郭坤元， 張欣欣

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院 中藥材研究所，國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術體系恩施綜合試驗站，湖北 恩施 445000；2.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心 中藥材分中心，湖北 恩施 445000；3.東北林業(yè)大學 鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，“東北鹽堿植被恢復與重建”教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

蛋白酶抑制劑是一種廣泛存在于植物體內(nèi)，可以使蛋白酶活力下降的一類蛋白質(zhì)，很多蛋白酶抑制劑，特別是植物中的蛋白酶抑制劑，還具有抑制微生物病原體以及一些昆蟲蛋白酶的作用，是一種天然的防御系統(tǒng)[1]。蛋白酶抑制劑分布較廣，主要分為四大類：金屬蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、酸性蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑[2]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑于20世紀50年代首次在哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑都含有特定的Q-V-G保守區(qū)域及色氨酸殘基[3-4]，在植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑的氨基酸序列中，還包含有α螺旋結構序列[5]。近些年來，植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑已逐步分離出來，形成一個獨特的亞家族[6]。Kondo等[7]從水稻中發(fā)現(xiàn)并克隆了第一個植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因，緊接著在其他植物中，許多其他的植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[8-9]。研究表明，植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑在非生物逆境脅迫、病蟲害防御以及植物種子萌發(fā)、果實發(fā)育、程序性細胞死亡等生理過程中發(fā)揮著十分重要的作用[10-14]。

到目前為止，擬南芥中已有多個植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因被研究和報道[15]。在煙草中過量表達AtCYS1可以抑制和減少氧化脅迫或者氮氧脅迫造成的細胞損傷死亡[16]；AtCYS3過量表達的擬南芥植株可以提高對鹽堿和干旱等非生物逆境脅迫的耐受性[17]；對AtCYS1和AtCYS2啟動子的研究表明，它們在植物應對非生物逆境脅迫響應方面起著重要的作用機制[18]；在擬南芥中過量表達AtCYS4和AtCYS5不僅可以促進種子的萌發(fā)以及幼苗的生長，還可以提高轉(zhuǎn)基因植株對高溫脅迫的耐受性[19-20]。這些研究表明，擬南芥半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因在植物應對非生物逆境脅迫及生長發(fā)育中起著非常重要的作用。

本研究以擬南芥為研究對象，通過PCR擴增和測序方法克隆擬南芥半胱氨酸蛋白酶抑制劑AtCYS6基因全序列，分析其序列特征，構建其蛋白表達載體并進行蛋白誘導純化及酶活性分析，以期更全面了解AtCYS6基因，為更詳盡探索其參與調(diào)控的機理機制提供一定的研究基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(哥倫比亞型)、大腸桿菌 JM109和BL21菌株及原核表達載體pGEX-6p-3由湖北省農(nóng)業(yè)科學院中藥材研究所資源與育種實驗室保存，T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa公司，RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒等購自天根生化科技有限公司，木瓜蛋白酶、半胱氨酸、GST標簽蛋白純化柱填料和尼龍膜等購自生工生物工程股份有限公司，檢測GST標簽蛋白的一抗和二抗購自碧云天生物技術研究所，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因序列克隆 取培養(yǎng)14 d大小的擬南芥材料，在液氮下研磨均勻后，按照RNA提取試劑盒說明書的方法進行RNA提取，然后以提取的RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄試驗。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中AtCYS6基因序列(序列號：NC_003074.8)，以擬南芥cDNA為模板，利用上游引物F：5′-GTGAGAATGATGAGAAGCCG-3′，下游引物R：5′-GGAGAGGGACTAGTCATGGT-3′進行PCR擴增，退火溫度為54 ℃，同時以水為模板作為空白對照。

