趙洪 李靜 向旭 高禮安 鄧功成

摘要：采用液體發(fā)酵技術(shù)和正交試驗(yàn)方法，研究碳源、氮源、起始pH值和發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵條件對(duì)紅汁乳菇菌絲體干質(zhì)量的影響，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵條件的較優(yōu)組合為碳源為馬鈴薯粉，濃度為3%;氮源為酵母膏，濃度為0.3%;起始pH值為6.0;發(fā)酵時(shí)間5 d。在27 ℃條件下，該組合菌絲體干質(zhì)量最高，為10.094 g/L。

關(guān)鍵詞：紅汁乳菇;菌絲體;液體發(fā)酵;工藝優(yōu)化;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S646.04? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）14-0167-03

紅汁乳菇（Lactarius hatsutake），別稱紫菌、松毛菌，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 紅菇科（Russulaceae）乳菇屬（Lactartus）大型真菌[1]。紅汁乳菇為菌根食用菌，目前尚不能人工栽培。紅汁乳菇菌絲體可以與馬尾松等植物形成菌根[2]，對(duì)松樹的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，可提高松樹抗環(huán)境脅迫能力已得到普遍認(rèn)同。有研究者對(duì)紅汁乳菇子實(shí)體的生境及發(fā)生規(guī)律開(kāi)展了調(diào)查和研究[3-5]，對(duì)其子實(shí)體的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定[6]。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)對(duì)紅汁乳菇菌絲體的營(yíng)養(yǎng)特性和單因子生長(zhǎng)條件等進(jìn)行了研究[7-8]。采用液體發(fā)酵技術(shù)是獲得紅汁乳菇菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物的重要手段，探索液體發(fā)酵條件對(duì)紅汁乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響，可為大規(guī)模的菌絲體生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 紅汁乳菇由黔南民族師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。完全培養(yǎng)基（液體）配方：葡萄糖2.000%，蛋白胨0.200%，磷酸二氫鉀0.046%，磷酸氫二鉀0.100%，硫酸鎂0050%，維生素B1 0.003 mg/100 mL，pH值6.5。液體種子培養(yǎng)基配方同PDA培養(yǎng)基，但不加瓊脂。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子制備 斜面種子（一級(jí)種）制備：將采集的新鮮子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，采用組織分離法獲得母種，經(jīng)轉(zhuǎn)接獲得一級(jí)種。液體種子制備：用 250 mL 三角瓶，裝入100 mL液體種子培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下接入約5 mm×5 mm紅汁乳菇一級(jí)種1塊，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，于27 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)5 d，制成液體菌種。

1.2.2 紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵單因子試驗(yàn)

1.2.2.1 紅汁乳菇菌絲體的生長(zhǎng)曲線 用250 mL三角瓶作培養(yǎng)容器，裝入100 mL完全培養(yǎng)基，常規(guī)高壓滅菌后，在無(wú)菌條件下接入10 mL液體菌種，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，于27 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)，接種培養(yǎng)1 d后，每天取3瓶，測(cè)量菌絲體干質(zhì)量和發(fā)酵液的pH值。

1.2.2.2 碳源篩選試驗(yàn) 分別用山梨醇（單糖），麥芽糖、蔗糖（雙糖），玉米粉、馬鈴薯粉（多糖）代替完全培養(yǎng)基中的葡萄糖，篩選不同碳源對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理（包括葡萄糖），3次重復(fù)。

1.2.2.3 氮源篩選試驗(yàn) 分別用酵母膏、尿素、甘氨酸（有機(jī)氮），氯化銨、硫酸銨、硝酸銨（無(wú)機(jī)氮）代替完全培養(yǎng)基中的蛋白胨，篩選不同氮源對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理（包括蛋白胨），3次重復(fù)。

1.2.2.4 發(fā)酵起始pH值試驗(yàn) 采用完全培養(yǎng)基，設(shè)置pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0等6個(gè)處理，3次重復(fù)，用10% NaOH和10% HCl調(diào)節(jié)pH值，觀測(cè)不同發(fā)酵起始pH值對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.3 菌絲體液體發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因子試驗(yàn)的結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)[9]，優(yōu)化液體發(fā)酵條件。

1.2.4 試驗(yàn)測(cè)定方法 發(fā)酵液用滌綸布過(guò)濾，放入60 ℃電熱恒溫干燥箱內(nèi)烘48 h，用電子天平稱量菌絲的干質(zhì)量;用精密pH試紙、pHS-25A型數(shù)字酸度計(jì)同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵單因子試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 紅汁乳菇菌絲體的生長(zhǎng)曲線 以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制菌絲體的生長(zhǎng)曲線。由圖1可以看出，紅汁乳菇菌絲體的生長(zhǎng)過(guò)程，基本上與種群在有限環(huán)境中連續(xù)增長(zhǎng)的邏輯斯諦曲線相符合[10]，1～2 d為增長(zhǎng)的開(kāi)始期，2～3 d 為加速期，5～7 d為飽和期，5 d時(shí)菌絲干質(zhì)量最高。因此，其菌絲體的液體培養(yǎng)時(shí)間為5 d即可。

液體發(fā)酵體系中pH值隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，由發(fā)酵初始時(shí)的6.5降至4左右（圖2），這可能是發(fā)酵代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸導(dǎo)致的。

