李 川，黃 璐，張美微，張盼盼，劉京寶，牛 軍，喬江方

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002)

玉米是我國重要的糧食、飼料、經(jīng)濟(jì)三元作物。2018年我國玉米播種面積4 200萬hm2，總產(chǎn)量2.573億t。隨著農(nóng)村勞動(dòng)力轉(zhuǎn)移及我國農(nóng)業(yè)機(jī)械化水平的提高[1-2]，生產(chǎn)上對(duì)適宜機(jī)械化收獲的玉米品種需求愈來愈高，尤其是具備籽粒脫水速率快、早熟高產(chǎn)、抗倒性好等特性的機(jī)械粒收品種[3-5]。目前，玉米脫水速率相關(guān)文獻(xiàn)多從植株性狀、生理特征方面進(jìn)行研究。有文獻(xiàn)表明，玉米苞葉層數(shù)、厚度及松緊程度影響籽粒脫水速率[6-8]。玉米生理成熟時(shí)籽粒含水量與散粉時(shí)間、軸粗、百粒質(zhì)量、穗位高、根倒伏呈顯著正相關(guān)[9]，而果柄短、籽粒小有助于籽粒脫水。總之，田間自然脫水速率與植株性狀相關(guān)，低株高、高穗位、開花期較多綠葉數(shù)、高莖稈含水率、低葉片含水率、穗粗直徑小、穗行數(shù)少、籽粒寬度大、苞葉薄、百粒質(zhì)量小有利于籽粒脫水[10-12]。玉米籽粒含水量與籽粒破碎率、雜質(zhì)率、落籽率呈顯著正相關(guān)[13]。不同玉米品種脫水速率不同。白色胚乳晚熟玉米脫水速率較慢，不同熟期玉米雜交種籽粒脫水速率存在顯著差異[14]。

植物激素在作物生長發(fā)育過程起著重要的調(diào)控作用，脫落酸(ABA)尤為重要[15-16]。灌漿早期噴施外源ABA降低灌漿速率，并與ABA濃度呈正相關(guān)[17]；灌漿中期高濃度噴施外源ABA降低灌漿速率[18-19]。灌漿速率是影響玉米粒質(zhì)量的主要限制因素，進(jìn)而影響百粒質(zhì)量和產(chǎn)量[20-21]。高濃度ABA破壞胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制胚乳細(xì)胞分裂從而減少胚乳細(xì)胞及淀粉粒數(shù)目[22-24]。玉米胚中ABA含量變化與脫水耐性相關(guān)[25]。外源ABA加快種子胚脫水速率[26]。但外源ABA影響玉米脫水速率的分子機(jī)制尚未明確。鑒于此，在灌漿早期分別對(duì)脫水速率較快的迪卡517和脫水速率較慢的鄭單1002穗部噴施外源ABA，然后利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘相關(guān)差異表達(dá)基因并注釋其功能，分析其代謝途徑和轉(zhuǎn)錄因子，以期找到ABA影響玉米脫水速率的重要響應(yīng)基因及調(diào)控途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米材料為迪卡517(DK517)、鄭單1002(ZD1002)。其中，DK517由中種國際種子有限公司選育，并于2017年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定，審定編號(hào)：國審玉20170005，該品種生理成熟后籽粒脫水速度快葉片干枯，有利于籽粒直接收獲；ZD1002由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育，于2015年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定，審定編號(hào)：國審玉2015017，該品種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病性強(qiáng)，適合黃淮海地區(qū)夏播，該品種籽粒脫水速率一般，在籽粒乳線消失之后適時(shí)收獲可以增加產(chǎn)量。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料于2018年6月18日播種于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究與示范試驗(yàn)基地(原陽)，該地屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候。供試土壤為潮土，地勢平坦，肥力均勻，排灌方便，試驗(yàn)田前茬作物為小麥，常規(guī)田間管理。0～30 cm耕層土壤有機(jī)質(zhì)含量17.25 g/kg、全氮含量0.96 g/kg、速效氮含量 79.35 mg/kg、有效磷含量10.22 mg/kg、速效鉀含量94.56 mg/kg。