1.2.2 序列生物信息學分析 將獲得的AtCYS6氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析，利用DNAMAN等軟件對其與薺菜(Capsellarubella；XP_006298448.1)、薺藍(Camelinasativa；XP_010465015.1)、水稻(Oryzasativa；NP_001042702.1)、玉米(Zeamays；XP_008655485.1)、大豆(Glycinemax；NP_001237734.1)、山崳菜 (Eutremasalsugineum；XP_006407331.1)、煙草 (Nicotianatomentosiformis；XP_009601821.1)、高粱 (Sorghumbicolor；XP_002457629.1)、谷子(Setariaitalica；XP_004967724.1)等進行同源性分析，并利用MEGA 5軟件構建系統(tǒng)進化樹。在線網(wǎng)站分析，預測相對分子質(zhì)量及等電點(http：//web.expasy.org/protparam/)，進行疏水性分析(http：//web.expasy.org/protscale/)，利用TMHMM預測跨膜結構域分析(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，預測信號肽分析(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)，預測亞細胞定位分析(http：//psort.hgc.jp/form.html)，利用SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)進行結構域的三維同源建模。

1.2.3 AtCYS6-GFP蛋白的亞細胞定位 將AtCYS6-GFP瞬時表達載體利用聚乙二醇誘導法[21]，轉(zhuǎn)化擬南芥葉片細胞原生質(zhì)體，原生質(zhì)體先在黑暗條件過夜培養(yǎng)，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光信號位置。

1.2.4 pGEX-6p-3-AtCYS6融合表達載體的構建 根據(jù)目的序列利用引物進行擴增，上游引物F：5′-GGATCCATGATGAGAAGCCG-3′，下游引物R：5′-GTCGACCTAGTCATGGTGTT-3′，退火溫度為54 ℃。將PCR產(chǎn)物用BamH Ⅰ和SalⅠ與載體pGEX-6p-3連接，構建pGEX-6-3-AtCYS6表達載體，然后將構建好的融合表達載體轉(zhuǎn)化BL21菌株。

1.2.5 融合蛋白的誘導、純化及Western Blot分析 小量誘導：分別挑取含有pGEX-6-3和pGEX-6-3-AtCYS6質(zhì)粒的單克隆于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌液的OD600達到對數(shù)中期時開始進行融合蛋白的誘導，誘導時間分別為0，15，30，60，120，210 min，誘導結束后收集每個時間的大腸桿菌進行SDS-PAGE電泳；大量誘導及純化：根據(jù)小量誘導結果，利用三角瓶進行大量誘導，然后利用溶菌酶裂解菌液，菌液上清過GST 凝膠樹脂進行GST和GST-AtCYS6融合蛋白的純化，最后進行SDS-PAGE電泳及 Western Blot分析。

1.2.6 融合蛋白酶活性分析 將2.5～5.0 μg純化的GST蛋白和 GST-AtCYS6蛋白與15 mL 1.0 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液(100 mmol/L磷酸鈉，10 mmol/L EDTA，5 mmol/L半胱氨酸)混合，37 ℃孵育20 min，孵育結束后，往混合液里面加入500 μL 1.0 mg/mL的偶氮酪蛋白溶液(100 mmol/L磷酸鈉，15 mmol/L EDTA，15 mmol/L半胱氨酸)，37 ℃孵育60～90 min，孵育結束后，往反應液里加入200 μL 10%(V/V)的三氯乙酸(TCA)，于冰上放置30 min以終止反應，最后離心取上清于420 nm下測量OD值，所有試驗測定至少重復3次。

2 結果與分析

2.1 基因序列克隆

利用設計的引物對AtCYS6目的條帶進行擴增，擴增結果如圖1所示，AtCYS6片段的大小約為730 bp，證明擴增結果正確。

M.DNA Marker；1.空白對照；2，3.目的基因PCR擴增。M.DNA Marker；1.Blank control；2，3.Target gene PCR amplification.

