陳明明，司馬靚杰，劉巍巍，張宜林

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471003)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在男性的惡性腫瘤中排名第6[1-3]。我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率和死亡率逐年快速上升[4-5]。盡管在過(guò)去的10年中，癌癥的治療方式(包括手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法)得到了明顯改善，但膀胱癌患者的預(yù)后并未得到顯著提高[6-9]。 因此，迫切需要尋找新的治療藥物和治療靶標(biāo)以改善該疾病患者的預(yù)后。最近的研究表明，局部麻醉藥可能在癌癥治療中發(fā)揮有益作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[10]。布比卡因是廣泛用于長(zhǎng)期、局部和區(qū)域麻醉的麻醉藥[11]。研究已證實(shí)布比卡因可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡和抑制胃癌的發(fā)生[12-13]。但探討局部麻醉劑對(duì)軟骨形成腫瘤影響的研究較少。本研究探討布比卡因?qū)θ税螂装㏕24細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和凋亡的影響及其機(jī)制，以期為布比卡因應(yīng)用于治療膀胱癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

布比卡因(百奧萊博科技有限公司，中國(guó))；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(Invitrogen公司，美國(guó))；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒 (PIERCE公司，美國(guó)) ；MatrigelTM底膜基質(zhì) (BD公司 ，美國(guó)) ；Caspase-3、Bax、Bcl-2、 Ki67、AMPKα1抗體 (Sigma公司，美國(guó))；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(Santa Cruz公司，美國(guó))；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (Annexin PE/7-AAD，南京凱基生物有限公司,中國(guó)) ；Transwell小室及人工基底膜 (BD公司 ,美國(guó)) ；高速低溫離心機(jī)(Beckman公司，美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、Powerpac電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；FACS Vantage SE 流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP (UVP公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

T24細(xì)胞在含有10%(φ)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，置于5%(φ)CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率達(dá)到85%以上時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率

選擇不同劑量(0、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、25、50、100 mmol/L)的布比卡因處理膠質(zhì)瘤T24細(xì)胞，將處理后的U-87細(xì)胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)24 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)每孔加入10 μL CCK8試劑并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組吸光度(A)，繪制折線圖并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將T24細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別用0、1.25、2.5、5 mmol/L的布比卡因處理T24細(xì)胞。48 h后，細(xì)胞移入6孔板，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，孵育10 d。在培養(yǎng)過(guò)程中每3天更換1次新鮮的完整培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞菌落用4%(φ)多聚甲醛固定15 min，吸取多聚甲醛棄掉，加入1 mL/孔0.1%結(jié)晶紫孵育15 min,PBS洗滌3次。記錄細(xì)胞克隆數(shù)，并在顯微鏡下觀察。

1.5 RT-PCR檢測(cè)增殖標(biāo)記物的表達(dá)

使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過(guò)超微紫外光分光光度計(jì)在260和280 nm處測(cè)定吸光度。 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用Super RT cDNA試劑盒合成cDNA。 此外，使用Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit進(jìn)行PCR，分別在95 ℃ 15 s 和60 ℃ 60 s條件下使用ABI 7500將反應(yīng)激活。用于該反應(yīng)的Ki67、Survivin和GAPDH的引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取處理過(guò)的T24細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔的細(xì)胞量接種至6孔板中，置37 ℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。分別收集每個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞。按凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用Annexin V-FITC和pro-pidium iodide (PI) 雙染法在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，使用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 試劑盒檢測(cè)SOD的活性和MDA、GSH的水平

取處理過(guò)的T24細(xì)胞，分別采用SOD、MDA、GSH試劑盒測(cè)定SOD、GSH活性及MDA的含量。操作步驟嚴(yán)格按照大鼠SOD、MDA、GSH試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。另外，為驗(yàn)證布比卡因是否通過(guò)AMPK來(lái)影響細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激及凋亡，本研究引入AMPK抑制劑Compound C(CC)，將T24細(xì)胞分為4組：0 mmol/L組、5 mmol/L組布比卡因、CC組和5 mmol/L布比卡因組+CC組，檢測(cè)SOD活性。