DK517和ZD1002的種植密度均為67 500株/hm2，60 cm等行距種植，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)。8月3-4日抽雄，在吐絲之前，每小區(qū)標(biāo)記生長一致、無病蟲害的代表性植株并進(jìn)行雌穗套袋，8月5-6日授粉，8月9日算作灌漿啟動(dòng)。用0.08‰外源ABA(ABA80)(0.5%(V/V)Tween-20作為展開劑)進(jìn)行噴施，分別于8月6，14，16日(均為晴天)16：00-17：00對(duì)穗位葉和穗部進(jìn)行噴施；對(duì)照 (CK)套袋授粉后正常生長。

1.3 取樣材料

灌漿14 d后(8月22日)開始取樣，每個(gè)樣本由5株長勢較為一致的玉米穗位葉混合組成，生物學(xué)重復(fù)3次，命名為：DK518-ABA80-1、DK518-ABA80-2、DK518-ABA80-3；DK518-CK-1、DK518-CK-2、DK518-CK-3；ZD1002-ABA80-1、ZD1002-ABA80-2、ZD1002-ABA80-3；ZD1002-CK-1、ZD1002-CK-2、ZD1002-CK-3。取樣后立即放于液氮中，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

按照RNeasy plant mini kit(Qiagen，Germany) 試劑盒操作步驟提取上述樣本總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)總RNA的完整性，用Agilent Bioanalyzer 2100 system(Aglilent Technologies，USA)生物芯片分析檢測儀檢測所提RNA的質(zhì)量，并用Nanodrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (Nanodrop Technologie，USA) 定量檢測所提RNA的濃度。將檢測合格的RNA 樣本送至北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建cDNA文庫，然后用Illumina HiSeqTM2500測序儀進(jìn)行高通量測序，結(jié)果序列為pair-end序列。

1.5 基因功能注釋

通過去除接頭序列、低質(zhì)量序列、多N序列及長度過短序列，對(duì)測序原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制得到干凈序列，并計(jì)算測序堿基錯(cuò)誤率及GC堿基含量。利用Hisat 2序列比對(duì)軟件，采用BWT算法將所得干凈序列與參考基因組B73序列(https：//www.maizegdb.org/)進(jìn)行比對(duì)。利用RSeQC-2.6.3軟件對(duì)比對(duì)所得基因進(jìn)行測序飽和度、基因覆蓋度及冗余序列分析后，參照蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫Nr (NCBI non-redundant protein sequences)、核酸序列數(shù)據(jù)庫Nt (NCBI non-redundant nucleotide sequence)、蛋白質(zhì)家族集合數(shù)據(jù)庫Pfam (Protein family)、真核生物蛋白相鄰類聚簇?cái)?shù)據(jù)庫KOG/COG (Clusters of orthologous groups of proteins)、蛋白質(zhì)序列詳細(xì)信息數(shù)據(jù)庫Swiss-Prot (A manually annotated and reviewed protein sequence database)、京都基因組數(shù)據(jù)庫KO (KEGG orthology database)、基因本體論聯(lián)合會(huì)建立的基因相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫GO(Gene ontology)等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋。

1.6 篩選差異表達(dá)基因

在轉(zhuǎn)錄組測序分析中用R(F)PKM值(每1 000 000條序列中每個(gè)基因以1 000個(gè)堿基為單位，比對(duì)上的序列數(shù)量)衡量基因表達(dá)水平。依據(jù)基因數(shù)量并用edgeR軟件計(jì)算差異表達(dá)基因(P<0.05)。顯著差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為基因錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR<0.05 &基因表達(dá)量差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值|log2FC|≥2。之后參照GO數(shù)據(jù)庫，將差異基因按照生物學(xué)過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)、細(xì)胞組分(Cellular component)三大類對(duì)基因功能進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的分類。參照KEGG ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes) 數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)基因參與的代謝途經(jīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

