尹秀 王俊 張二豪 祿亞洲

摘要：采用不同濃度聚乙二醇（PEG-6000）對(duì)藏藥甘青青蘭進(jìn)行浸種處理，研究不同濃度PEG-6000對(duì)種子萌發(fā)的影響，待幼苗長至2葉期，轉(zhuǎn)至30% PEG-6000溶液中模擬干旱脅迫，探索幼苗的抗旱情況。結(jié)果表明：不同濃度的PEG-6000浸種對(duì)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈下降趨勢(shì)，且發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與CK差異顯著，不同濃度的PEG-6000浸種對(duì)幼苗生長有促進(jìn)作用。不同濃度的PEG-6000浸種后待幼苗長至2葉期時(shí)置于30% PEG-6000溶液持續(xù)水分脅迫2 d后（PT+30%）與2葉期幼苗蒸餾水持續(xù)處理2 d后（PT）相比，丙二醛含量呈下降趨勢(shì)，可溶性蛋白和游離脯氨酸含量呈上升趨勢(shì)，葉綠素a含量有所增加而葉綠素b含量下降，葉綠素a/b的值增大，說明PEG-6000浸種可以提升甘青青蘭幼苗的抗旱能力。

關(guān)鍵詞：PEG-6000;甘青青蘭;種子萌發(fā)特性;生長指標(biāo);丙二醛;游離脯氨酸;葉綠素;水分脅迫;抗旱性

中圖分類號(hào)： S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2020）13-0168-04

收稿日期：2019-07-19

基金項(xiàng)目：西藏自治區(qū)科技計(jì)劃重大專項(xiàng)（編號(hào)：XZ201901-GA-04）;西藏自治區(qū)科學(xué)技術(shù)研究一般項(xiàng)目（編號(hào)：XZ2017ZRG-22）;西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（藏藥材方向）。

作者簡(jiǎn)介：尹秀（1986—），女，河南駐馬店人，碩士，講師，研究方向?yàn)樗幱弥参锓肿由飳W(xué)。E-mail：yinxiu111@163.com。

通信作者：祿亞洲，博士研究生，講師，研究方向?yàn)樗幱弥参锓肿由飳W(xué)。E-mail：luyazhou001@126.com。唇形科青蘭屬甘青青蘭（Dracocephalum tanguticum Maxim.）為多年生草本[1]，又稱唐古特青蘭，藏藥名“知羊格”[2]，常在高山灌叢林地、松林邊緣、礫石草坡、干燥河谷兩岸生長[3-4]，其味甘、苦，性寒，具有清肝熱、止血、愈瘡、干黃水等作用，用于治療肝胃熱、黃水類病、血癥、瘡口不愈等疾病[5-6]，是青藏高原特有植物和藏醫(yī)常用藥材。有關(guān)甘青青蘭報(bào)道較多的是對(duì)其化學(xué)成分如黃酮類[7-8]、多糖[9]、萜類[10]、揮發(fā)油[11-12]、甾類[13]等進(jìn)行分析;此外，相繼出現(xiàn)甘青青蘭的形態(tài)組織[14]及顯微特征[15]方面的研究;關(guān)于甘青青蘭種子萌發(fā)方面的研究主要采用不同濃度的鹽、聚乙二醇（PEG）、赤霉素對(duì)其種子進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)有一定的影響作用[16-17]。

干旱是西藏西部干旱區(qū)面臨的最主要的氣象災(zāi)害，也是雅魯藏布江河谷地帶常見的主要?dú)庀鬄?zāi)害之一[18-19]。種子萌發(fā)是植物能夠成苗的前提，萌發(fā)期是植物整個(gè)生活史中最重要、最脆弱的階段，也是進(jìn)行抗逆性研究的重要時(shí)期[20]。張艷福等認(rèn)為，種子萌發(fā)和幼苗初期生長比其他生長階段更容易遭受水分和光照等環(huán)境因子及其相互作用的影響，所以常以種子萌發(fā)和幼苗初期生長階段的生長情況評(píng)價(jià)植物的抗逆性[21]。目前，PEG被較多地應(yīng)用于植物種子萌發(fā)及幼苗生長對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)、植物耐旱性評(píng)價(jià)及耐旱品種的篩選培育等相關(guān)研究[22-23]，有研究表明，聚乙二醇處理對(duì)促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長、提高種子活力和抗逆性有一定的作用[24]。

