來自細(xì)菌體的毒素是這套編輯體系的王牌。

CRISPR-Cas9基因編輯對(duì)生命科學(xué)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)有目共睹，不過還在蓬勃發(fā)展中的它依然有不少難點(diǎn)尚未攻克，“線粒體DNA（mtDNA）編輯”就是其中一個(gè)重大難點(diǎn)。

很多科研人員試圖打破此局面。最近有捷報(bào)傳來：有人跳出了CRISPR-Cas9的傳統(tǒng)框架，借助一種獨(dú)特的細(xì)菌酶實(shí)現(xiàn)線粒體中DNA的編輯，2020年7月8日研究成果刊載在《自然》（Nature）雜志上。

當(dāng)然，很多人會(huì)有兩個(gè)疑問：其一，我們?yōu)槭裁捶且ゾ庉嬀€粒體里那些少得可憐的DNA？其二，為什么線粒體基因要比細(xì)胞核里的基因難編輯得多？

何為堿基編輯

針對(duì)第一個(gè)問題，需要指出，mtDNA量雖少，但突變起來仍極具殺傷力。mtDNA在發(fā)生突變后，很可能引發(fā)某些母系遺傳的特定疾病，往往會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉造成損傷（線粒體也容易因此喪失制造ATP的能力）。

第二個(gè)問題里的難點(diǎn)在于線粒體的保護(hù)屏障。目前人類可以借助CRISPR-Cas9對(duì)幾乎每一個(gè)實(shí)驗(yàn)生物體的基因組進(jìn)行調(diào)整——但這類操作要成功，有個(gè)重要環(huán)節(jié)不能少：研究者需要用一串特定的RNA鏈將Cas9酶引導(dǎo)至他們希望編輯的那個(gè)DNA區(qū)域。

Cas9酶很重要，負(fù)責(zé)目標(biāo)區(qū)域的DNA雙鏈解旋，令其成為可編輯的兩條單鏈（局部而非整體解旋）。在操作細(xì)胞核DNA時(shí)，這一切都沒問題；但當(dāng)面對(duì)線粒體時(shí)，包覆在外的雙層膜會(huì)把Cas9酶擋在外面。所以問題的核心就是重要人員進(jìn)不去線粒體。

目前有一些科學(xué)家希望基于一種超高精準(zhǔn)度的基因編輯系統(tǒng)——人稱堿基編輯，解決線粒體基因編輯難題。

在詳述如何讓編輯工具進(jìn)入線粒體內(nèi)部之前，我們先介紹一下這個(gè)堿基編輯技術(shù)。顧名思義，操作者要對(duì)基因組里的單個(gè)堿基進(jìn)行更改，如把胞嘧啶變成胸腺嘧啶。相比于一段一段地更改基因序列的常規(guī)基因編輯，精準(zhǔn)操控每一個(gè)堿基的堿基編輯看起來已經(jīng)把CRISPR的概念推到了極致。

2018年底，哈佛大學(xué)華裔科學(xué)家劉如謙收到一封電子郵件。信中來自華盛頓大學(xué)的微生物學(xué)家約瑟夫·穆格（Joseph Mougous）和同事在西雅圖做實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種由洋蔥伯克氏菌（Burkholderia cenocepacia）產(chǎn)生的毒素具有催化作用，可以將胞嘧啶（簡(jiǎn)稱C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（簡(jiǎn)稱U）。

在DNA中不常見的U有著與胸腺嘧啶（簡(jiǎn)稱T）相似的行為，所以如果轉(zhuǎn)化得到了U，在某種程度上就可以當(dāng)作是得到了T。簡(jiǎn)單一句話：來自洋蔥伯克氏菌的毒素可以有效地將基因組序列中的C轉(zhuǎn)化為T。

順著與穆格差不多的思路，劉如謙等人借助類似的酶實(shí)現(xiàn)了堿基編輯。該酶是胞苷脫氨酶的一種，而胞苷脫氨酶也是一種細(xì)菌毒素。

棄Cas9，用DddA

以上這些都只是在理論上建構(gòu)出了堿基編輯的體系，但要在現(xiàn)實(shí)中完成線粒體內(nèi)的堿基編輯就很難了。穆格和劉如謙的酶都存在缺陷：通常只能對(duì)解開了螺旋的DNA單鏈進(jìn)行堿基更改。這自然引出了前文提到的Cas9酶難題：要想解旋DNA，就得帶上Cas9酶；可帶上了Cas9酶，就進(jìn)不去線粒體。所以他們需要另覓他法。

