白序列均不包含motif 8；此外，Ⅱ～Ⅵ簇中除了ZmACP4外其他的ACP蛋白序列均包含motif 9。ACP家族蛋白除了磷酸酶結(jié)構(gòu)域外，其他特異的假定motif是否決定了ACP蛋白在單、雙子葉植物的功能差異，還需進(jìn)一步分析研究。

2.3 谷子SiACP家族基因組織表達(dá)特異性分析

為了研究SiACP家族基因在谷子生長發(fā)育過程的作用，從不同物種的基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出ACP家族基因在水稻、高粱、玉米、谷子的不同組織(根、莖、葉、穗及籽粒)和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)數(shù)據(jù)，并對(duì)不同物種的ACP基因表達(dá)水平繪制熱圖。由圖2可知，不同禾本科植物的ACP基因表達(dá)模式具有明顯的差異，同一基因在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式也存在一定的差異。比如，在玉米的生長發(fā)育過程中，4個(gè)ZmACP基因均在不同組織中表達(dá)，且表達(dá)量都比較高，而其他3個(gè)物種中均有一個(gè)表達(dá)量相對(duì)較低的ACP基因(OsACP3、SbACP1、SiACP1)。

不同顏色表示基因在不同組織的lgFPKM值；DAS為播種后的天數(shù)；DAP為開花后的天數(shù)。Different color shows genes at lgFPKM values of different tissues；DAS. Days after sowing； DAP. Days after pollination.

不同物種的ACP基因在不同組織與不同發(fā)育階段所表現(xiàn)的時(shí)空特異性也存在一定的差異。在水稻中，OsACP1和OsACP2基因在根系和莖稈中的表達(dá)量相對(duì)較低，主要在葉片中表達(dá)，其FKPM值范圍為28.70～164.09(圖2-A)，此外，OsACP1基因在雌蕊和花序中的表達(dá)量也相對(duì)較高；而OsACP3基因除了在穗部有一定的表達(dá)外(FKPM值為9.69)，在其他組織中的表達(dá)量均很低或沒表達(dá)。在高粱中，SbACP2和SbACP3基因在整個(gè)植株生長發(fā)育過程中都有一定的表達(dá)(圖2-B)。從組織特異性來看，SbACP1基因除了在中部莖稈(FPKM值為26.15)和葉片(FPKM值為30.23)表達(dá)量相對(duì)較高外，在其他組織的表達(dá)量較低(FPKM值為2.55～7.07)。而SbACP2基因主要在莖稈和葉鞘部位表達(dá)，其FPKM值分別為26.16和30.23。SbACP3基因主要在根系、莖稈、節(jié)點(diǎn)和葉片部位表達(dá)，其FPKM值均大于26.06。在玉米中，除了ZmACP3在花藥、花絲、胚乳、胚和苞葉組織中沒有表達(dá)外，其他ZmACP基因均有相對(duì)較高的表達(dá)量，例如ZmACP1基因在根系和花絲中的FPKM值高達(dá)140，ZmACP2和ZmACP4基因在頂部葉片、節(jié)點(diǎn)、花藥和苞葉的FPKM值均高于123(圖2-C)。由此可見，玉米ACP基因主要在生長發(fā)育旺盛的組織中表達(dá)。在谷子中，所有ACP基因均有一定的表達(dá)，其FPKM值為9.21～491.51(圖2-D)。從不同組織的基因表達(dá)情況看，SiACP1主要在根系中表達(dá)，且表達(dá)表現(xiàn)出了明顯的組織特異性；SiACP2和SiACP3在整個(gè)生育期的不同組織中均表達(dá)，且表達(dá)量都比較高，其FPKM均值為96.70。

由此可見，高粱SbACP和玉米ZmACP基因在不同組織中的表達(dá)量明顯高于谷子SiACP和水稻OsACP。禾本科作物中，水稻OsACP1基因、高粱SbACP3基因、玉米ZmACP2基因和ZmACP4基因、谷子SiACP2基因表達(dá)量明顯高于其他ACP基因，這些ACP基因不僅在不同組織發(fā)育過程中起著非常重要的作用，而且在植株最高處的葉片ACP基因表達(dá)量明顯高于基部或中間部位葉片ACP基因。