本試驗(yàn)研究不同濃度PEG-6000浸種對(duì)甘青青蘭種子萌發(fā)和幼苗抗旱性的影響，探索干旱脅迫條件下幼苗的耐受性，為今后甘青青蘭人工種植提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2018年10月于西藏農(nóng)牧學(xué)院藏藥材馴化基地（94°20′20″ E、29°40′4″ N）采集甘青青蘭種子，晾干后挑選飽滿一致的種子，2019年3月于西藏農(nóng)牧學(xué)院植物生理生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1PEG-6000預(yù)處理取出上述已挑選的種子，置于超凈工作臺(tái)中加入10% NaClO溶液中消毒 5 min，無菌水多次沖洗，無菌濾紙吸干多余的水分，將處理后的種子分成6份，每份50粒，分別用0、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液進(jìn)行預(yù)處理，放入4 ℃冰箱中浸種24 h，其中隔3 h搖動(dòng)試管，以利于通氣，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.2種子萌發(fā)試驗(yàn)將預(yù)處理后的種子取出，用蒸餾水沖洗干凈，將每個(gè)處理的50粒種子播種于鋪有蒸餾水浸潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為（20±1）℃，光照度為1 000 lx，14 h 光照、10 h黑暗。隔天加入數(shù)滴水以便浸透濾紙，盡量避免干旱。

1.2.32葉期幼苗水分脅迫試驗(yàn)分別用不同濃度0、5%、10%、15%和20% PEG-6000溶液浸種24 h，待種子萌發(fā)周期結(jié)束，幼苗長至2葉期時(shí)用30% PEG-6000溶液持續(xù)處理2 d（PT+30%），對(duì)照為2葉期幼苗蒸餾水持續(xù)處理2 d（PT），2 d后取樣測(cè)定抗旱相關(guān)生理指標(biāo)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1種子萌發(fā)特性的指標(biāo)從種子置床之日起觀察，初始發(fā)芽之日作為該處理發(fā)芽的開始期，連續(xù)3 d不再萌發(fā)時(shí)作為發(fā)芽結(jié)束期，記錄萌發(fā)情況及生長情況，統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)等數(shù)據(jù)。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)量/處理種子數(shù)量×100%;

發(fā)芽勢(shì)=8 d正常發(fā)芽種子數(shù)/處理種子數(shù)×100%;

發(fā)芽指數(shù)（Gi）=∑（Gt/Dt）（Gt為t d的發(fā)芽數(shù)量，個(gè);Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間，d）;

活力指數(shù)（Vi）=Gi×Ss（Ss為平均胚根長）。

觀察后16 d，取出幼苗，用直尺測(cè)量幼苗的苗高及根長，mm。

1.3.2生理生化指標(biāo)分別用不同濃度0、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液浸種24 h，待種子萌發(fā)周期結(jié)束，幼苗長至2葉期時(shí)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，均放入30% PEG-6000浸透濾紙的培養(yǎng)皿中（PT+30%），對(duì)照組用等量的蒸餾水代替（PT），之后每天加約3 mL相應(yīng)的處理液保持濾紙的濕潤，2 d后取樣，測(cè)定抗旱相關(guān)生理指標(biāo)，3次重復(fù)。

采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定丙二醛含量[23];采用磺基水楊酸法測(cè)定游離脯氨酸含量[24];采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量[25];采用乙醇提取比色法測(cè)定葉綠素含量[26]。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后采用Microsoft Excel 2003和Origin 8.6繪圖，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)平均數(shù)進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度PEG-6000預(yù)處理對(duì)甘青青蘭種子萌發(fā)的影響

將甘青青蘭種子分別用0（CK）、5%、10%、15%、20% PEG-6000溶液處理24 h后進(jìn)行培養(yǎng)，3 d 后開始萌發(fā)并對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（表1）顯示，CK組的萌發(fā)情況較好，隨著PEG-6000濃度增大，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)等呈下降趨勢(shì)，其中10%和15%處理下差別不大，20%處理下對(duì)種子萌發(fā)影響較大，表明PEG-6000預(yù)處理對(duì)甘青青蘭種子萌發(fā)沒有促進(jìn)作用，對(duì)種子萌發(fā)有輕微的抑制作用，這種現(xiàn)象可能是甘青青蘭種子對(duì) PEG-6000 較為敏感，較高濃度的PEG處理會(huì)使植物膜脂過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜滲漏，因而對(duì)植物的萌發(fā)、生長產(chǎn)生抑制作用。

2.2不同濃度PEG-6000預(yù)處理對(duì)甘青青蘭幼苗生長的影響

將甘青青蘭種子用不同濃度PEG-6000溶液處理后再進(jìn)行培養(yǎng)，由表2可見，經(jīng)PEG-6000處理后會(huì)促進(jìn)幼苗生長，有利于地上部分生長，而對(duì)