2.2 序列生物信息學分析

利用在線網(wǎng)站(http：//web.expasy.org/protparam/)預測AtCYS6蛋白相對分子質(zhì)量為26.293 95 ku，等電點為5.85，化學式為C1179H1848N322O348S6，共含有3 703個原子數(shù)。蛋白親/疏水性預測結果顯示，約在第10個氨基酸位置，疏水性較大，峰值為3.025，在第65個氨基酸位置，親水性較大，峰值為-2.995，整個分布區(qū)域親水性氨基酸區(qū)域多于疏水性氨基酸區(qū)域，可認為AtCYS6為親水性蛋白(圖2-A)。SignalP 4.1 Server分析結果顯示C值為0.476，Y值為0.674，S值為0.994，得分較高，表明AtCYS6蛋白有信號肽(圖2-B)。TMHMM跨膜結構分析表明，AtCYS6蛋白含有1個跨膜區(qū)域(圖2-C)。亞細胞定位分析表明，AtCYS6蛋白定位于細胞質(zhì)的概率為0.82，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體中的概率為0.1，其他細胞器的概率較低。在其整個氨基酸序列中，谷氨酸(Glu)含量最高，達到了12%，亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)、纈氨酸(Val)的含量也相對比較高，超過8.5%，而半胱氨酸(Cys)的含量最少，不到1%。蛋白質(zhì)三級結構預測顯示它包含2個部分，第一部分是由3個反向平行的β片層包裹著一個α-螺旋中心組成，第二部分是由5個反向平行的β片層包裹著一個α-螺旋中心組成(圖2-D)。

A.疏水/親水性預測；B.信號肽預測；C.跨膜結構域預測；D.蛋白質(zhì)三級結構預測。A.Hydrophobic/hydrophilic prediction；B.Signal peptide prediction；C.Transmembrane domain prediction；D.Protein tertiary structure prediction.

2.3 氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

本研究將AtCYS6與其他物種中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑進行了比對，結果如圖3所示，AtCYS6與十字花科的薺菜、薺藍的同源性較高，同源性分別為81.1%，80.3%，同水稻、玉米和大豆的同源性較低，同源性分別為55.5%，54.3%，56.6%，且在氨基酸序列中間具有高度保守的Q-V-G(Gln-Val-Gly)序列。

圖3 AtCYS6氨基酸同源性比對Fig.3 Amino acid homology comparison of AtCYS6

本研究通過BioEdit、ClustalW和MEGA 5等生物軟件對AtCYS6和其他物種的半胱氨酸蛋白酶抑制劑編碼的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，如圖4所示，可以發(fā)現(xiàn)AtCYS6與薺菜、薺藍的親緣性最近，并且都同屬于十字花科，同水稻、玉米、高粱、谷子等禾本科植物的親緣性較遠。

2.4 AtCYS6-GFP蛋白的亞細胞定位

將AtCYS6-GFP融合蛋白表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥葉片原生質(zhì)體，首先在大視野下觀察GFP熒光信號情況，如圖5-A所示，在大視野下，觀察到許多熒光信號，表明AtCYS6-GFP熒光信號可以正常表達；然后在小視野下選取原生質(zhì)體進行觀察，如圖5-B所示，AtCYS6-GFP在整個細胞質(zhì)均有表達，這與預測的結果相符合。

2.5 融合蛋白的誘導、純化及Western Blot分析

為了檢測融合蛋白的表達情況，本研究首先進行了小量誘導表達試驗，在不同時間誘導之后，進行凝膠電泳檢測，其中融合蛋白分子量約為52 ku，GST蛋白分子量約為26 ku。檢測結果如圖6所示：在IPTG誘導下，對照組中誘導0 min時未檢測到GST蛋白(泳道1)，誘導210 min后，檢測到大量GST蛋白(泳道2)；試驗組誘導0 min時未檢測到融合蛋白(泳道3)，隨著誘導時間的延長，開始檢測到融合蛋白的表達，時間逐漸延長，融合蛋白的表達量也逐漸增加，同時結果還發(fā)現(xiàn)誘導120 min和誘導210 min融合蛋白的表達量差別不大。

圖4 系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis

A.大視野下觀察；B.小視野下觀察。A.Observation in the big view；B.Observation in the small view.