2.4 谷子SiACP基因的多態(tài)性位點(diǎn)與耐低磷相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析

為了分析谷子SiACP1、SiACP2和SiACP3基因在谷子核心種質(zhì)資源中的多態(tài)性，以及挖掘耐低磷相關(guān)性狀的優(yōu)異變異位點(diǎn)，本研究基于Jia等[12]利用高通量測序Illumina HiSeq 2000平臺(tái)重測序的916份谷子種質(zhì)資源，挑選出具有耐低磷相關(guān)表型的160份谷子種質(zhì)基因型[13]，分析了SiACP1、SiACP2、SiACP3基因在試驗(yàn)材料中的變異位點(diǎn)和序列多樣性，包括起始密碼子ATG上游1 000 bp的啟動(dòng)子。通過過濾掉缺失率和雜合度大于20%、最小等位頻率(MAF)小于0.05的多態(tài)性位點(diǎn)，最終在SiACP1基因中共檢測到87個(gè)SNP和2個(gè)InDel(圖3-A)，平均每28 bp存在一個(gè)變異位點(diǎn)(SNP或InDel)；在SiACP2基因中共檢測到11個(gè)SNP(圖3-B)，平均每486 bp有一個(gè)SNP；在SiACP3基因中共檢測到21個(gè)SNP和7個(gè)InDel，平均每79 bp有一個(gè)變異位點(diǎn)(SNP或InDel)(圖3-C)。SiACP基因的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)非均勻地分布在啟動(dòng)子、5′-UTR、編碼區(qū)、非編碼區(qū)以及3′-UTR。其中，多態(tài)性位點(diǎn)最多的SiACP1基因啟動(dòng)子(包含5′-UTR區(qū)和3′-UTR區(qū))(π>7.4×10-2)的多態(tài)性最高。

圖3 谷子SiACP基因的多態(tài)性位點(diǎn)分布及其與低磷條件下苗期相關(guān)表型的關(guān)聯(lián)分析Fig.3 Locus distribution of SiACP genes and associate analysis between natural variation in SiACPs and correlated phenotype under low Pi conditions at seedling stage

為了篩選耐低磷相關(guān)的關(guān)鍵SiACP基因和優(yōu)異等位變異位點(diǎn)，本研究基于前期160份谷子核心種質(zhì)的苗期株高(PH)、根長(RL)、地上部干質(zhì)量(DW above)和根干質(zhì)量(RDW)表型數(shù)據(jù)[13]，對(duì)候選基因SiACP1、SiACP2和SiACP3進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。由圖3-D、E、F可知，利用GLM+Q模型，在閾值為0.01水平下共鑒定到16個(gè)SNP與耐低磷相關(guān)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)(表2)。在SiACP1基因的多態(tài)性位點(diǎn)中，共檢測到11個(gè)SNP與低磷條件下株高(PH)、相對(duì)株高(RPH)和相對(duì)根長(RRL)存在顯著關(guān)聯(lián)(P<6.83×10-3)，其中位于起始密碼子ATG上游第459 bp、第556 bp和第二外顯子第1 100 bp的SNP均與LPH(低磷條件的株高)、RPH、RRL表型存在顯著關(guān)聯(lián)，但是位于編碼區(qū)的顯著SNP為非同義突變。此外，位于5′UTR區(qū)的2個(gè)SNP均與LPH、RPH存在顯著關(guān)聯(lián)；在SiACP2基因中共檢測出5個(gè)SNP，僅與低磷條件下相對(duì)根長(RRL)存在顯著關(guān)聯(lián)(圖3-F)，并沒有鑒定到與表現(xiàn)共性的顯著位點(diǎn)，其中，有3個(gè)SNP位于基因下游，2個(gè)SNP位于SiACP2基因的第2和第3外顯子區(qū)，其中在起始密碼子604 bp處的SNP導(dǎo)致氨基酸從丙氨酸變成甘氨酸；在SiACP3基因的多態(tài)性位點(diǎn)中，并沒有鑒定到與耐低磷相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。由此可見，SiACP1的啟動(dòng)子區(qū)不僅具有較高的多態(tài)性，而且存在多個(gè)與低磷條件下的株高、相對(duì)株高和相對(duì)根長表型顯著關(guān)聯(lián)的共性SNP，故推斷谷子SiACP1基因是導(dǎo)致低磷條件下谷子種質(zhì)資源表型變異的主要關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶基因。