2.3PEG-6000處理對(duì)甘青青蘭幼苗生理生化特性的影響

2.3.1PEG-6000處理對(duì)甘青青蘭幼苗丙二醛含量的影響由圖1可見，CK組（PT）和試驗(yàn)組（PT+30%）丙二醛含量相比呈下降趨勢(shì)，其中10%、15%、20% 浸種后丙二醛含量分別降低20.71、24.04、30.75 nmol/g，分別較CK組降低2.25、2.5、3.21倍?？梢?，用15%、20% PEG-6000浸種后丙二醛含量降幅較大，表明15%、20% PEG-6000浸種減緩了水分脅迫條件下質(zhì)膜的損傷和氧化，增強(qiáng)了幼苗的抗旱能力。

2.3.2PEG-6000處理對(duì)甘青青蘭幼苗可溶性蛋白含量的影響由圖2可見，與對(duì)照組（PT）相比，試驗(yàn)組（PT+30%）可溶性蛋白含量均呈上升趨勢(shì)，15% PEG-6000浸種組可溶性蛋白含量增加 0.33 μg/g，為所有浸種處理組中可溶性蛋白增幅最大的一組。由此說明，可以通過適量濃度的PEG預(yù)處理來增加幼苗的可溶性蛋白含量，從而提高幼苗的抗?jié)B透脅迫能力。

2.3.3PEG-6000浸種對(duì)甘青青蘭幼苗游離脯氨

酸含量的影響圖3表明，與對(duì)照組（PT）相比，試驗(yàn)組（PT+30%）幼苗葉片中游離脯氨酸的含量呈升高趨勢(shì)，其中15%、20%浸種處理組游離脯氨酸含量變化較大且呈極顯著差異，分別增加93.54、113.07 μg/g，表明適宜濃度的PEG-6000浸種可以提升甘青青蘭幼苗在水分脅迫下的游離脯氨酸含量，從而利于幼苗在干旱環(huán)境下吸收水分抵御逆境。

2.3.4PEG-6000浸種對(duì)甘青青蘭幼苗葉綠素含量的影響圖4顯示，與對(duì)照組（PT）相比，試驗(yàn)組（PT+30%）葉綠素a含量明顯增加，而葉綠素b含量下降，且試驗(yàn)組（PT+30%）葉綠素a/b的值明顯增大，且試驗(yàn)組葉綠素a/b的值要明顯高于對(duì)照組。葉綠素a/b的值明顯增大是植物對(duì)逆境環(huán)境的一種防御性適應(yīng)，捕光色素葉綠素b含量的降低使得植物的光捕獲減弱，活性氧產(chǎn)生量減少，酶的抑制和蛋白質(zhì)的降解減少，使植物更加耐旱，說明 PEG-6000 浸種可以提升甘青青蘭幼苗的耐旱能力。

3結(jié)論與討論

PEG 脅迫能夠影響種子活力，使種子萌發(fā)受到抑制或發(fā)芽延遲[27-29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，PEG-6000對(duì)甘青青蘭種子的萌發(fā)具有明顯的延緩和抑

制作用，表現(xiàn)為隨脅迫程度的增加，種子的萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均下降，但對(duì)幼苗生長有一定的促進(jìn)作用，這可能與物種本身的特性及其環(huán)境的異質(zhì)性有關(guān)。

在一定脅迫條件下，植物體內(nèi)生理生化特性會(huì)發(fā)生變化，如丙二醛、游離脯氨酸、可溶性蛋白含量會(huì)提高，這是植物對(duì)逆境脅迫的一種適應(yīng)性的表現(xiàn)，可以作為植物抗性的指標(biāo)[30]。本試驗(yàn)通過不同濃度 PEG-6000 處理種子，待長出幼苗后置于30% PEG-6000 溶液模擬的干旱脅迫環(huán)境下，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)甘青青蘭與未經(jīng)其干旱脅迫處理的相比，丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白含量均發(fā)生了不同程度的變化，30% PEG-6000溶液處理幼苗后，其丙二醛含量呈下降趨勢(shì)，可溶性蛋白和游離脯氨酸含量呈上升趨勢(shì)，葉綠素a含量有所增加而葉綠素b含量下降，葉綠素a/b的值增大，說明PEG-6000浸種可以提升甘青青蘭幼苗的抗旱能力;但較高濃度PEG-6000脅迫會(huì)導(dǎo)致幼苗生長狀況變差甚至死亡，說明甘青青蘭的抗旱性不強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李文娟，焦立響，白紅麗，等. 藏藥甘青青蘭中6種微量元素的初級(jí)形態(tài)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：288-290.

[2]中國科學(xué)院云南植物研究所. 中國植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1977：353.

[3]薛世萍，姜華，楊麗霞，等. 藏藥甘青青蘭的藥學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（9）：111-112.

[4]青海省生物研究所. 青藏高原藥物圖鑒[M]. 西寧：青海人民出版社，1972：140.

[5]周雪杉，武尉杰，和靜萍，等. 藏藥甘青青蘭石油醚部位化學(xué)成分研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2014，28（3）：27-29.

