邢 蔓，洪 波，張澤榮，張曦予，陳 拓，吳寧柔，官 梅，鄔賢夢(mèng)，官春云，熊興華

(1.國(guó)家油料改良中心 湖南分中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

甘藍(lán)型油菜作為重要的油料作物在世界各地廣泛種植，菜籽油不僅是食用油的主要來(lái)源，在化工、飼料及生物能源等領(lǐng)域也具有重要作用。我國(guó)油菜種植面積和產(chǎn)量居世界前列，有研究顯示，菜籽中含油量每增加1%相當(dāng)于油菜種子增產(chǎn)2.5%左右[1]。由此可見(jiàn)，提高油菜種子含油量是增加油菜單位面積產(chǎn)量的一條重要途徑。油菜種子含油量指菜籽油脂含量多少，而油脂作為重要的能量物質(zhì)以三酰甘油(TAG)形式貯藏，其合成主要分3個(gè)步驟，一是合成脂肪酸，主要在質(zhì)體中進(jìn)行；二是在細(xì)胞質(zhì)中生成甘油三磷酸，作為形成三酰甘油的基本骨架；三是形成三酰甘油，發(fā)生場(chǎng)所為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，先后經(jīng)過(guò)甘油三磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)、磷脂酸磷酸水解酶(PAPase)、二酰甘油轉(zhuǎn)酰酶(DGAT)催化而成[2-6]。在催化三酰甘油形成中甘油三磷酸?；D(zhuǎn)移酶起著起始功能[7-8]，由此可見(jiàn)，在植物油脂形成中具有十分重要的作用。

目前，擬南芥中已經(jīng)證實(shí)有10個(gè)GPAT家族基因，分別為ATS1與AtGPAT1～AtGPAT9。大量的研究結(jié)果更指向AtGPAT9在油脂生物合成中扮演重要角色[7，9]，具有GPAT活性， 而AtGPAT1～AtGPAT8與植物角質(zhì)和木栓質(zhì)的形成相關(guān)[10-12]。Shockey等[8]在擬南芥中敲除GPAT9基因，建立種子特異性GPAT9基因敲除系，來(lái)研究GPAT9在種子TAG生物合成中的作用，共鑒定出8個(gè)低含油量的GPAT9amiRNA系，含油量降低了26%～44%；通過(guò)qPCR定量分析GPAT9基因在種子中的表達(dá)，結(jié)果顯示，有2個(gè)擬南芥GPAT9amiRNA系GPAT9轉(zhuǎn)錄物減少了88%以上，表明GPAT9基因表達(dá)的降低會(huì)影響種子中TAG含量和組成。Singer等[13]研究結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)擬南芥中GPAT9是功能性GPAT酶，對(duì)底物?；鵆oA更具偏好性，對(duì)GPAT9的區(qū)域特異性分析表明，這種酶催化的大多數(shù)?；磻?yīng)主要發(fā)生在sn-1位置，證實(shí)其在甘油三酯生物合成的肯尼迪途徑中發(fā)揮重要作用。油菜BnGPAT9基因已從甘藍(lán)型油菜克隆并進(jìn)行初步研究[14-15]，從生物信息學(xué)角度分析顯示，油菜BnGPAT9基因具有GPAT9特有的活性位點(diǎn)，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守；基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)該基因具有組織表達(dá)特異性，在種子中高表達(dá)。

油菜Napin啟動(dòng)子基因表達(dá)具有種子特異性，只集中在種子部位表達(dá)。利用油菜Napin啟動(dòng)子組織特異性可讓目的基因只在種子中特異表達(dá)，從而調(diào)控種子各項(xiàng)生理代謝活動(dòng)，實(shí)現(xiàn)目的基因功能只在轉(zhuǎn)基因植株種子中表達(dá)調(diào)控。鄒敏等[16]克隆得到油菜Napin啟動(dòng)子，選用EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)基因作為報(bào)告基因，在芥菜中深入研究油菜Napin啟動(dòng)子功能，結(jié)果顯示油菜Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)具有嚴(yán)格的種子表達(dá)特異性。近年來(lái)，利用Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因，轉(zhuǎn)化受體植物，進(jìn)而調(diào)控植物種子中油脂含量和脂肪酸組成成分的研究被大量報(bào)道。Clauss等[17]獲得了Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)BnSCE3的轉(zhuǎn)基因油菜系，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜種子中芥酸含量較野生型低了5%，半纖維素和纖維素含量比野生型種子高約30%，油菜籽重量、大小和含水量明顯高于野生型種子。Liu等[18]以油菜Napin啟動(dòng)子為驅(qū)動(dòng)，分別構(gòu)建BnGPDH、BnGPAT、BnDGAT、ScGPDH和ScLPAAT基因的種子特異性表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)化煙草并實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)，結(jié)果顯示，能有效提高轉(zhuǎn)基因煙草種子的含油量3.61%～8.55%。GPAT9基因是GPAT基因家族真正參與TAG合成起始步驟的重要功能基因，為了進(jìn)一步分析油菜中GPAT9基因?qū)ΨN子油脂含量的作用，本研究利用Napin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BnGPAT9在擬南芥種子中特異性表達(dá)，以期為油菜高含油量分子育種提供理論與實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

