王 昊， 陳 好， 歐陽中敏， 劉志強

廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 a.消化內(nèi)科； b. 影像科， 廣州 510700

急性肝衰竭(ALF) 是由多種因素所致肝臟的合成、解毒、排泄以及生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生失代償或引發(fā)嚴重的器官功能衰竭的臨床癥候群，病死率高達70%～80%[1]。新型造影劑釓塞酸二鈉(Gd-EOB-DTPA)行MRI增強掃描作為節(jié)段性評估肝功能的方法是近年來的研究熱點[2-3]。筆者前期通過對CCl4誘導建立的犬類ALF模型行Gd-EOB-DTPA增強MRI掃描，探索不同時期感興趣區(qū)域的信號強度與肝細胞病理及細胞結(jié)構變化的關系，發(fā)現(xiàn)20 min為肝細胞最佳成像時間，且增強掃描后信號強度越低，肝細胞結(jié)構破壞越嚴重[4]。由此推測Gd-EOB-DTPA行MRI增強掃描也可以節(jié)段性評估ALF患者的肝功能。已知有機陰離子轉(zhuǎn)運肽1(organic anion transporting polypep tide 1，OATP1)能夠介導肝細胞對Gd-EOB-DTPA的攝取，而多藥耐藥相關蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)則介導Gd-EOB-DTPA經(jīng)膽汁排泄[5]。因此，本研究進一步探討ALF Beagle犬在Gd-EOB-DTPA增強MRI注射造影劑20 min時不同信號區(qū)的肝臟信號強度與跨膜蛋白OATP1及MRP2表達變化的相關性，以期得出一個能從節(jié)段性水平快速評估ALF時肝功能的方法，目的是建立一個具有分子生物學層面評估肝細胞功能的ALF犬模型，為優(yōu)化治療方案提出依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物誘導ALF犬模型建立 選取10～12月齡健康成年雄性Beagle犬16只[購自福州振和實驗動物技術開發(fā)有限公司，合格證號：SCXK(閩2012-0002)，生產(chǎn)許可證編號：SCXK(閩2018-0001)，實驗動物使用許可證編號：SYXK(粵2012-0117)]。體質(zhì)量約(13.0±3.0)kg，隨機分為空白對照組(A組，n=8)和ALF組(B組，n=8)。采用乙酰氨基酚聯(lián)合CCl4誘導ALF的方法進行造模，具體方法參照前期研究方案[6]。

1.2 Beagle犬采用Gd-EOB-DTPA進行MRI增強平掃 造模24 h，采用犬眠寶0.06 ml/kg肌肉注射對Beagle犬進行全身麻醉，麻醉前15 min皮下注射硫酸阿托品(浙江浙北藥業(yè)有限公司)1 ml預防誤吸。將麻醉后的Beagle犬固定在磁共振檢查床上，每條Beagle犬采用1.5T核磁共振成像儀進行MRI平掃，掃描前禁食禁水6～8 h;掃描序列包括T1WI同反相位(矩陣208×256，重復時間110.0 ms，回波時間2.38 ms、4.76ms)、T1WI(矩陣188×256，重復時間169.0 ms，回波時間4.76 ms)、T2WI(矩陣320×320，重復時間2200.0 ms，回波時間90.0 ms)。掃描范圍為橫隔頂至肝臟下緣;掃描體位為俯臥位。采用8通道相控陣體部線圈。掃描視野為130×320 mm，反轉(zhuǎn)角度10°，獲得時間16 s。

平掃結(jié)束后注射對比劑Gd-EOB-DTPA(商品名“普美顯”Primovist，拜耳先靈醫(yī)藥，德國)，注射劑量為0.1 ml/kg，人工靜脈推注，流率為2 ml/s。注射對比劑后用10 ml生理鹽水進行沖洗，沖洗流率為2 ml/s。

Gd-EOB-DTPA增強MRI掃描：動態(tài)增強掃描序列使用3D擾相容積序列的脂肪抑制T1加權梯度回波影像，延遲20 min掃描為肝細胞期，掃描序列為FS 3D(矩陣130×320，重復時4.08 ms，回波時間1.65 ms，層厚3 mm，層間距0)。肝臟MRI檢查結(jié)束后，將數(shù)據(jù)傳輸?shù)焦ぷ髡尽?/p>

