蔣欣 曲青山 房軍 梁韶峰 孫東

腎臟移植是腎病終末期最有效的治療手段。 隨著新型免疫抑制劑的不斷出現(xiàn)及組織配型、器官保存技術(shù)的不斷提高，移植腎1 年存活率已提高至90%以上，而遠期存活率并無明顯變化，10 年存活率不到50%[1-2]。移植腎慢性排斥反應(yīng)是導致其遠期功能喪失的主要原因，但目前臨床上缺乏明確有效的防治方法[3]。 間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮和累積內(nèi)膜的血管壁增厚等損傷主要是由移植腎的慢性排斥反應(yīng)所致。 炎癥是移植腎排斥反應(yīng)至慢性移植物功能喪失的重要病理生理因素[4]。 蛋白酪氨酸激酶(JAK)是一類非跨膜型的酪氨酸激酶。 信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)在信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活上有重要作用[5]。 有研究顯示JAK 和STAT 在正常腎小管上皮細胞中表達水平較低，而在腎臟移植患者腎小管上皮細胞中表達水平相對較高[6]。JAK/STAT 通路對腎間質(zhì)纖維化和腎小管上皮細胞的損傷具有一定調(diào)控作用，并對病理性活化有一定促進作用[7]。 本研究在JAK/STAT 通路調(diào)控腎小管上皮細胞損傷作用的基礎(chǔ)上探討JAK2/STAT3 通路在大鼠腎臟移植慢性排斥反應(yīng)中的作用機制。

材料與方法

1.材料：8 ～12 周齡無特定病原體雄性近交系大鼠60 只購自鄭州大學藥物研究所[許可證號SCXK(豫)2018-0004]，體質(zhì)量 200 ～ 250 g。 AMD3100 拮抗劑購自Sigma-Aldrich 公司；α 平滑肌肌動蛋白(a-SMA)抗體、JAK2 抗體、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1抗體、果蠅母性DPP 同1 原蛋白3(Smad3)蛋白抗體均購自英國Cambridge 公司；BH2 顯微鏡購自日本OLYMPUS 公司。

2.方法

(1)實驗分組方法：將60 只大鼠分為3 組，空白對照組[供鼠(10 只)、受鼠(10 只)均為 Lewis 大鼠]、陽性對照組[供鼠(10 只)為F344 大鼠，受鼠(10 只)為Lewis 大鼠 ]和STAT3 拮抗組[供鼠(10 只)為F344大鼠，受鼠(10 只)為 Lewis 大鼠]。 3 組大鼠均在手術(shù)當天至術(shù)后10 d 皮下注射低劑量環(huán)孢素A，劑量為1.5 mg·kg-1·d-1；STAT3 拮抗組大鼠注射環(huán)孢素A后給予AMD 3 100 mg·kg-1·d-1尾靜脈注射。

(2)腎臟移植手術(shù)：3 組大鼠均在手術(shù)后12 周麻醉處死并取材。 參考文獻[8]將所有大鼠麻醉后，供體大鼠固定剖開腹腔，分離其動、靜脈，采用10/0 尼龍線將供體左腎動、靜脈帶瓣分別與受體腹主動脈和下腔靜脈行端-側(cè)吻合，采用7/0 尼龍線將供體輸尿管末端的膀胱肌瓣與受體膀胱肌頂部吻合，取出供體左腎。受體大鼠的手術(shù)方法和供體大鼠一致，供體和受體大鼠腎臟移植手術(shù)同時進行，手術(shù)完畢后給予所有大鼠慶大霉素150 mg/kg 肌肉注射，預防感染。

(3)腎功能測定：分別抽取所有大鼠術(shù)前和術(shù)后12 周的尾靜脈血2 ml，凍存于-80 ℃冰箱中，用于檢測血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)水平。

(4)腎臟組織病理學檢測：于術(shù)后第12 周處死大鼠，迅速將腎臟組織固定、脫水、石蠟包埋后切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。 每個樣本在400 倍鏡下隨機觀測5 個視野進行評價。 采用慢性移植物損傷指數(shù)(CADI)評分標準對3 組大鼠腎臟樣本進行慢性排斥反應(yīng)病理評分。 該評分標準包括腎間質(zhì)炎癥、腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、基底膜基質(zhì)增多、腎小球硬化、動脈內(nèi)膜增生6 個部分，每個部分分值為0 ～3 分，CADI評分即為六者總和。