12個(gè)樣本全轉(zhuǎn)錄組高通量測序共獲得90.71 Gb干凈序列，各樣品干凈序列均達(dá)到6.09 Gb，堿基質(zhì)量值(Q30)在91.41%及以上，分別將各樣品的干凈序列與參考基因組B73序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)效率為84.69%～90.06%?；谛蛄斜葘?duì)結(jié)果，進(jìn)行可變剪接預(yù)測分析、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化分析以及新基因的發(fā)掘，發(fā)掘新基因7 998個(gè)，其中6 444個(gè)得到功能注釋。

表1詳細(xì)統(tǒng)計(jì)了12個(gè)樣品的測序結(jié)果。DK517-ABA80-1原始測序經(jīng)過質(zhì)量剪切過濾后獲得了49 659 930 條干凈序列，GC含量為55.02%，沒有AT/GC分離現(xiàn)象，Q30值達(dá)91.75%；利用Hisat2序列比對(duì)軟件與參照B73基因組比對(duì)，88.42%的序列配對(duì)成功，獲得43 908 042條配對(duì)序列。

DK517-CK-1原始測序經(jīng)過質(zhì)量剪切過濾后獲得了49 337 744條干凈序列，GC含量為55.95%，沒有AT/GC分離現(xiàn)象，Q30值達(dá)92.66%；利用Hisat2序列比對(duì)軟件與參照B73基因組比對(duì)，88.68%的序列配對(duì)成功，獲得43 754 859條配對(duì)序列。其余樣本的測序結(jié)果詳見表1。由表1可見，測序結(jié)果比較可靠。

表1 12個(gè)外源ABA處理穗位葉樣本轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Statistics of transcriptome data of 12 ear-samples treated by ABA

2.2 外源ABA處理相關(guān)差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

外源ABA處理后，將不同樣本中表達(dá)水平存在顯著差異的基因命名為差異表達(dá)基因(DEG)。DEG可以劃分為上調(diào)基因(Up-regulated gene)和下調(diào)基因(Down-regulated gene)。用R(F) PKM衡量比對(duì)到的基因表達(dá)量。12個(gè)測序樣本分成3個(gè)對(duì)比組進(jìn)行分析，用A VS B表示，由圖1可見，DK517外源ABA處理材料與正常生長條件材料對(duì)比組(DK517-ABA80 VS DK517-CK，下同)差異表達(dá)基因共檢測到1 732個(gè)DEG，其中1 251個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，481個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因；DK517中上調(diào)表達(dá)基因個(gè)數(shù)占總差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)的72.23% 。另外，檢測到36 490個(gè)表達(dá)差異不顯著的基因。ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK差異表達(dá)基因檢測到52個(gè)DEG，其中24個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，28個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因；ZD1002中上調(diào)表達(dá)基因占總差異表達(dá)基因的46.15%。另外，檢測到38 917個(gè)表達(dá)差異不顯著的基因。DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80差異表達(dá)基因共檢測到3 867個(gè)DEG，其中1 946個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，1 921個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因；另外，檢測到36 265個(gè)表達(dá)差異不顯著的基因。

每個(gè)圓點(diǎn)表示1個(gè)基因，橫坐標(biāo)表示某個(gè)基因在兩樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值；橫坐標(biāo)絕對(duì)值越大,說明表達(dá)量在兩樣品間的表達(dá)量倍數(shù)差異越大；縱坐標(biāo)表示基因表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的負(fù)對(duì)數(shù)值。縱坐標(biāo)值越大，表明差異表達(dá)越顯著，篩選得到的差異表達(dá)基因越可靠。