表2 基因SiACP多態(tài)性位點(diǎn)與耐低磷相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.2 Associations between the natural variations within SiACPs and phenotype related to low-phosphorous tolerance

2.5 谷子SiACP1基因變異位點(diǎn)的單倍型分析

基于上述候選基因關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，為了進(jìn)一步確定SiACP1啟動(dòng)區(qū)的SNP是影響ACP基因功能的主要因素，從160份谷子核心種質(zhì)中篩選到的所有SiACP1的SNP和InDels位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析。在檢測到的89個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中(SNP/InDel)，去除掉SiACP1基因變異位點(diǎn)為N(未知)的種質(zhì)，最終得到32個(gè)SNP和1個(gè)InDel。通過對(duì)此33個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的隨機(jī)組合進(jìn)行分析，結(jié)果共得到7種單倍型，將138份種質(zhì)不均勻地劃分成7種單體型(圖4)。其中，有99份種質(zhì)被劃分為ACPHap1(SiACP1基因的第一個(gè)單倍型)，9份和10份種質(zhì)(單體型)分別包括單倍型ACPHap2和ACPHap4，而ACPHap3單體型只包含1份種質(zhì)B078，而其余的ACPHap5、ACPHap6和ACPHap7單體型中均存在雜合變異位點(diǎn)。

通過分析單倍型ACPHap1和ACPHap4的SNP組合時(shí)發(fā)現(xiàn)，ACPHap1和ACPHap4單倍型存在一個(gè)位于基因起始密碼子下游1 770 bp的SNP差異，該位點(diǎn)引起非同義突變；而比較單倍型ACPHap1和ACPHap2的SNP組合來看，二者之間存在31個(gè)SNP和1個(gè)InDel差異。通過整合基因SiACP1多態(tài)性位點(diǎn)與耐低磷相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，在與株高、相對(duì)株高、相對(duì)根長存在顯著關(guān)聯(lián)的5個(gè)SNP中，有4個(gè)SNP是單倍型ACPHap2和ACPHap3所特有的SNP。由此可見，由純合變異位點(diǎn)組合成的單倍型ACPHap1、ACPHap2和ACPHap3是影響基因SiACP1功能變異的主要單倍型。

最右側(cè)的數(shù)字代表每一個(gè)單倍型包含的種質(zhì)數(shù)目。The right most numbers represents the accessions numbers contenting each haplotype.

鑒于具有ACPHap3單倍型的種質(zhì)(1份)不能進(jìn)行表型統(tǒng)計(jì)分析外，本研究對(duì)ACPHap1、ACPHap2單體型在低磷條件下株高、根長、根干質(zhì)量、地上部干質(zhì)量的表型進(jìn)行T檢驗(yàn)差異顯著分析(圖5)。由圖5可知，ACPHap1單體型與ACPHap2單體型在正常磷和低磷條件下株高存在顯著差異(P<0.05)，而其他表型包括根長、根干質(zhì)量、地上部干質(zhì)量均不顯著。在同一條件下，對(duì)ACPHap1、ACPHap2單體型的相關(guān)性狀進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，在正常磷條件下ACPHap2單體型株高比ACPHap1單體型株高顯著增加了11.92%(3.98 cm，P=0.02)。在低磷條件下，與ACPHap1單體型株高和根長相比，ACPHap2單體型株高顯著增加了29.70%(6.60 cm，P=0.001 3)，ACPHap2單體型的根長也增加了1.91 cm，但差異未達(dá)到顯著水平(P=0.074)。

橫線上方的數(shù)字代表t檢驗(yàn)的P值。圖6同。The numbers above the line represent the P value of t test. The same as Fig.6.