油菜品種：甘藍(lán)型油菜(AACC)湘油15號(hào)；試驗(yàn)用野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞型 (Columbia)，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)用農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)為土壤農(nóng)桿菌GV3101菌株，植物表達(dá)載體為pBI121載體。油菜品種來(lái)源于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，試驗(yàn)用菌株來(lái)源于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院熊興華老師實(shí)驗(yàn)室，其余試劑從公司購(gòu)買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油菜基因組DNA、總RNA的提取及cDNA合成 根據(jù)植物基因組 DNA 快速抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)方法，從湘油15葉片中提取油菜基因組DNA，置于-20 ℃保存。根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TransZol Up試劑盒和TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒方法提取油菜總RNA及合成cDNA，置于-80 ℃保存。

1.2.2 基因克隆 根據(jù)熊興華等[19]和邢蔓等[14]對(duì)甘藍(lán)型油菜湘油15中Napin啟動(dòng)子和BnGPAT9基因研究結(jié)果，分別克隆油菜Napin啟動(dòng)子核心功能區(qū)域和BnGPAT9基因。采用Primer 5.0分別設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的Napin啟動(dòng)子和BnGPAT9引物。Napin-Fw：5′-CCCAAGCTTGTTCAAGCGAATGGCATACCG-3′(下劃線為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))和Napin-Rv：5′-CGCGGATCCTGTTTGTATTGATGAGTTTTGG-3′(下劃線為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：dNTP(2.5 mmol/L)2 μL， 10×Reaction Buffer 2 μL，引物(Napin-Fw/Rv)1 μL， HiFi高保真DNA聚合酶1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12 μL。PCR程序： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 45 s， 51 ℃ 45 s， 72 ℃ 90 s，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min。BnGPAT9-Fw：5′-CGCGGATCCGGCGATCGGAAGCGAG-3′(下劃線為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))和BnGPAT9-Rv：5′-CGAGCTCGAAACACCACAAGGAACAAG-3′(下劃線為SacⅠ酶切位點(diǎn))。 PCR反應(yīng)體系(20 μL)：dNTP(2.5 mmol/L)2 μL， 10×Reaction Buffer 2 μL，引物(BnGPAT9-Fw/Rv)1 μL ，HiFi高保真DNA聚合酶1 μL，cDNA模板1 μL， ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)程序： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min。配制1.5%瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后回收單一目的條帶，將目的基因與pUCm-T載體相連，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，所得陽(yáng)性單克隆菌送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒方法分別提取pUCm-T-BnGPAT9和pBI121載體質(zhì)粒，用SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切pUCm-T-BnGPAT9和pBI121載體質(zhì)粒，電泳檢測(cè)后回收目的片段。T4DNA連接酶連接pBI121載體片段和BnGPAT9基因片段，25 ℃反應(yīng)2 h，構(gòu)建pBI121-BnGPAT9載體替換原載體上GUS基因。采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，均勻涂布LB培養(yǎng)皿，含卡拉霉素(50 mg/L)，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑選單菌落PCR檢測(cè)，提取陽(yáng)性菌落pBI121-BnGPAT9載體質(zhì)粒和pUCm-T-Napin載體質(zhì)粒，Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切pUCm-T-Napin和pBI121-BnGPAT9載體質(zhì)粒，電泳檢測(cè)后回收目的片段。T4DNA連接酶連接Napin基因片段和pBI121-BnGPAT9載體片段，構(gòu)建pBI121-Napin-BnGPAT9表達(dá)載體替換原載體上CaMV35S啟動(dòng)子基因。采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α保存?zhèn)溆?，方法與構(gòu)建pBI121-BnGPAT9載體時(shí)相同。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥 配制YEB固體培養(yǎng)基，卡拉霉素和利福平濃度為50 mg/L，采用CaCl2凍融法將表達(dá)載體pBI121-Napin-BnGPAT9導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在培養(yǎng)基上，恒溫28 ℃暗培養(yǎng)2～3 d，對(duì)陽(yáng)性單克隆菌落用引物進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)鑒定陽(yáng)性菌株置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎棉r(nóng)桿菌花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，將轉(zhuǎn)化后收獲的種子平鋪于含有卡拉霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選T0，將T0植株種植于植物培養(yǎng)箱(溫度24 ℃，光周期16 h/8 h)，收獲T0種子后再次篩選，直到篩選到純合株系。從轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用BnGPAT9和Napin引物對(duì)轉(zhuǎn)基因植物PCR檢測(cè)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中脂肪酸及含油量測(cè)定 收集野生型和T2轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，置于烘箱105 ℃干燥2 h。稱量0.2 g干燥擬南芥種子，用電鉆徹底粉碎，根據(jù)Beermann等[20]對(duì)植物種子中脂肪酸處理分析方法，略有改動(dòng)，然后進(jìn)行氣相色譜分析。采用索氏抽提法測(cè)定擬南芥種子中含油量，每個(gè)樣3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007和GraphPad Prism 5處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Napin、BnGPAT9基因克隆

