黃婷 方源 馮舟 沈和 聶勇 鄭鑫 汪家權(quán) 許子牧

（1. 合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230009；2. 北京大學(xué)工學(xué)院，北京 100871；3. 北京師范大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)中學(xué)，北京 100032）

生存場(chǎng)所中的各種致病或條件致病微生物的污染給人類的健康帶來威脅［1］。在諸多環(huán)境中，校園是一個(gè)包含有多種場(chǎng)所的特殊環(huán)境，是青少年接受課堂教育的主要場(chǎng)所，也是微生物傳播和交流活躍的地方。所以，研究校園環(huán)境微生物的組成與功能、有助于了解青少年時(shí)期人體微生物組的發(fā)育規(guī)律，對(duì)青少年健康發(fā)育和流行疾病的防治具有重要意義。當(dāng)前，校園環(huán)境微生物組學(xué)研究是全世界范圍的熱點(diǎn)之一，人們分別利用培養(yǎng)和免培養(yǎng)的方法對(duì)校園建筑物內(nèi)的空氣等方面進(jìn)行研究。在我國，已報(bào)道的對(duì)校園環(huán)境微生物的研究主要集中于室內(nèi)空氣、教室教學(xué)設(shè)施、公用電腦等方面［2-5］。鄧怡卿等［6］利用培養(yǎng)的方法，對(duì)上海師范大學(xué)教室內(nèi)的課桌、手把和話筒上的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示課桌和話筒的細(xì)菌菌落較多，但未發(fā)現(xiàn)致病菌。陳宏偉［7］對(duì)校園內(nèi)圖書館自習(xí)廳、學(xué)生教室、食堂、男女寢室等場(chǎng)所的樣品進(jìn)行微生物培養(yǎng)，結(jié)果顯示各場(chǎng)所空氣微生物污染數(shù)量隨人員的密度活動(dòng)量的增大而增大。然而，傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方費(fèi)力且費(fèi)時(shí)，可靠性也很差［8］。近年來，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，可獲得龐大的數(shù)據(jù)信息，通過現(xiàn)代生物信息學(xué)手段，獲得微生物總體群落組成情況，具有高通量、價(jià)格低、運(yùn)行周期短的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究［9-11］?？傊?，目前有限的校園環(huán)境研究，主要集中在以下幾個(gè)方面：（1）大學(xué)校園多有研究，中小學(xué)校園中的研究還很缺乏；（2）對(duì)不同場(chǎng)所空氣中微生物組成有研究，缺乏對(duì)建筑物場(chǎng)所表面微生物的研究。由于很多物質(zhì)可能在表面的富集，表面上微生物的組成與空氣中可能存在顯著的差異；（3）利用可培養(yǎng)方法，對(duì)校園環(huán)境微生物組的認(rèn)識(shí)不夠深入。

為此，本研究以一所中學(xué)校園作為研究對(duì)象，收集校園內(nèi)不同建筑物場(chǎng)所中樓梯扶手和門把手表面的微生物樣品，通過高通量測(cè)序技術(shù)獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息，初步探究了校園建筑物的細(xì)菌群落組成和分布特征。

1 材料與方法

1.1 材料

采 樣 緩 沖 液：0.15 mol/L NaCl，0.01%（V/V）Tween20（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司），于121oC，20 min高壓蒸汽滅菌，100 μL/管；一次性無菌采樣植絨拭子（貨號(hào)：5U018S.CN，COPAN公司）；DNeasy Power Soil Kit（DNA提取試劑盒，貨號(hào)12888-100，QIAGEN公司）；E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒（OMEGA 公司）；樣品細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)高通量測(cè)序由廣東美格基因科技有限公司商業(yè)完成。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采樣地點(diǎn)為北京市海淀區(qū)某中學(xué)校園內(nèi)4個(gè)教學(xué)樓，2個(gè)實(shí)驗(yàn)樓，2個(gè)體育館和4個(gè)食堂的門把手、扶梯等。本研究共取得12個(gè)樣品。取樣時(shí)將一次性無菌采樣植絨拭子小心地從試管中旋出，用采樣緩沖液將拭子潤濕后，按一定方向旋轉(zhuǎn)拭子擦拭采集物表面，平均采樣面積50 cm2，擦拭時(shí)間2 min。采集完畢后將拭子放回試管于-20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取與16S rRNA基因V4區(qū)高通量測(cè)序 將采樣后的拭子放入含有緩沖溶液的離心管中攪拌30 s，然后將采集到的樣品重懸至緩沖液中，然后利用QIAGEN的DNeasy Power Soil Kit試劑盒說明書的步驟提取樣品中微生物總DNA。