通過比較分析正常磷和低磷條件下的株高、根長、地上部、根干質(zhì)量的相對(duì)值發(fā)現(xiàn)，ACPHap1單體型與ACPHap2單體型的相對(duì)株高、相對(duì)根長、根干質(zhì)量存在顯著差異(P<0.05)(圖6)。例如，ACHap1和ACPHap2單體型的相對(duì)株高平均值分別為33.45%和-23.14%；而ACPHap2和ACPHap1單體型的相對(duì)根長平均分別為17.38%和-0.02%；此外，ACPHap2單體型的相對(duì)根干質(zhì)量為-2.36%，而ACPHap1單體型的相對(duì)根干質(zhì)量為-22.83%。由此可見，在低磷條件下，ACPHap2單體型的生長發(fā)育過程中的根長、株高、地上部和根干質(zhì)量方面受低磷影響較小，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐低磷特性。

圖6 不同單體型在正常磷和低磷條件下的株高、根長、根和地上部干質(zhì)量相對(duì)值比較差異分析Fig.6 The comparative analysis between different haplotype for relative plant height，root length，root dry weight and dry weight of aerial part under normal phosphorus and low phosphorus conditions

3 結(jié)論與討論

磷是植物生長發(fā)育過程中必需的大量營養(yǎng)元素之一，土壤中有效磷含量過低是限制作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的主要因素。植物在長期進(jìn)化過程中形成了一系列適應(yīng)低磷誘導(dǎo)的分子機(jī)制，包括重塑根系的形態(tài)構(gòu)型促進(jìn)根系吸收更多的有效磷、體內(nèi)有機(jī)磷的高效利用[5]。磷酸酶不僅是一種重要的水解酶，參與碳水化合物轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)合成；而且是一種受低磷誘導(dǎo)酶，在土壤中與植株體內(nèi)的有機(jī)磷的分解和再利用有著密切的關(guān)聯(lián)。張麗梅等[16]研究缺磷對(duì)不同耐低磷玉米基因型酸性磷酸酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，缺磷使得玉米地上部干質(zhì)量下降，根干質(zhì)量、根冠比增加，磷誘導(dǎo)玉米葉片、根組織和根系分泌APase活性升高。當(dāng)植物受到低磷誘導(dǎo)時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)合成大量的去磷酸化酶相關(guān)基因，從不同的有機(jī)磷底物上水解磷酸基團(tuán)，增加體內(nèi)的有效磷素，提高植物在缺磷環(huán)境對(duì)磷的耐性及磷的高效利用。

細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶能夠?qū)⒅参镆号輧?nèi)的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷，并通過液泡膜上的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)向細(xì)胞質(zhì)，維持細(xì)胞質(zhì)中磷含量的動(dòng)態(tài)平衡。在番茄植物中，成功克隆到了一個(gè)低磷誘導(dǎo)的酸性磷酸酶基因LePS2，能編碼269個(gè)氨基酸，該基因只能在低磷條件誘導(dǎo)表達(dá)，而不受其他營養(yǎng)物質(zhì)或非生物脅迫影響[17]。Tian等[18]通過cDNA文庫鑒定一個(gè)編碼271個(gè)氨基酸的酸性磷酸酶基因PvPS2發(fā)現(xiàn)，該基因在磷饑餓條件下被誘導(dǎo)高表達(dá)，且有助于改良菜豆根系形態(tài)和結(jié)構(gòu)，耐低磷的植株內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)和酸性磷酸酶活性均增加。Wasaki等[19]在低磷脅迫下對(duì)白羽扇豆根分泌酸性磷酸酶基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，植株體內(nèi)的磷含量降低促進(jìn)了酸性磷酸酶ACP基因的表達(dá)，并加快了叢生根的形成。在大豆中，低磷條件下植物體內(nèi)的GmACP1基因表達(dá)量顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致酸性磷酸酶活性升高，顯著提高植物的耐低磷能力[6]。本研究通過一個(gè)功能已知的耐低磷基因GmACP1進(jìn)行BlastP同源比對(duì)，從谷子和其他3種禾本科植物的全基因組水平上共鑒定出13個(gè)ACP基因，ACP家族成員的數(shù)量和分布具有一定的規(guī)律性，均具有高度保守的磷酸酶結(jié)構(gòu)域。其中，在谷子中，本研究共鑒定的3個(gè)等電點(diǎn)均小于7的酸性磷酸酶基因SiACP，在酸性環(huán)境中可能著一定特殊的生物學(xué)功能。家族基因進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，單子葉植物ACP基因與雙子葉植物ACP基因的蛋白序列、基因結(jié)構(gòu)存在明顯的差別，推測在ACP家族基因的進(jìn)化過程出現(xiàn)在雙子葉植物綱和單子葉植物形成之前。在單子葉禾本科植物中，屬于C4植物的谷子SiACP基因、高粱SbACP基因和玉米ZmACP基因之間的親緣關(guān)系較近。