2.3 外源ABA處理相關(guān)差異表達(dá)基因類別分析

參照GO數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)，按照生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分3個(gè)主要分支統(tǒng)計(jì)3個(gè)測序樣本組中DEG的GO分類情況。DK517-ABA80 VS DK517-CK差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞凋零、生物節(jié)奏過程、單有機(jī)體過程、多有機(jī)體過程、繁殖過程、復(fù)制、多細(xì)胞有機(jī)體過程、發(fā)育過程、細(xì)胞成分組織或生物合成、生物調(diào)控、刺激反應(yīng)、細(xì)胞過程、代謝過程、定位、信號(hào)、免疫系統(tǒng)過程、生長、生物階段、脫毒19個(gè)不同生物學(xué)過程分類；細(xì)胞成分、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞器成分、大分子復(fù)合體、細(xì)胞外區(qū)成分、細(xì)胞膜成分、細(xì)胞連接、超大分子復(fù)合體、細(xì)胞外區(qū)、膜封閉內(nèi)腔12個(gè)不同細(xì)胞組分分類；結(jié)合、催化活性、運(yùn)輸活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)構(gòu)分子活性、電子載體活性、分子功能調(diào)節(jié)因子、信號(hào)傳遞活性、抗氧化活性、分子傳遞活性、營養(yǎng)儲(chǔ)備活性、轉(zhuǎn)錄因子活性及蛋白質(zhì)結(jié)合12個(gè)不同分子功能分類。ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK差異表達(dá)基因主要富集于單有機(jī)體過程、多細(xì)胞有機(jī)體過程、繁殖過程、復(fù)制、多有機(jī)體過程、發(fā)育過程、細(xì)胞成分組織或生物合成、生物調(diào)控、刺激反應(yīng)、細(xì)胞過程、代謝過程、定位、生長13個(gè)不同生物學(xué)過程分類；細(xì)胞成分、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞器成分、大分子復(fù)合體、細(xì)胞外區(qū)成分、細(xì)胞膜成分、細(xì)胞連接、膜封閉內(nèi)腔10個(gè)不同細(xì)胞組分分類；結(jié)合、催化活性、電子載體活性、營養(yǎng)儲(chǔ)備活性4個(gè)不同分子功能分類。DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80差異表達(dá)基因主要富集于單有機(jī)體過程、運(yùn)動(dòng)、多有機(jī)體過程、繁殖過程、復(fù)制、多細(xì)胞有機(jī)體過程、發(fā)育過程、細(xì)胞成分組織或生物合成、生物調(diào)控、刺激反應(yīng)、細(xì)胞過程、代謝過程、定位、信號(hào)、免疫系統(tǒng)過程、生長、生物階段、脫毒18個(gè)不同生物學(xué)過程分類；細(xì)胞成分、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞器成分、大分子復(fù)合體、細(xì)胞外區(qū)成分、細(xì)胞膜成分、細(xì)胞連接、超大分子復(fù)合體、細(xì)胞外區(qū)、膜封閉內(nèi)腔12個(gè)不同細(xì)胞組分分類；結(jié)合、催化活性、運(yùn)輸活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)構(gòu)分子活性、電子載體活性、分子功能調(diào)節(jié)因子、信號(hào)傳遞活性、抗氧化活性、分子傳遞活性、營養(yǎng)儲(chǔ)備活性、轉(zhuǎn)錄因子活性及蛋白質(zhì)結(jié)合12個(gè)不同分子功能分類。

參照COG數(shù)據(jù)庫對(duì)檢測到的差異表達(dá)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類。DK517-ABA80 VS DK517-CK差異表達(dá)基因主要分布于染色體結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化過程、能量產(chǎn)生及儲(chǔ)存、細(xì)胞循環(huán)控制細(xì)胞分裂及染色體分區(qū)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、脂類轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、翻譯核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制修復(fù)及重組、細(xì)胞壁細(xì)胞膜及被膜生物合成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、翻譯后修飾蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)及分子伴侶、無機(jī)離子運(yùn)輸及代謝、次級(jí)代謝物生物合成運(yùn)輸及分解代謝、通用功能預(yù)測、未知功能、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、胞內(nèi)運(yùn)輸分泌及膜泡運(yùn)輸、防衛(wèi)機(jī)制、細(xì)胞骨架、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)23個(gè)不同COG數(shù)據(jù)庫分類。ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK差異表達(dá)基因主要分布于細(xì)胞循環(huán)控制細(xì)胞分裂及染色體分區(qū)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、翻譯核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成、細(xì)胞壁細(xì)胞膜及被膜生物合成、翻譯后修飾蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)及分子伴侶、次級(jí)代謝物生物合成運(yùn)輸及分解代謝、通用功能預(yù)測、防衛(wèi)機(jī)制8個(gè)不同COG數(shù)據(jù)庫分類。DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA差異表達(dá)基因的COG數(shù)據(jù)庫分類與DK517-ABA80 VS DK517-CK相似，僅少了1個(gè)染色體結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)COG數(shù)據(jù)庫分類，但同一COG數(shù)據(jù)庫分類中富集到的差異表達(dá)基因數(shù)目不同。