1.3 MRI增強掃描前后數(shù)據(jù)測定 選擇1名具有10年工作經(jīng)驗且經(jīng)倫理委員會認證的腹部放射科醫(yī)師，根據(jù)B組在注射Gd-EOB-DTPA 20 min后所獲得的圖像判斷是否存在不同增強程度的區(qū)域，以正常A組肝臟T1W1信號強度作為參照，B組分別于MRI增強掃描前及20 min后于肝臟同一軸向?qū)用娉尸F(xiàn)高、中、低不同信號區(qū)域。避開肉眼可見的膽管及血管，分別選擇兩組在MRI增強掃描前、增強掃描20 min時肉眼所見的不同增強程度區(qū)域作為感興趣區(qū)域(直徑約3～6 mm)，測量該區(qū)域?qū)男盘枏姸?signal intensity，SI)，每個感興趣區(qū)測量3次。首過快速上升期中的增強斜率百分比計算公式：(SImax-SIbase/ SIbase×△t)×100%。

SImax指時間-信號曲線首過灌注肝臟所達到的最大值，SIbase指造影劑增強掃描后進入動脈期前最先獲得的兩幅圖像中所得的平均信號值?！鱰指從SIbase至SI1st的時間間隔[7]。該數(shù)據(jù)由后處理工作站上的特定軟件(Mean Curve，Syngo MR D13，SiemensHealthcare)進行分析。通過軟件計算得出兩組不同信號值的時間-信號曲線。

1.4 MRI定位下穿刺 B組根據(jù)注射造影劑Gd-EOB-DTPA后20 min(肝細胞期)的MRI圖像選擇同一軸向?qū)用娴母?、中、低不同信號區(qū)作為感興趣區(qū)域進行肝穿刺。A組選擇Gd-EOB-DTPA行MRI增強掃描后在相應區(qū)域進行肝穿刺。使用一次性活檢針(巴德醫(yī)療科技上海有限公司代理)進行肝穿刺活檢，穿刺時注意避開肉眼所見血管、膽管、病灶。每個感興趣區(qū)均取1份約0.1 g的肝組織，用于Western Blot法檢測跨膜蛋白OATP1及MPR2的表達情況。

1.5 Western Blot檢測OATP、MRP2蛋白的表達

1.5.1 蛋白的提取及測定 將肝組織塊研磨搗碎后加入200 μl的RIPA裂解液(Solarbio，中國)，在冰上吹打混勻，4 ℃放置10 min，4 ℃ 12 000×g，離心5 min，收集上清。將提取到的蛋白根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher，美國)的使用說明進行蛋白濃度測定。分別取200 μl蛋白上清加200 μl純水混勻，加入80 μl的5×loading buffer，混勻，沸水煮5 min變性，冷卻至室溫，-20 ℃保存。

1.5.2 Western Blot取30 μl蛋白樣品進行上樣，使用10%分離膠與5%濃縮膠配比的電泳膠于蛋白電泳儀(Bio-Rad，美國)上進行電泳分離。然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國)，5%脫脂牛奶中搖床封閉1 h，TBST洗膜2次后加入相應一抗(OATP1、MRP2，Abcam，英國)并于4 ℃條件下孵育過夜。孵育結(jié)束后用TBST洗去一抗，然后加入相應二抗,室溫搖床2 h。最后于凝膠成像系統(tǒng)上成像記錄，然后用Image J圖像分析軟件測定各蛋白的灰度值，并將目的蛋白(OATP1、MRP2)灰度值與內(nèi)參GAPDH(上海碧云天生物技術有限公司)灰度值的比值作為OATP1及MRP2的相對表達量。

1.6 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由暨南大學實驗動物倫理委員會審批(批號：20150310002)，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同信號區(qū)域首過快速上升期中的信號值、增強斜率百分比 B組行Gd-EOB-DTPA增強MRI掃描前后高(H)、中(M)、低(L)信號區(qū)域測得SIbase值之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，進一步兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(tHM=6.88，PHM<0.001；tHL=11.84，PHL<0.001；tML=4.96，PML<0.001)； SIst值比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，進一步兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學意義(tHM=5.46，PHM<0.001；tHL=10.49，PHL<0.001；tML=5.03，PML<0.001)；首過快速上升期中的增強斜率百分比比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；增強斜率百分比之間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學意義(tHM=3.7，PHM<0.001；tHL=6.3，PHL<0.001；tML=2.7，PML<0.001)；A組行Gd-EOB-DTPA增強MRI掃描前后H、M、L信號區(qū)域測得SIbase值、SIst值、△t、強斜率百分比，兩組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(圖1，表1)。