1.8 免疫印跡法

取處理過(guò)的T24細(xì)胞，使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞樣品。然后使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Beyotime)定量蛋白質(zhì)濃度。含有20 mg蛋白質(zhì)的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗 (Caspase-3,1∶1 000; Bax,1∶1 000; Bcl-2,1∶1 000; Ki67,1∶1 000; AMPKα1,1∶1 000)于4 ℃封閉過(guò)夜，第2天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL,設(shè)置曝光參數(shù)，檢測(cè)目的條帶對(duì)應(yīng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的布比卡因?qū)24細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，不同劑量布比卡因處理人膀胱癌T24細(xì)胞24 h后，與0 mmol/L組比較， 0.313、0.625、1.25、2.5、5 mmol/L組的T24細(xì)胞存活率無(wú)顯著變化(P>0.05)；10、25、50、100 mmol/L組的T24細(xì)胞存活率以布比卡因濃度依賴的方式顯著降低(P<0.05)，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.2 布比卡因?qū)24細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L布比卡因組的細(xì)胞克隆形成率無(wú)顯著變化(P>0.05)，而 2.5 mmol/L和5 mmol/L組的克隆形成率呈劑量依賴性顯著減少(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A. 克隆形成實(shí)驗(yàn)(200×)；B. 克隆形成實(shí)驗(yàn)的直方圖。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.3 布比卡因?qū)24細(xì)胞Ki67和 Survivin的mRNA水平的影響

如圖3所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L組的Ki67和Survivin的mRNA水平無(wú)顯著變化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L組的Ki67 mRNA和Survivin mRNA水平呈劑量依賴性顯著降低(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.4 布比卡因?qū)24細(xì)胞凋亡的影響

如圖4所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L組的細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著變化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L組的細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性顯著升高(P<0.05)。

A.細(xì)胞凋亡分布圖； B.細(xì)胞凋亡情況直方圖。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.5 布比卡因?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L組的Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表達(dá)比例無(wú)顯著變化(P>0.05)；2.5 mmol/L和5 mmol/L組的Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表達(dá)比例呈劑量依賴性顯著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)； B.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的直方圖。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.6 布比卡因?qū)OD活性、GSH和MDA含量的影響

如圖6所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L組的SOD和GSH含量無(wú)顯著變化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mmol/L組的SOD和GSH含量呈劑量依賴性顯著降低(P<0.05)；而1.25 mmol/L組的MDA含量無(wú)顯著變化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mol/L組的MDA含量呈劑量依賴性顯著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因。A. SOD活性； B. MDA含量； C. GSH含量。與0 mmol/L組比較：*P<0.05。

2.7 布比卡因?qū)MPK水平、T24細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激以及凋亡的影響

如圖7(A)所示，與0 mmol/L組比較，1.25 mmol/L布比卡因組的AMPK蛋白水平無(wú)顯著變化(P>0.05)，2.5 mmol/L和5 mmol/L組的AMPK蛋白水平呈劑量依賴性顯著升高(P<0.05)，表明布比卡因可促進(jìn)AMPK的表達(dá)。如圖7(B)所示，與0 mmol/L組比較，5 mmol/L組SOD活性顯著降低(P<0.05)，CC組SOD活性顯著升高(P<0.05)；而與CC組比較，5 mmol/L布比卡因組+CC組SOD活性顯著降低(P<0.05)。如圖7(C)(D)所示，與0 mmol/L組比較，5 mmol/L組AMPKα1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Ki67蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例顯著升高(P<0.05)；CC組AMPKα1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Ki67蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例降低(P<0.05)。與CC組比較，5 mmol/L組+CC組AMPKα1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Ki67蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比例顯著升高(P<0.05)。

1. 0 mmol/L布比卡因; 2. 1.25 mmol/L布比卡因; 3. 2.5 mmol/L布比卡因; 4. 5 mmol/L布比卡因; 5. 抑制劑Compound C; 6. 抑制劑Compound C+5 mmol/L布比卡因。A. AMPKα1的蛋白表達(dá)； B. SOD活性； C.引入抑制劑后AMPKα1、Ki67和Caspase-3的蛋白表達(dá)； D.引入抑制劑后AMPKα1、Ki67和Caspase-3的蛋白表達(dá)直方圖。與0 mmol/L組比較：*P<0.05；與CC組比較：#P<0.05。