生物體內(nèi)不同基因產(chǎn)物往往相互協(xié)調(diào)而行使生物學(xué)功能。因此，對(duì)差異表達(dá)基因的代謝途徑(Pathway)進(jìn)行注釋分析可進(jìn)一步了解基因功能。KEGG數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析基因功能及基因組信息的數(shù)據(jù)庫，把基因和表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。KEGG數(shù)據(jù)庫包括碳水化合物、核苷酸、氨基酸等代謝及有機(jī)物的生物降解。圖2-4展示了3個(gè)對(duì)比組差異表達(dá)基因KEGG注釋結(jié)果通路類型分類。DK517-ABA80 VS DK517-CK差異表達(dá)基因注釋到100個(gè)不同代謝通路中，其中富集到的差異表達(dá)基因≥10的代謝通路主要有植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工過程、DNA復(fù)制、同源重組、不匹配修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、核糖體、真核細(xì)胞中核糖體合成、天冬氨酸及谷氨酸代謝、半胱氨酸及蛋氨酸代謝、纈氨酸亮氨酸及異亮氨酸降解、果糖及甘露糖代謝、糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝、淀粉及蔗糖代謝、光合器官中碳固定、光合作用、氨基酸生物合成、碳水化合物代謝、谷胱甘肽代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝(圖2)。其中，尤其值得注意的是植物激素信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)通路，共富集22個(gè)差異表達(dá)基因，如表2所示。

縱坐標(biāo)為KEGG代謝途徑名稱；橫坐標(biāo)為注釋到該通路下的基因個(gè)數(shù)及其個(gè)數(shù)占被注釋上的基因總數(shù)的比例。圖3-4同。The ordinate is KEGG metabolic pathway；The abscissa is gene numbers annotated to the pathway and the proportion of gene numbers annotated to the total number of genes annotated.The same as Fig.3-4.

表2 DK517-ABA80 VS DK517-CK植物激素信號(hào)傳導(dǎo)通路中共同差異表達(dá)基因Tab.2 List of DEGs in plant hormone signal transduction pathway in DK517-ABA80 VS DK517-CK group

由圖3可以看出，ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK差異表達(dá)基因注釋到12個(gè)不同代謝通路中，每個(gè)代謝通路只有1個(gè)差異表達(dá)基因。12個(gè)不同的代謝通路分別為蛋白酶體、RNA降解、核苷酸切除修復(fù)、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、丙氨酸天冬氨酸及谷氨酸代謝、精氨酸生物合成、氨基酸及核苷酸代謝、果糖及甘露糖代謝、光合器官中碳固定、氨基酸生物合成、碳代謝、2-氧化羧酸代謝通路。

圖3 外源ABA處理后ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK對(duì)比組差異表達(dá)基因KEGG分類圖Fig.3 DEGs KEGG taxonomic map of ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK group treated by ABA

由圖4可以看出，DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80差異表達(dá)基因注釋到107個(gè)不同代謝通路中，其中富集到的差異表達(dá)基因≥10的代謝通路主要有內(nèi)吞作用、過氧化物酶體、激酶信號(hào)系統(tǒng)、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工過程、RNA降解、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、DAN復(fù)制、同源重組、不匹配修復(fù)、核苷酸修復(fù)、接合體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核糖體、真核細(xì)胞中核糖體合成、mRNA監(jiān)測途徑、半胱氨酸及蛋氨酸代謝、苯丙醇生物合成、氨基酸及核苷酸代謝、檸檬酸循環(huán)、果糖及甘露糖代謝、糖酵解/糖異生、乙醛酸及二羧酸酯代謝、淀粉及蔗糖代謝、光合器官中碳固定、氨基酸生物合成、碳水化合物代謝、脂肪酸代謝、甘油脂類代謝、谷胱甘肽代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝、植物病原體相互作用通路。植物激素信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)通路中共富集24個(gè)差異表達(dá)基因(表3)。