[6]澤仁旺姆，于順利，尼珍. 藏藥材唐古特青蘭在西藏自治區(qū)的含布和資源量調(diào)查[J]. 西藏科技，2011（11）：29-30.

[7]謝建鋒，朱林燕，孔子銘，等. 唐古特青蘭總黃酮的提取及其體外抗氧化活性的研究[J]. 華西藥學(xué)雜志，2015，30（4）：422-424.

[8]王敏，葉菊，馬才，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化回流提取藏藥甘青青蘭總黃酮工藝[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志，2018，24（11）：36-40.

[9]慶易微，熱增才旦. 不同提取方法研究甘青青蘭中多糖含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（26）：12552-12562.

[10]李霽昕，賈忠建. 甘青青蘭化學(xué)成分的研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（1）：188-192.

[11]黃小平，陳仕江，張毅，等. 甘青青蘭揮發(fā)油化學(xué)成分研究[J]. 成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（2）：60-61.

[12]肖遠(yuǎn)燦，謝順燕，董琦，等. 青海產(chǎn)唐古特青蘭鮮花和新鮮枝葉的精油成分分析[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2015，24（3）：112-114.

[13]沈杰，葉蘊(yùn)華，周亞偉. 藏藥甘青青蘭的生物活性成分研究[J]. 中國藥學(xué)雜志，2009，44（3）：170-175.

[14]宗露，盧曉琳，馬逾英，等. 甘青青蘭的形態(tài)組織學(xué)研究[J]. 華西藥學(xué)雜志，2012，27（3）：337-338.

[15]李莉，馬媛媛，馬志剛. 藏藥唐古特青蘭的顯微特征研究[J]. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，30（1）：45-47.

[16]尹秀，鄧云天，羅新勇，等. 鹽脅迫和干旱脅迫對(duì)藏藥甘青青蘭種子萌發(fā)的影響[J]. 種子，2017，36（4）：17-20.

[17]郭尚磊，澤仁旺姆，尼珍. 不同濃度赤霉素處理對(duì)甘青青蘭種子發(fā)芽的影響[J]. 四川農(nóng)業(yè)科技，2016（11）：26-27.

[18]杜軍，楊志剛. 西藏自治區(qū)縣級(jí)氣候區(qū)劃[M]. 北京：氣象出版社，2011：2-5.

[19]楊春艷，沈渭?jí)?，林乃? 西藏高原氣候變化及其差異性[J]. 干旱區(qū)地理，2014，37（2）：290-298.

[20]李志萍，張文輝，崔豫川. NaCl和Na2CO3脅迫對(duì)栓皮櫟種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35（3）：742-751.

[21]張艷福，姚衛(wèi)杰，郭其強(qiáng)，等. 干旱脅迫對(duì)砂生槐種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，43（10）：45-56.

[22]馬彥軍，馬瑞，曹致中，等. PEG脅迫對(duì)胡枝子幼苗葉片生理特性的影響[J]. 中國沙漠，2012，32（6）：1662-1668.

[23]齊淑艷，段繼鵬，郭婷婷，等. 入侵植物牛膝菊種子萌發(fā)對(duì)PEG模擬干旱脅迫的響應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2014，33（5）：1190-1194.

[24]于軍，焦培培. 聚乙二醇（PEG6000）模擬干旱脅迫抑制矮沙冬青種子的萌發(fā)[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（2）：355-360.

[25]李振基，宋愛琴. 聚乙二醇（PEG）模擬水分脅迫對(duì)木荷種子萌發(fā)的影響[J]. 福建林業(yè)科技，2007，34（4）：1-3.

[26]Atree S M，F(xiàn)owke L C. Embryogeny of gymnosperms：advances in synthetic seed technology of conifers[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1993，35（1）：1-35.

[27]魚小軍，師尚禮，龍瑞軍，等. 生態(tài)條件對(duì)種子萌發(fā)影響研究進(jìn)展[J]. 草業(yè)科學(xué)，2006，23（10）：44-49.

[28]邊才苗. 木荷種子萌發(fā)及對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[J]. 福建林業(yè)科技，2005，32（3）：112-115.

[29]張立軍，樊金娟，阮燕曄，等. 聚乙二醇在植物滲透脅迫生理研究中的應(yīng)用[J]. 植物生理學(xué)通訊，2004，40（3）：361-364.

[30]顏華，賈良輝，王根軒. 植物水分脅迫誘導(dǎo)蛋白的研究進(jìn)展[J]. 生命的化學(xué)，2002，22（2）：165-168.石欣隆，楊月琴，侯小改，等. 外源殼寡糖對(duì)唐古特白刺抗旱性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（13）：172-177.doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2020.13.034