(5)免疫組化檢測 TGF-β1/Smad3 和 α- SMA 纖維化指標：取腎臟組織以3 %過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶后，放置檸檬緩沖液中，以98 ℃加熱15 min，取出冷卻至室溫進行修復抗原。 滴加一抗于4 ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min，共漂洗3 次。每張切片滴加50 μml 辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，37 ℃下孵育 30 min，PBS 沖洗 3 次。 每張切片滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，鏡下觀察控制顯色反應(yīng)，自來水洗終止，復染核后用中性樹膠封片。

(6)蛋白質(zhì)印記法(Western blot)檢測 TGF-β1、α-SMA、JAK2 和 STAT3 蛋白的表達：從 -80 ℃冰箱取出3 組大鼠的腎臟組織加入裂解液和蛋白酶抑制劑充分勻漿，4 ℃以12 000 r/min 離心15 min 取上清液，每組取30 mg 蛋白電泳并電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫10 %脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4 ℃下孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h。 應(yīng)用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對膜上蛋白質(zhì)進行檢測并行定量分析。

3.統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料比例和百分比表示組間比較采用χ2檢驗，不同時間點比較采用重復測量方法分析。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.3 組大鼠存活率及腎臟移植前后腎功能比較：術(shù)后12 周內(nèi)空白對照組(12/16，75%)、陽性對照組(6/13，46%)及 STAT3 拮抗組(10/15，67%)大鼠存活率比較差異無統(tǒng)計學意義，術(shù)前3 組大鼠血清SCr 及BUN 水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 術(shù)后12 周空白對照組和 STAT3 拮抗組大鼠血清 SCr 及BUN 水平均低于陽性對照組(P＜0.05)。 見表1。

表1 3 組大鼠腎臟移植前后血清SCr 及BUN 水平比較()

表1 3 組大鼠腎臟移植前后血清SCr 及BUN 水平比較()

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與陽性對照組比較，bP ＜0.05

組別 例數(shù) SCr(μmol/L)手術(shù)前 術(shù)后12 周BUN(mmol/L)手術(shù)前 術(shù)后12 周空白對照組 16 127.28±15.62 153.87±17.04 6.19±0.11 7.95±0.26陽性對照組 13 133.25±15.83 186.25±18.31a 7.23±0.18 10.42±0.51a STAT3 拮抗組 15 129.45±15.76 159.42±17.28b 6.68±0.17 8.57±0.29b

2.3 組大鼠腎臟移植后的腎臟組織病理學變化和CADI 評分結(jié)果比較：腎臟移植12 周后，HE 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組和STAT3 拮抗組大鼠腎臟組織腎小球硬化、腎小管萎縮擴張變形、炎癥細胞浸潤及間質(zhì)纖維化等慢性排斥反應(yīng)的病理表現(xiàn)較輕，陽性對照組大鼠腎臟組織彌漫性炎癥細胞浸潤的病理表現(xiàn)較為明顯，見圖1。 陽性對照組大鼠CADI 評分[(7.92±0.86)分]明顯高于STAT3 拮抗組[(3.82 ±0.41)分]和空白對照組[(3.24±0.33)分]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？瞻讓φ战M和STAT3 拮抗組大鼠CADI 評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3.3 組大鼠免疫組化檢測結(jié)果比較：陽性對照組大鼠腎小管中可見大量TGF-β1及Smad3 陽性細胞，腎間質(zhì)和腎小管中可見大量α-SMA 陽性細胞；而在空白對照組和 STAT3 拮抗組中 TGF-β1、Smad3 和 α-SMA陽性細胞明顯減少。 見圖2。

4.3 組大鼠腎臟組織中JAK2/STAT3 及纖維化指標表達水平比較：空白對照組和STAT3 拮抗組大鼠腎臟組織中 JAK2、STAT3、TGF-β1及 α-SMA 蛋白表達水平明顯低于陽性對照組(P＜0.05)，上述蛋白水平表達在空白對照組和STAT3 拮抗組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 見圖3。