2.1.2 碳源對(duì)紅汁乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響 由表1可知，紅汁乳菇菌絲體對(duì)碳源的利用較廣，單糖、雙糖和多糖都可以利用。在供試的碳源中，對(duì)葡萄糖的利用最好，發(fā)酵液菌絲干質(zhì)量最高，達(dá) 8.082 g/L;其次為馬鈴薯粉，發(fā)酵液菌絲干質(zhì)量為7.391 g/L;山梨醇最差。對(duì)不同供試碳源處理的菌絲干質(zhì)量進(jìn)行方差分析可知，葡萄糖與麥芽糖、蔗糖、山梨醇等碳源差異顯著，但與馬鈴薯粉、玉米粉沒(méi)有顯著差異，若進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，從經(jīng)濟(jì)成本考慮可選擇馬鈴薯粉或玉米粉作為紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵的碳源。

2.1.3 氮源對(duì)紅汁乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響 由表2可知，紅汁乳菇菌絲體對(duì)供試的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮都能利用。在供試的氮源中，對(duì)酵母膏的利用最好，發(fā)酵液菌絲干質(zhì)量達(dá)7.155 g/L，其次為蛋白胨，對(duì)甘氨酸的利用最差。對(duì)不同供試氮源處理的菌絲干質(zhì)量進(jìn)行方差分析可知，供試的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮的一些種類之間，發(fā)酵液的菌絲干質(zhì)量差異不顯著，表明紅汁乳菇菌絲體對(duì)氮源的利用較廣泛。

2.1.4 發(fā)酵起始pH值對(duì)紅汁乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響 由表3可知，紅汁乳菇菌絲體對(duì)發(fā)酵環(huán)境的pH值適應(yīng)范圍較廣，液體發(fā)酵的起始pH值在 3.0～8.0都能生長(zhǎng)。培養(yǎng)6 d后，發(fā)酵起始pH值為5.0的處理菌絲體的干質(zhì)量最大，為7.283 g/L。這說(shuō)明紅汁乳菇菌絲體在中性或偏酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)較好。

2.2 紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮原料的成本，試驗(yàn)選擇馬鈴薯粉作為碳源，酵母膏作為氮源。選擇馬鈴薯粉濃度（A）、酵母膏濃度（B）、pH值（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）等4因子進(jìn)行 L9（34） 正交試驗(yàn)，用菌絲體干質(zhì)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

從表5可以看出，處理9發(fā)酵條件組合的菌絲體干質(zhì)量最高。表明菌絲液體發(fā)酵較為優(yōu)化的發(fā)酵條件為A3B3C2D1，即碳源馬鈴薯粉濃度為3%，氮源酵母膏濃度為0.3%，起始pH值為6.0，發(fā)酵時(shí)間5 d。碳源馬鈴薯粉R=4.552，為最大，表明碳源對(duì)液體發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量的影響較其他發(fā)酵因子大，是影響紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵干質(zhì)量的關(guān)鍵性因子。

3 結(jié)論與討論

紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵對(duì)碳源的利用較廣，葡萄糖是供試碳源中菌絲干質(zhì)量最高的碳源，符合真菌對(duì)碳營(yíng)養(yǎng)需求的一般特征，本試驗(yàn)以馬鈴薯粉、玉米粉作供試碳源，雖菌絲干質(zhì)量沒(méi)有葡萄糖高，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析其與葡萄糖無(wú)顯著差異，若進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，從經(jīng)濟(jì)成本考慮可選擇馬鈴薯粉或玉米粉作紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵的碳源。紅汁乳菇菌絲體對(duì)氮源的利用較廣泛，對(duì)供試的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮都能利用，對(duì)酵母膏的利用最好，其次為蛋白胨，可用它們作為紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵的氮源。紅汁乳菇菌絲體對(duì)發(fā)酵環(huán)境的起始pH適應(yīng)范圍較廣，但菌絲體在中性或偏酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)較好，說(shuō)明紅汁乳菇菌絲體充分適應(yīng)了我國(guó)南方酸性的土壤環(huán)境。

本研究表明，紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵條件的較優(yōu)組合為馬鈴薯粉作碳源，濃度為3%;酵母膏作氮源，濃度為0.3%;起始pH值為6.0;發(fā)酵時(shí)間為5 d。在27 ℃溫度條件下，菌絲體干質(zhì)量最大，達(dá)10.094 g/L。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉潤(rùn)進(jìn)，陳應(yīng)龍. 菌根學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2007.

[2]黃年來(lái). 中國(guó)食用菌百科[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993.

[3]劉建成，陳先玉，李文藝. 湘西紅汁乳菇的分布及生態(tài)研究[J]. 中國(guó)食用菌，1995，14（6）：36-37.

[4]羅惟希，廖洪初，萬(wàn)伍華，等. 贛西紅汁乳菇生態(tài)調(diào)查[J]. 食用菌，2005（4）：7-8.

[5]李 剛，李玲玲. 資興市紅汁乳菇生態(tài)調(diào)查[J]. 中國(guó)食用菌，1995，14（3）：19-20.

[6]鄧百萬(wàn)，楊海濤，李志洲，等. 紅汁乳菇子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定與分析[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2004，11（1）：49-51.

[7]趙 洪，鄧功成. 紅汁乳菇菌絲體營(yíng)養(yǎng)特性研究[J]. 食用菌，2008，30（6）：9-10.

[8]鄧功成，趙 洪，高禮安，等. 紅汁乳菇菌絲體液態(tài)發(fā)酵條件研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：238-240.

[9]李春喜，王志和，王林文. 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M]. 2版.北京：科學(xué)出版社，2000.

[10]牛翠娟. 基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2015.

收稿日期：2019-08-23

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金[編號(hào)：黔科合LH字（2014）7425]。

作者簡(jiǎn)介：趙 洪（1968—），男，貴州甕安人，副教授，主要從事生態(tài)學(xué)教學(xué)和環(huán)境生態(tài)及資源開(kāi)發(fā)研究。E-mail：732140126@qq.com。