圖4 外源ABA處理后DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80對(duì)比組差異表達(dá)基因KEGG分類圖Fig.4 DEGs KEGG taxonomic map of DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80 group treated by ABA

表3 DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80植物激素信號(hào)傳導(dǎo)通路中共同差異表達(dá)基因Tab.3 List of DEGs in plant hormone signal transduction pathway in DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80 group

2.4 外源ABA處理相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析

DK517及ZD1002穗位葉噴施外源ABA后，轉(zhuǎn)錄組測序后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析，獲得多個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，結(jié)果如圖5所示，主要有AGC蛋白激酶家族、AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族、AUX/IAA轉(zhuǎn)錄因子家族、B3轉(zhuǎn)錄因子家族、ARID轉(zhuǎn)錄因子、Alfin-like轉(zhuǎn)錄因子、Aur轉(zhuǎn)錄因子家族、BBR-BPC轉(zhuǎn)錄因子家族、BES1轉(zhuǎn)錄因子、BUB轉(zhuǎn)錄因子、C2C2-CO-like轉(zhuǎn)錄因子。在本研究中檢測到51個(gè)差異表達(dá)基因含有AGC類轉(zhuǎn)錄因子家族。檢測到193個(gè)差異表達(dá)基因含有AP2/ERF-ERF轉(zhuǎn)錄因子，24個(gè)差異表達(dá)基因含有AP2/ERF-AP2轉(zhuǎn)錄因子，5個(gè)差異表達(dá)基因含有AP2/ERF-RAV轉(zhuǎn)錄因子。檢測到53個(gè)差異表達(dá)基因含有AUX/IAA類轉(zhuǎn)錄因子家族。檢測到91個(gè)差異表達(dá)基因含有B3類轉(zhuǎn)錄因子家族。

2.5 外源ABA對(duì)不同品玉米種脫水速率相關(guān)基因的影響

圖6 對(duì)比分析了外源ABA對(duì)不同玉米品種脫水速率相關(guān)基因的影響。DK517-ABA80 VS DK517-CK(G1對(duì)比組)、ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK(G3對(duì)比組)共檢測到了10個(gè)共同差異表達(dá)基因，分別為：Zm00001d035000，在G1對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，在玉米中表達(dá)未標(biāo)記蛋白LOC100279096；Zm00001d042063，在G1、G3對(duì)比組中均呈上調(diào)表達(dá)，玉米植株中表達(dá)假設(shè)蛋白 ZEAMMB73；Zm00001d045314，在G1對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，在玉米中表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶；Zm00001d003938，在G1對(duì)比組上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組下調(diào)表達(dá)，在玉米中表達(dá)甾醇皂苷；Zm00001d028647，在G1對(duì)比組中呈上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中呈下調(diào)表達(dá)，在玉米中表達(dá)未標(biāo)記蛋白LOC100280456；Zm00001d029778，在G1對(duì)比組中呈上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中呈下調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)EC蛋白同系物；Zm00001d032186，在G1、G3對(duì)比組中均呈上調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)未標(biāo)記蛋白LOC100192110前體；Zm00001d033447，在G1對(duì)比組中呈上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中呈下調(diào)表達(dá)，功能未知；Zm00001d037988，在G1對(duì)比組中呈上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中呈下調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)EMB564蛋白；Zm00001d046065，在G1對(duì)比組中呈上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中呈下調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶B催化亞體。G1對(duì)比組中存在1 722個(gè)特異的差異表達(dá)基因；G3對(duì)比組中存在42個(gè)特異的差異表達(dá)基因。

圖5 外源ABA處理不同玉米材料中轉(zhuǎn)錄因子分析結(jié)果Fig.5 Transcription factor analysis map of different material groups treated with exogenous ABA

G1.DK517-ABA80 VS DK517-CK；G2.DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80；G3.ZD1002-ABA80 VS ZD1002-CK。