谷子作為傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)雜糧作物，具有耐貧瘠特性，其蘊(yùn)藏著重要的磷高效基因資源。挖掘谷子優(yōu)異的磷高效等位變異位點(diǎn)，并通過分子標(biāo)記加快培育磷高效品種，是解決土壤有效磷缺乏、降低種植成本的主要遺傳育種途徑之一。近幾年，隨著測序技術(shù)的發(fā)展和基因組學(xué)研究的不斷革新，關(guān)聯(lián)分析成為發(fā)掘與目標(biāo)性狀顯著有關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn)最有效的數(shù)量遺傳學(xué)手段。Weng等[20]利用175個(gè)優(yōu)良自交系鑒定基因ZmIPT2位點(diǎn)多態(tài)性，并與粒質(zhì)量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果檢測到16個(gè)SNP和7個(gè)單倍型與粒質(zhì)量顯著關(guān)聯(lián)。Liu等[21]利用候選基因關(guān)聯(lián)策略對(duì)玉米ZmDREB基因和耐旱相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZmDREB2.7基因的啟動(dòng)子區(qū)InDel位點(diǎn)與根長存在顯著關(guān)聯(lián)，該位點(diǎn)是導(dǎo)致ZmDREB2.7基因功能差異的關(guān)鍵位點(diǎn)，此研究不僅解析了玉米耐旱機(jī)制，而且為分子設(shè)計(jì)育種提供了新的選擇靶點(diǎn)。此外，Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，ZmVPP1基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)InDel與耐旱性狀顯著關(guān)聯(lián)，并且發(fā)現(xiàn)該InDel是3個(gè)MYB反式作用因子，調(diào)控著基因ZmVPP1表達(dá)，從而提高植株耐旱性。在逆境過程中，基因的啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控過程中起著重要的作用[23]。

本研究通過候選基因關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，基因SiACP1的啟動(dòng)子不僅具有多態(tài)性，而且存在著多個(gè)與低磷條件下的株高、相對(duì)株高和相對(duì)根長表型顯著關(guān)聯(lián)的共性SNP。進(jìn)一步對(duì)SiACP1基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，可將138份谷子核心種質(zhì)劃分成7種單體型，結(jié)合耐低磷相關(guān)表型并成功鑒定到一個(gè)與耐低磷相關(guān)的有利的單倍型ACPHap2。雖然與Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)的與大豆磷高效相關(guān)GmACP1基因的單倍型位置有一定區(qū)別(內(nèi)含子和外顯子)，但是單子葉植物ACP基因與雙子葉植物ACP基因進(jìn)化過程中出現(xiàn)分歧，推測位于SiACP1基因啟動(dòng)子區(qū)的SNP很有可能是影響谷子種質(zhì)在低磷條件下相關(guān)表型變化的主要原因。這些結(jié)果均證明，SiACP1基因在進(jìn)化過程中自然變異位點(diǎn)對(duì)于抵御土壤磷缺乏較為重要，將為后期大規(guī)模篩選耐低磷種質(zhì)和遺傳育種改良新品種提供一定的基因信息。