采用植物基因組 DNA 快速抽提試劑盒提取湘油15幼苗葉片基因組DNA，以基因組DNA為模板，通過(guò)Napin-Fw、Napin-Rv引物PCR擴(kuò)增出目的條帶(圖1-A)。采用TransZol Up試劑盒從油菜苗葉片中提取油菜總RNA，采用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將油菜總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用引物BnGPAT9-Fw/Rv從油菜cDNA中擴(kuò)增出目的條帶(圖1-B)。經(jīng)測(cè)序顯示，克隆到BnGPAT9基因全長(zhǎng)1 131 bp，Napin基因全長(zhǎng)682 bp。

M.DNA 分子量(Trans2K)；1.Napin基因； 2.BnGPAT9基因。M.DNA Marker(Trans2K)；1.Napin gene；2.BnGPAT9 gene.

2.2 Napin啟動(dòng)子序列分析

對(duì)克隆到的Napin啟動(dòng)子進(jìn)行PlantCARE在線分析，結(jié)果(表1、圖2)顯示克隆的Napin啟動(dòng)子核心區(qū)域具有大量TATA-box和CAAT-box等特征元件，以及參與胚乳表達(dá)、分生組織表達(dá)、黃酮類生物合成、MYB結(jié)合位點(diǎn)、光應(yīng)答、脫落酸誘導(dǎo)等多個(gè)元件。其中脫落酸誘導(dǎo)元件(ABRE)是Napin啟動(dòng)子種子特異性表達(dá)必不可少的元件，在種子成熟階段起調(diào)控作用[21]。GCN4基序比較保守，是調(diào)控胚乳儲(chǔ)存蛋白基因啟動(dòng)子的重要元件[22]。分析結(jié)果表明，克隆的Napin啟動(dòng)子包含多種調(diào)控元件，具備種子特異性表達(dá)功能。

表1 啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)元件分析Tab.1 Cis-acting regulatory element analysis of promoter sequence

圖2 Napin啟動(dòng)子序列和順式作用元件Fig. 2 Sequence of Napin and the cis-acting regulatory elements

2.3 pBI121-Napin-BnGPAT9表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)1.2.3試驗(yàn)方法構(gòu)建pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達(dá)載體(圖3)。首先，SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切pUCm-T-BnGPAT9和pBI121載體質(zhì)粒，用BnGPAT9基因替換GUS基因，構(gòu)建pBI121-BnGPAT9重組質(zhì)粒(圖3-A)。隨后，改用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ快速內(nèi)切酶，采用同樣的方法酶切pUCm-T-Napin和pBI121-BnGPAT9載體質(zhì)粒，用Napin基因替換CaMV35S啟動(dòng)子基因，構(gòu)建pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達(dá)載體(圖3-B)。采用熱激法將pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR檢測(cè)后保存陽(yáng)性菌落，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程Fig.3 Flow chart for construction of the pBI121-Napin-BnGPAT9 plant expression vector

M.DNA 分子量(Trans2K)；1，2.Napin基因；3，4.BnGPAT9基因。M.DNA Marker(Trans2K)；1，2.Napin gene；3，4.BnGPAT9 gene.

2.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)

經(jīng)農(nóng)桿菌花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選得到2株T0轉(zhuǎn)基因苗，所得轉(zhuǎn)基因苗分別用引物BnGPAT9-Fw/Rv和Napin-Fw/Rv進(jìn)行PCR鑒定，cDNA擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)基因植株中均能同時(shí)檢測(cè)到Napin、BnGPAT9目的條帶，表明已經(jīng)得到轉(zhuǎn)pBI121-Napin-BnGPAT9擬南芥植株。繼續(xù)篩選純合體株系，直到T2全為抗性苗，表明已經(jīng)篩選出轉(zhuǎn)基因純合株系。