表1 兩組首過快速上升期中的增強斜率百分比

2.2 OATP1和MRP2的表達水平 B組不同MRI信號區(qū)域的肝組織中，造影劑攝取蛋白OATP1及造影劑排泄蛋白MRP2的表達存在差異(P值均<0.05)。A組不同信號區(qū)之間OATP1的表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。B組H、M、L信號區(qū)之間OATP1的表達呈逐漸下降的趨勢，M、L信號區(qū)OATP1的表達與A組相比差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為3.301、3.641，P值均<0.05)。B組L信號區(qū)OATP1的表達與H、M信號區(qū)比較均有顯著下降，且差異具有統(tǒng)計學意義(tHL=3.436，PHL=0.002；tML=2.378,PML=0.024)。A組不同信號區(qū)之間MRP2的表達比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。B組H、M、L信號區(qū)MRP2的表達呈逐漸升高的趨勢，H、M、L不同信號區(qū)MRP2的表達分別與A組相比差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為-7.236、-8.130、-9.614，P值均<0.05)。在B組H信號區(qū)MRP2的表達比M、L信號區(qū)均低，且其差異有統(tǒng)計學意義(tHM=-2.666，PHM=0.013；tHL=-3.897，PHL=0.001)(圖2，表2)。

表2 兩組OATP1、MRP2蛋白相對表達情況

2.3 OATP1、MRP2蛋白表達水平與信號強度的相關性

B組H、M、L信號區(qū)OATP1蛋白表達水平與增強后MRI信號強度呈正相關(r=0.692，P<0.05)，B組H、M、L信號區(qū)MRP2蛋白表達水平與增強后MRI信號強度呈負相關(r=-0.514，P<0.05)(圖3)。

3 討論

ALF是由多種因素綜合導致肝損傷繼而引起肝性腦病、凝血障礙、黃疸、腹水等癥狀，使肝功能發(fā)生失代償或引發(fā)嚴重的器官功能衰竭。目前臨床上評估肝功能的方法如Child-Pugh分級、ICG血漿清除率及MELD評分系統(tǒng)等雖然能為肝病患者治療方案的制訂提供重要的參考價值[8]，但由于其相關評價指標在檢測過程易受干擾，很難從客觀上準確評價ALF時的肝功能及人工肝治療前后的肝功能。ALF發(fā)病后，肝組織損傷存在區(qū)域差異，因此，觀察治療前后不同損害嚴重程度肝細胞功能恢復情況，是臨床判斷治療效果的重要方法，隨著MRI影像學檢查的深入，新型造影劑如Gd-EOB-DTPA在肝臟疾病的應用受到越來越多學者的關注。

Gd-EOB-DTPA作為肝臟特異型造影劑在正常人體內(nèi)靜脈推注后分布在細胞外間隙，大約有50%由正常功能的肝細胞通過細胞膜上表達的跨膜蛋白及OATP1攝取，然后經(jīng)由肝細胞毛細膽管細胞膜上的載體MRP2排泄入膽汁，剩余約50%通過腎臟途徑清除?，F(xiàn)有的研究[9]表明，在Gd-EOB-DTPA注射1.5 min后開始被肝細胞攝取，約20%的給藥劑量在20 min時被轉(zhuǎn)移到肝細胞中。筆者前期研究[4]通過對犬類ALF模型組和空白對照組均采用Gd-EOB-DTPA行MRI增強掃描，并測定平掃期、增強20 min不同時間感興趣區(qū)域信號強度進行對比，發(fā)現(xiàn)ALF組Beagle犬增強20 min時MRI顯示肝臟強化程度不一，呈高、中、低不均勻強化，以MRI增強20 min時信號值差異更明顯。因此，可采用Gd-EOB-DTPA注射后20 min時獲得的MRI圖像作為“標準”來評估大多數(shù)的肝損傷和肝功能[10]。此次研究進一步測定時間-強度曲線的快速上升期，由此認為Gd-EOB-DTPA造影劑從動脈毛細血管進入肝臟細胞間隙過程中以20 min作為最佳上升期，增強斜率反映的是對比劑濃度上升的速率，可隨著微循環(huán)血流量的增多，造影劑濃度上升的速率也會加快[10]。相反，若肝細胞功能受損，引起內(nèi)皮細胞受損及肝臟微循環(huán)障礙，對應對比劑濃度上升速率減慢，因而肝衰竭組低信號區(qū)域首過灌注后信號強度達到一定峰值后未再繼續(xù)升高。