不久后，穆格這邊有了好消息。他們發(fā)現(xiàn)了一種名為DddA的酶（胞苷脫氨酶的一種，雙鏈結(jié)構(gòu)）可以直接作用于雙鏈DNA，無須依靠Cas9酶解旋。DddA開展工作時(shí)，能讓雙鏈DNA始終完好如初，潤(rùn)物細(xì)無聲地完成“篡改”。

劉如謙和穆格一致認(rèn)為，舍去Cas9酶，讓DddA單槍匹馬地殺向線粒體，就可以避開其外部膜的阻擋直搗基因組。最后的結(jié)果也確實(shí)如他們所愿。

不過在實(shí)際調(diào)用DddA的過程中，也存在不少難點(diǎn)。其中最主要的問題在于胞苷脫氨酶的本質(zhì)是毒素，對(duì)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞有毒：DddA會(huì)把目力所及的全部胞嘧啶（C）都變成胸腺嘧啶（T），脆弱的生命體經(jīng)不起這么狂躁的大換血。

要讓DddA為基因編輯所用，就要先“馴服”它。研究團(tuán)隊(duì)將它分解成了兩部分（名為split-DddAtox）：彼此分離時(shí)，則均處于無活性狀態(tài)，對(duì)堿基不構(gòu)成威脅；合體后，DddA就可以大展拳腳。另外，他們給兩個(gè)split-DddAtox都連上了TALE蛋白，進(jìn)而成為TALE-split-DddAtox。

在一起進(jìn)入線粒體之后，TALE蛋白會(huì)連接上目標(biāo)DNA片段，接著兩個(gè)split-DddAtox也可以順勢(shì)合體，然后把C們轉(zhuǎn)化成T們。

另一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是帶路的向?qū)?。TALE-split-DddAtox需要有人領(lǐng)著它穿過內(nèi)外兩層的線粒體膜，然后找到mtDNA。劉如謙等人給TALE-split-DddAtox標(biāo)記了一段氨基酸序列，作為線粒體靶向信號(hào)，幫助前者順利抵達(dá)最終目的地。

換言之，他們用氨基酸序列代替以往的RNA，充當(dāng)向?qū)б唤恰?shí)際上，有研究者認(rèn)為，常規(guī)的CRISPR-Cas9 之所以沒法搞定線粒體的DNA，除了Cas9會(huì)被擋在外面，RNA向?qū)Р皇芫€粒體歡迎可能也是原因之一。

還有一個(gè)問題來自于這個(gè)假T堿基。前面我們說過，酶實(shí)際上是把C變成了U；又因?yàn)閁具有與T相同的堿基配對(duì)特性，所以我們才把它當(dāng)成T來看待。本質(zhì)屬于RNA的U在成為DNA鏈的一分子之后，會(huì)遭遇麻煩：尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil-DNA glycosylase）總想把U干掉，再換上C。

鑒于此，研究團(tuán)隊(duì)給TALE-split-DddAtox又加了一層保險(xiǎn)：尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）。不僅保護(hù)U免受干擾，還將胞嘧啶的堿基編輯效率提高了8倍。

有望矯正49%的有害mtDNA突變

綜上，我們得到了一套超凡的線粒體基因編輯裝備，研究團(tuán)隊(duì)稱其為DdCBE。它是這樣工作的：TALE-split-DddAtox跟著一段氨基酸序列，通過線粒體的雙層膜，抵達(dá)mtDNA處。接著，TALE蛋白鎖定并連接mtDNA上的目標(biāo)區(qū)段。與此同時(shí)，兩個(gè)split-DddAtox合二為一成為DddA，開始啟動(dòng)更改堿基的程序。

DdCBE及其正要進(jìn)入的線粒體區(qū)域的示意圖

脫靶效應(yīng)，即非預(yù)期位點(diǎn)的DNA修飾，是CRISPRCas9基因編輯的一個(gè)常見問題。在分析比對(duì)了編輯后的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞后，他們發(fā)現(xiàn)前者的細(xì)胞核中并未出現(xiàn)預(yù)期以外的DNA修飾。

研究團(tuán)隊(duì)在論文里報(bào)告指出，這一套編輯體系有望矯正49%的已知有害mtDNA突變。

當(dāng)然，劉如謙認(rèn)為這項(xiàng)工作距離臨床應(yīng)用還差很遠(yuǎn)。盡管他們現(xiàn)階段的脫靶情況不明顯，但更多針對(duì)不同細(xì)胞類型的嘗試必不可少。

資料來源 Nature