2.5 種子中脂肪酸組分分析

由表2可知，在擬南芥種子中特異性表達(dá)BnGPAT9基因能改變種子中脂肪酸組成成分，提高油酸(C18∶1)含量，降低亞油酸(C18∶2)和芥酸(C22∶1)含量。與野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系1的C18∶1含量提高1.01百分點(diǎn)，株系2的C18∶1含量提高了0.70百分點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)分析顯示株系1與對(duì)照差異顯著，株系2差異不顯著；轉(zhuǎn)基因株系1和2的C18∶2含量分別低于對(duì)照0.70，0.93百分點(diǎn)，差異顯著；C22∶1含量與對(duì)照相比也有所下降，株系2顯著低于對(duì)照；C16∶0、C18∶0、C18∶3、C20∶0、C20∶1和C20∶2含量與野生型相比無(wú)顯著差異。由此看來(lái)，BnGPAT9基因?qū)ΨN子中脂肪酸合成具有明顯調(diào)控作用，通過(guò)種子中集中表達(dá)可改變種子中脂肪酸組成成分。

M.DNA 分子量(Trans2K)；1，2.野生型植株Napin、BnGPAT9基因；3，4.株系1 Napin、BnGPAT9基因；5，6.株系2 Napin、BnGPAT9基因。

表2 擬南芥種子中脂肪酸組成Tab.2 Arabidopsis thaliana seeds fatty acid composition %

2.6 擬南芥種子含油量分析

擬南芥種子含油量測(cè)定結(jié)果顯示(圖6)，野生型擬南芥種子中含油量為25.05%，株系1含油量為27.61%，株系2含油量為26.96%，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系種子含油量均顯著高于野生型，其中株系1含油量提高了2.56百分點(diǎn)，株系2提高了1.91百分點(diǎn)。種子中特異性表達(dá)BnGPAT9基因?qū)υ黾臃N子含油量效果顯著，表明在Napin啟動(dòng)子調(diào)控下BnGPAT9基因在種子油脂合成中發(fā)揮重要作用。

不同小寫字母表示種子含油量間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。Different lowercase letters represent significant difference between the oil content in Arabidopsis seeds(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

油菜Napin啟動(dòng)子具有種子表達(dá)特異性，已在煙草、擬南芥、芥菜、油菜等作物中深入研究，Napin啟動(dòng)子在種子中調(diào)控外源基因表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪酸合成，提高種子含油量等方面發(fā)揮著重要作用[16-18，23-24]。GPAT9基因在擬南芥中研究最為透徹，證實(shí)該基因?yàn)镚PAT基因家族參與TAG合成的功能基因，能調(diào)控植物TAG生物合成進(jìn)而影響含油量[8，13]。甘藍(lán)型油菜BnGPAT9基因已被克隆研究，參與植物油脂合成過(guò)程[14-15]，然而該基因在種子含油量方面的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)油菜Napin啟動(dòng)子和BnGPAT9基因進(jìn)行克隆，在線分析顯示，該Napin啟動(dòng)子具備種子特異性功能，并成功構(gòu)建pBI121-Napin-BnGPAT9植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥。

擬南芥種子中脂肪酸組分分析顯示，Napin啟動(dòng)子調(diào)控BnGPAT9基因表達(dá)能改變種子中脂肪酸組成成分，使得轉(zhuǎn)基因株系C18∶1含量提高，C18∶2和C22∶1含量降低。推測(cè)BnGPAT9在作用合成底物時(shí)更趨向C18∶1-CoA， Singer等[13]研究結(jié)果也顯示GPAT9對(duì)C18∶1-CoA顯示出較高的酶活性，可能這種對(duì)底物的選擇性導(dǎo)致對(duì)C18∶2和C22∶1的偏好性較弱，因此含量有所降低。株系1和株系2種子含油量分別顯著提高2.56，1.91百分點(diǎn)，表明在種子中集中表達(dá)BnGPAT9基因有助于提高種子含油量，進(jìn)一步證實(shí)BnGPAT9是油脂合成的重要基因。

油菜Napin啟動(dòng)子廣泛應(yīng)用于油料作物種子中油脂成分的改良，利用Napin啟動(dòng)子種子表達(dá)特異性，成功實(shí)現(xiàn)在種子中調(diào)控目的基因表達(dá)，在改善脂肪酸組分和提高種子含油量方面具有重要作用[17-19，25]。本研究在擬南芥種子中特異性表達(dá)BnGPAT9基因提高了種子含油量，推測(cè)Napin啟動(dòng)子在種子部位定時(shí)、定點(diǎn)、高效調(diào)控BnGPAT9基因表達(dá)，降低BnGPAT9在根莖葉等組織中的表達(dá)程度，減少不必要的能量損失，可實(shí)現(xiàn)在種子中集中表達(dá)。甘藍(lán)型油菜與擬南芥同為十字花科植物，且BnGPAT9基因與擬南芥GPAT9同源性很高，進(jìn)化過(guò)程中也高度保守[14-15]，因此，本研究可為BnGPAT9基因在改良和提高油菜籽油脂含量方面提供參考。