3 討論

局部麻醉藥的作用范圍很廣，越來(lái)越多的證據(jù)表明，局部麻醉劑對(duì)各種不同類型的細(xì)胞都是有毒的[14-15]。布比卡因是使用最廣泛的局部麻醉藥之一，據(jù)報(bào)道布比卡因?qū)Χ喾N軟骨瘤細(xì)胞均有毒性，布比卡因?qū)е录?xì)胞活力呈劑量和時(shí)間依賴性顯著降低[16]。本研究通過(guò)不同劑量布比卡因處理人膀胱癌T24細(xì)胞24 h后，T24細(xì)胞的存活率以布比卡因濃度依賴的方式降低。因此，本研究選擇無(wú)顯著毒性的布比卡因劑量 (0、1.25、2.5、5 mmol/L) 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

癌細(xì)胞無(wú)限增殖是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。有報(bào)道稱，在一定濃度范圍內(nèi)布比卡因可誘導(dǎo)卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞死亡，并抑制結(jié)腸癌和胰腺癌細(xì)胞的增殖[12,17]。研究發(fā)現(xiàn)布比卡因可顯著減少呈Ki67陽(yáng)性核染色的Caco-2細(xì)胞數(shù)量，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[17]。同樣，Xuan等[12]證實(shí)布比卡因治療能使SKOV-3和PC-3細(xì)胞中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞減少，抑制卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，布比卡因處理后膀胱癌T24細(xì)胞克隆形成率降低，Ki67 mRNA和Survivin mRNA的表達(dá)降低，提示布比卡因能夠抑制膀胱癌T24細(xì)胞惡性增殖。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤生長(zhǎng)的主要手段之一[18]。研究發(fā)現(xiàn)隨著布比卡因濃度的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，所有腫瘤組的凋亡細(xì)胞數(shù)量均有所增加[16]。Chang等[19]在體外研究中發(fā)現(xiàn)布比卡因能有效誘導(dǎo)人乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡。同樣地，用布比卡因治療人甲狀腺癌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降和菌落形成。這種治療通過(guò)線粒體損傷和絲裂原活化蛋白激酶的激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因處理膀胱癌T24細(xì)胞后，Cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白表達(dá)比值和細(xì)胞凋亡率均升高，提示布比卡因可誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡。

GSH和SOD是細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)，均在細(xì)胞氧化應(yīng)激中起重要作用[21-22]。由于清除活性氧的損害，GSH的消耗導(dǎo)致氧化損傷[23]。SOD可以中和自由基，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧損傷[24]。研究發(fā)現(xiàn)布比卡因通過(guò)降低SOD活性和GSH含量，增加MDA含量，誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷[25]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因處理膀胱癌T24細(xì)胞后SOD活性和GSH含量降低，MDA含量升高，結(jié)果提示布比卡因可誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞氧化應(yīng)激。

AMPK被認(rèn)為是細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)它感知細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)，特別是在ATP缺乏的情況下，并且與細(xì)胞應(yīng)激的調(diào)節(jié)有關(guān)[26]。最近研究表明AMPK可能參與了布比卡因誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞毒性[27]。本研究發(fā)現(xiàn)布比卡因通過(guò)上調(diào)AMPKα1蛋白表達(dá)水平，降低Ki67蛋白表達(dá)水平和SOD活性，上調(diào)Cleaved Caspase-3/Caspase-3的蛋白表達(dá)比值，提示布比卡因可通過(guò)上調(diào)AMPK水平抑制人膀胱癌T24細(xì)胞惡性增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。

綜上所述，布比卡因可通過(guò)上調(diào)AMPK水平抑制人膀胱癌T24細(xì)胞惡性增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，為布比卡因應(yīng)用于臨床治療膀胱癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。