肝細胞質(zhì)膜上不同區(qū)域的膜蛋白可通過各自不同轉(zhuǎn)運的機制到達細胞的特定部位，行使不同功能。OATP1是屬于溶質(zhì)載體超家族的一種跨膜蛋白，它能介導多種有機化合物如Gd-EOB-DTPA通過肝臟基底膜，使其能夠快速被攝入肝細胞內(nèi)。據(jù)報道[11]，OATP1的表達在肝炎、肝硬化中表達下調(diào)。Ding等[12]及Katsube等[13]研究證實，正常肝細胞數(shù)量的減少及OATP1功能的減退會導致肝細胞對Gd-EOB-DTPA攝取量減少，從而解釋肝纖維化時T1弛豫時間減少，信號降低。由此可知，肝臟相關疾病通過MRI增強掃描信號的高低程度與OATP1的表達相關。本研究將MRI定位下穿刺取得的肝組織采用Western Blot法檢測OATP1的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALF組H、M、L不同信號區(qū)OATP1的表達與對照組相比呈逐漸下降的趨勢，并與肝細胞期信號減低的趨勢相一致。結(jié)合既往研究[4]HE染色結(jié)果提示MRI信號強度的高、低與肝組織HE染色下顯示的壞死程度呈負相關，即肝組織壞死越嚴重的區(qū)域MRI信號強度越低。由此可以說明，Beagle發(fā)生ALF時，肝臟信號強度上升不明顯，OATP1的表達越低，對應區(qū)域的MRI信號增強越不明顯，這與Ding等[12]及Katsube等[13]的研究結(jié)果相一致。

MRP2是屬于ABC超家族的一類跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，主要分布于肝細胞毛細膽管膜上，能夠促進兩性陰離子化合物排泄進入膽汁[14]。Saito等[15]研究發(fā)現(xiàn)MRP2蛋白的下降可導致Gd-EOB-DTPA的蓄積，從而引起MRI早期信號強度的增強。由此可以推測，當MRP2表達升高時，肝細胞內(nèi)Gd-EOB-DTPA經(jīng)MRP2蛋白介導排泄入膽汁增加，Gd-EOB-DTPA增強MRI的信號可能減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，ALF組MRP2的表達隨著肝損傷程度的增大而升高，且均比對照組高。曾經(jīng)有研究[16]報道，OATP在肝病中的表達是隨著時間的推移而變化的，急性毒性處理(對乙酰氨基酚和CCl4)可以誘導MRP2的表達，而長期的CCl4誘導會降低MRP2的表達，這與本研究結(jié)果相一致。ALF組肝內(nèi)H、M、L信號區(qū)MRP2的表達是逐漸升高的，而對應區(qū)域的MRI信號強度是逐漸下降，推測是由于MRP2對Gd-EOB-DTPA排泄增多所致。

本研究也存在一些局限性。本研究雖然證實了OATP1及MRP2在ALF Beagle犬肝內(nèi)表達發(fā)生了改變，但并未深入研究引起這兩種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白表達改變的具體機制，這是將來需要深入探討的方向。

本研究結(jié)果表明，肝細胞期ALF Beagle犬增強MRI信號強度越低的區(qū)域，細胞膜表面OATP1的表達下降越明顯，肝細胞受損嚴重區(qū)域細胞內(nèi)無法攝取過多造影劑，信號強度上升的速率減慢。信號強度越低的地方MRP2的表達上升越明顯，對造影劑的排泄越快。這就說明，急性肝細胞損傷時肝細胞期MRI信號的降低與OATP1及MRP2 的表達情況密切相關。筆者前期研究已經(jīng)證明ALF Beagle犬肝內(nèi)MRI信號的區(qū)域性差異與肝損傷程度相關。因此，認為肝細胞膜表面OATP1及MRP2 的表達水平與肝實質(zhì)在Gd-EOB-DTPA增強肝細胞期的強化程度具有一定的關系，從而導致了肝內(nèi)MRI增強信號的差異，這為節(jié)段性評估肝細胞功能提供一定依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：黃建偉負責課題設計及擬定寫作思路；陳好負責論文撰寫及數(shù)據(jù)收集、分析；王昊負責數(shù)據(jù)收集，分析及指導撰寫文章；歐陽中敏、劉志強負責影像學數(shù)據(jù)收集及資料分析。