G1對(duì)比組與DK517-ABA80 VS ZD1002-ABA80(G2對(duì)比組)共檢測到了268個(gè)共同差異表達(dá)基因；G1對(duì)比組中存在1 464個(gè)特異的差異表達(dá)基因，G2對(duì)比組中存在3 599個(gè)特異的差異表達(dá)基因。

G2對(duì)比組與G3對(duì)比組中共檢測到了15個(gè)共同差異表達(dá)基因，分別為：Zm00001d035000，在G1對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，在玉米中表達(dá)未標(biāo)記蛋白LOC100279096；Zm00001d042063，在G1對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)，在玉米中表達(dá)假設(shè)蛋白 ZEAMMB73；Zm00001d045314，在G1對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，在玉米中表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶；Zea_mays_newGene_10770，在G2對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，在玉米中表達(dá)假設(shè)蛋白E3泛酸蛋白連接酶SIS3；Zea_mays_newGene_18254、Zea_mays_newGene_20460均在G2對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，功能未知；Zea_mays_newGene_21290，在G2對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，玉米植株中表達(dá)未標(biāo)記蛋白LOC109940605；Zm00001d003872在G2對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)，玉米植株中表達(dá)未標(biāo)記蛋白LOC100280055 異構(gòu)體 X1；Zm00001d009259，在G2對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RUNKEL；Zm00001d011419，在G2對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)細(xì)胞色素P450 72A15；Zm00001d017019，在G2對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)ATFP4蛋白；Zm00001d024522，在G2對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)，在玉米植株表達(dá)bHLH轉(zhuǎn)錄因子；Zm00001d028374，在G2對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)早期真菌誘導(dǎo)蛋白CMPG1；Zm00001d032658，在G2對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)假設(shè)蛋白ZEAMMB73_Zm00001d032658；Zm00001d034413，在G2對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)而在G3對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，在玉米植株中表達(dá)球蛋白2前體。G2對(duì)比組中存在3 852個(gè)特異的差異表達(dá)基因；G3對(duì)比組中存在37個(gè)特異的差異表達(dá)基因。

ABA影響玉米籽粒灌漿速率及脫水速率。對(duì)檢測到的差異表達(dá)基因GO分類分析后獲得73個(gè)DEG與水分代謝相關(guān)，推測這些基因正是作為外源ABA調(diào)控的下游基因起作用，具體見表4。

表4 DK517和ZD1002葉片中與水分代謝通路相關(guān)的差異表達(dá)基因篩選Tab.4 List of DEGs which is related with water metabolism pathway in DK517 and ZD1002 leaf samples

3 結(jié)論與討論

在花粒期對(duì)籽粒不同脫水速率玉米品種DK517、ZD1002噴施外源ABA，對(duì)12個(gè)穗位葉樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)脫水速率較快的品種DK517在噴施外源ABA后有1 732個(gè)基因的表達(dá)水平達(dá)到顯著差異水平，其中1 251個(gè)上調(diào)表達(dá)，481個(gè)下調(diào)表達(dá)。脫水速率較慢的品種ZD1002在噴施外源ABA后只有52個(gè)基因的表達(dá)水平達(dá)到顯著差異水平，其中24個(gè)上調(diào)表達(dá)，28個(gè)下調(diào)表達(dá)。DK517中有更多參與ABA調(diào)控籽粒脫水過程的基因在表達(dá)水平上發(fā)生了顯著變化，推測正是這些基因共同作用加快了籽粒脫水速率，使得DK517適宜機(jī)收。DK517中上調(diào)表達(dá)基因個(gè)數(shù)占總差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)的72.23%，ZD1002中上調(diào)表達(dá)基因占總差異表達(dá)基因的46.15%，遠(yuǎn)低于DK517中上調(diào)表達(dá)基因所占比例。