M.蛋白質(zhì)Marker；1-2.對照組誘導0，210 min；3-8.試驗組誘導0，15，30，60，120，210 min。M.Protein Marker；1-2.Control group induction for 0，210 minutes；3-8.Experience group induction for 0，15，30，60，120，210 minutes.

根據(jù)小量誘導表達結果，本研究對融合蛋白進行大量誘導表達及純化，結果如圖7-A所示，得到了純化的GST蛋白(泳道1)和GST-AtCYS6融合蛋白(泳道3)；本研究進一步對GST-AtCYS6融合蛋白進行了Western Blot分析，如圖7-B所示，檢測到信號(泳道5)。這些結果說明，GST-AtCYS6融合蛋白正確翻譯表達，另外純化出來的蛋白也沒有出現(xiàn)結構上的斷裂或者降解的情況。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.純化的GST蛋白；2.空泳道；3.純化的GST-AtCYSb蛋白；4-5.Western Blot分析。M.Protein Marker；1.Purified GST protein；2.Empty lane；3.Purified GST-AtCYSb protein；4-5.Western Blot analysis.

2.6 融合蛋白酶活性分析

本研究對GST-AtCYS6融合蛋白的酶活性進行了檢測分析，結果如圖8所示：在沒有添加融合蛋白的時候，酶活性抑制率為0，當添加融合蛋白后，木瓜蛋白酶的活性開始受到抑制，且隨著蛋白濃度的升高，酶活性抑制率也逐漸升高，在2.5 μg/μL時，酶活性抑制率約為15.5%，當增加到5.0 μg/μL時，酶活性抑制率提高到27.9%。同時，在試驗中本研究用純化的GST蛋白作為對照，結果發(fā)現(xiàn)添加的GST蛋白對木瓜蛋白酶的活性沒有抑制作用。

圖8 融合蛋白酶活性分析Fig.8 Enzyme activity analysis of fusion protein

3 結論與討論

半胱氨酸蛋白酶抑制劑普遍存在于動植物和微生物體內(nèi)，它在蛋白質(zhì)水解、蛋白酶活性調(diào)節(jié)等許多生理過程中起著重要的作用[21-22]，隨著研究的進一步深入，人們發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑在抗逆性[15-17]、植物程序性細胞死亡[23-24]和細胞增殖[25]等生命過程中也發(fā)揮著積極的作用。本研究從擬南芥中克隆了一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因AtCYS6，序列比對結果表明它與十字花科的薺菜、薺藍的同源性較高，同源性分別為81.1%，80.3%，同水稻、玉米和大豆的同源性較低，且同其他半胱氨酸蛋白酶抑制劑一樣，在氨基酸序列中間具有高度保守的Q-V-G序列[3-4]；預測AtCYS6氨基酸序列相對分子質(zhì)量為26.293 95 ku，電泳結果表明，預測值較為準確；預測AtCYS6的等電點為5.85，具有一個跨膜結構域，含有信號肽的親水性蛋白；蛋白質(zhì)三維結構顯示它包含2個部分，第一部分是由3個反向平行的β片層包裹著一個α-螺旋中心組成，第二部分是由5個反向平行的β片層包裹著一個α-螺旋中心組成；進化樹分析表明，AtCYS6與同屬于十字花科的薺菜、薺藍的親緣性較近，同水稻、玉米、高粱，谷子等禾本科植物的親緣性較遠；亞細胞定位結果表明其定位于細胞質(zhì)，與預測結果相符合；蛋白誘導、純化及Western Blot分析表明融合蛋白正確翻譯表達，且沒有出現(xiàn)結構上的斷裂或者降解的情況；酶活性分析表明AtCYS6同一些報道一樣，對木瓜蛋白酶具有抑制作用[26]。綜上，AtCYS6在植物中具有重要的功能和調(diào)控作用，本研究結果為下一步在植物體內(nèi)研究該基因的相關機理作用提供了基礎。