圖1 3 組大鼠移植后的腎臟組織病理學變化[A：空白對照組；B：陽性對照組；C：STAT3 拮抗組；HE 染色，×400]

圖2 3 組大鼠免疫組化檢測結(jié)果比較[鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)染色，×400]

圖3 3 組大鼠腎臟組織中JAK2/STAT3 及纖維化指標表達水平比較

討 論

慢性排斥反應(yīng)進程由多種因子共同作用導致，臨床上大多表現(xiàn)為腎小球濾過率下降、出現(xiàn)蛋白尿和高血壓等。 在慢性排斥反應(yīng)引起的移植腎損傷發(fā)生發(fā)展過程中，非免疫因素也起著至關(guān)重要的作用，其中包括缺血再灌注損傷、急性腎小管壞死、高血壓等。 本研究結(jié)果顯示，術(shù)后12 周空白對照組和STAT3 拮抗組大鼠血清SCr 及BUN 水平均低于陽性對照組，證明了使用ADM3100 拮抗劑能延緩腎臟移植慢性排斥導致的腎損傷。 既往研究結(jié)果也顯示AMD3100 對移植腎損傷的保護主要是通過其免疫調(diào)節(jié)作用，可在炎癥早期降低炎癥趨化因子水平，減輕炎癥損害[9]。

在慢性排斥反應(yīng)導致的移植腎損傷發(fā)展過程中，炎癥細胞浸潤產(chǎn)生了大量包括表皮生長因子、胰島素樣生長因子、血小板源生長因子(PDGF)和TGF-β1等細胞因子，目前認為 TGF-β1與腎纖維化最為密切。TGF-β1可通過Smad3 依賴的信號通路直接激活或誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞(MF)的轉(zhuǎn)化[10]。 本研究中免疫組化檢測結(jié)果顯示，陽性對照組大鼠腎臟組織腎小管中可見大量TGF-β1及Smad3 陽性細胞，在腎間質(zhì)和腎小管中可見大量的α-SMA 陽性細胞；而在空白對照組和 STAT3 拮抗組中 TGF-β1、Smad3 和α-SMA陽性細胞明顯減少。 由此可見，STAT3 拮抗對腎纖維化有一定的抑制作用。 α-SMA 是腎固有細胞轉(zhuǎn)分化和腎臟纖維化的重要環(huán)節(jié)和標志[11]。 在正常的腎臟組織中，α-SMA 只在血管中層平滑肌細胞表達，在TGF-β1等促纖維因子的刺激下，可以激活腎臟固有細胞的α-SMA 基因，使細胞表達α-SMA 并分化為MF 或類MF 細胞[12]。 MF 細胞和類MF 細胞是腎臟細胞外基質(zhì)的主要來源，是腎臟纖維化的主要原因。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) TGF-β1、α-SMA、JAK2 和 STAT3 蛋白表達水平在空白對照組和STAT3 拮抗組均低于陽性對照組，由此可見，STAT3 拮抗可明顯降低JAK2 和 STAT3 的表達水平，且JAK2/STAT3 在大鼠移植腎慢性排斥反應(yīng)模型的腎臟中高表達，STAT3 拮抗可有效保護腎功能，延緩慢性排斥反應(yīng)的進程，減輕腎臟組織中炎癥細胞浸的潤，從而減少TGF-β1/Smad3 通路的激活，抑制α-SMA 的表達，最終減輕腎臟纖維化[13]。

綜上所述，STAT3 的特異性抑制劑可在腎臟移植慢性排斥反應(yīng)中抑制JAK2/Smad3 信號通路所引起的炎性反應(yīng)，對腎臟移植起到一定的保護作用。 由于時間、人力等問題，本實驗存在一定的不足，未對各組大鼠術(shù)后不同時間點的SCr、BUN、血壓及磷酸化JAK2、STAT3 等進行檢測，在以后的研究中應(yīng)進一步充實實驗內(nèi)容，為以后腎臟移植慢性排斥的研究提供依據(jù)。