DK517差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果主要富集于19個(gè)不同生物學(xué)過程分類、12個(gè)不同細(xì)胞組分分類、12個(gè)不同分子功能分類；主要分布于染色體結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化過程等23個(gè)COG 數(shù)據(jù)庫分支；注釋到100個(gè)不同代謝通路中。ZD1002差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果主要富集于13個(gè)不同生物學(xué)過程分類、10個(gè)不同細(xì)胞組分分類、4個(gè)不同分子功能分類；主要分布于細(xì)胞循環(huán)控制細(xì)胞分裂及染色體分區(qū)等8個(gè)COG 數(shù)據(jù)庫分支；注釋到12個(gè)不同代謝通路中。由此推測，不同玉米籽粒脫水速率品種中外源ABA調(diào)控的內(nèi)在分子機(jī)制不同。

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中廣泛存在的能與DNA特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子，其通過與順式作用元件特異性結(jié)合調(diào)控下游基因表達(dá)，參與植物生長發(fā)育過程中眾多的生物學(xué)功能。AGC蛋白激酶家族由一系列在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的激酶組成，包含蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白激酶C，共有63個(gè)家族成員，與細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)通路相關(guān)[27]。本研究中，共檢測到51個(gè)差異表達(dá)基因含有AGC類轉(zhuǎn)錄因子家族。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于植物中，含有保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。根據(jù)該結(jié)構(gòu)域內(nèi)序列的相似性和AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，可以將植物AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子分成DREB (Dehydration-responsive element binding protein)、ERF (Ethylene-responsive element binding factors)、 AP2 (APETALA 2)、RAV (Related to ABI3/VP1)和其他類別等5個(gè)亞家族[28]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物學(xué)過程，包括干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫響應(yīng)等。在植物受到逆境刺激后，脫落酸、乙烯等信號(hào)相應(yīng)被激活，并激活A(yù)P2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而調(diào)控功能基因的表達(dá)。本研究中，共檢測到193個(gè)差異表達(dá)基因含有AP2/ERF-ERF轉(zhuǎn)錄因子，24個(gè)差異表達(dá)基因含有AP2/ERF-AP2轉(zhuǎn)錄因子，5個(gè)差異表達(dá)基因含有AP2/ERF-RAV轉(zhuǎn)錄因子。AUX/IAA為生長素調(diào)節(jié)類轉(zhuǎn)錄因子。生長素水平和生長素信號(hào)通路調(diào)控系統(tǒng)對(duì)植物防御網(wǎng)絡(luò)有重要作用，生長素也可以直接作為抗菌活性的防御分子參與植物免疫反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)。生長素信號(hào)傳導(dǎo)主要受到AUX/IAA和生長素響應(yīng)因子(ARFs)2類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。ARFs具有能夠與DNA結(jié)合的區(qū)域，可以與生長素響應(yīng)基因啟動(dòng)子中的生長素響應(yīng)元件結(jié)合，激活生長素響應(yīng)基因的表達(dá)。在不含有生長素或生長素濃度很低的環(huán)境下，AUX/IAA蛋白能與ARFs結(jié)合，使其不能激活下游生長素響應(yīng)基因的表達(dá)；當(dāng)生長素濃度升高時(shí)，生長素能夠促進(jìn)AUX/IAA蛋白的泛素化降解，解除其對(duì)ARFs的抑制作用，從而使下游生長素響應(yīng)基因的表達(dá)被成功激活[29]。本研究中，共檢測到53個(gè)差異表達(dá)基因含有AUX/IAA類轉(zhuǎn)錄因子家族。B3轉(zhuǎn)錄因子家族在被子植物中廣泛存在，數(shù)目眾多，具有高度保守的B3-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分為ARF (Auxin responsefactor)、ABI3/VP1、HSI (High-level expression of sugar-inducible gene)、RAV (Related to ABI3/VP1)、REM(Reproductive meristem) 5個(gè)家族。其中，B3-ARF轉(zhuǎn)錄因子亞家族屬于生長素響應(yīng)因子，主要參與生長素響應(yīng)有關(guān)的植物生理功能。B3轉(zhuǎn)錄因子家族在植物激素的合成以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、種子發(fā)育、開花調(diào)控、生物及非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[30]。本研究共檢測到91個(gè)差異表達(dá)基因含有B3類轉(zhuǎn)錄因子家族。