利用不同的barcode標(biāo)記的上游引物515F（5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 下 游 引 物806R（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Premix Taq 酶25 μL，10 mmol/L上游和下游引物各1 μL，20 ng/μL DNA模板3 μL，補(bǔ)ddH2O至 50 μL。PCR反應(yīng)程序參數(shù)為：94℃ 5 min；94℃30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，31個(gè) 循 環(huán)；72℃ 10 min；4℃ Hold。PCR完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。利用GeneTools Analysis Software（Version4.03.05.0，SynGene）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃度對(duì)比后，按照等質(zhì)量原則計(jì)算各樣品所需體積，將各PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合；使用凝膠回收試劑盒回收PCR混合產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。然后，樣品送至廣東美格基因科技有限公司，由其完成文庫構(gòu)建及Illumina HiSeq高通量測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 將測(cè)序原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入QIIME2［12］軟件，利用軟件中DADA2質(zhì)量控制方法進(jìn)行去噪，生成序列變體（Sequence variant，SV），選取代表性序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)從而獲得物種注釋信息?；谖锓N注釋信息，去除注釋為葉綠體、線粒體以及不能注釋為細(xì)菌的序列變體（SV）及其包含的序列?；?SV的分析結(jié)果，進(jìn)行樣品微生物α多樣性和β多樣性分析，香農(nóng)指數(shù)（Shannon）表示群落的多樣性，其指數(shù)數(shù)值越大說明樣本的多樣性就越高。基于Unweighted-Unifrac距離和Weighted-Unifrac距離得到矩陣，運(yùn)用R軟件進(jìn)行PCoA（主坐標(biāo)分析，Principal co-ordinates analysis）分析，并結(jié)合置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）去觀察組間的差異性，其本質(zhì)是基于F統(tǒng)計(jì)的方差分析，依據(jù)距離矩陣對(duì)總方差進(jìn)行分解的非參數(shù)多元方差分析方法。一般以P＜0.05 為顯著，P＜ 0.01 為非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控與物種注釋

將高通量測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、過濾、分析后，19個(gè)樣品獲得了108萬條有效序列，序列長度介于231 bp - 397 bp 之間，平均約為 253 bp。具體到樣品，每個(gè)樣品獲得有效序列數(shù)為62 969-125 941條，大部分樣品為70 000至100 000條，平均單個(gè)樣品的序列數(shù)為89 724條在 100% 的序列相似性水平下，對(duì)樣本進(jìn)行聚類和注釋，共得到3 036個(gè)SVs，歸屬于20個(gè)菌門，466個(gè)菌屬。

2.2 不同場(chǎng)所微生物群落多樣性分析

根據(jù)物種預(yù)測(cè)信息，分析表明：體育館的物種豐富度最高（可觀測(cè)SV數(shù)為414），其次是實(shí)驗(yàn)樓（可觀測(cè)SV為255）和教學(xué)樓（可觀測(cè)SV為223），最后是食堂（可觀測(cè)SV為201）（圖1-B）。與此類似的是，體育館的Shannon指數(shù)也最高，其次是實(shí)驗(yàn)樓和教學(xué)樓，而食堂的Shannon指數(shù)也最低（圖1-A）。為什么體育館的物種豐富度最高而食堂的最低？究其原因，有如下幾種可能：（1）該學(xué)校只有一個(gè)體育館，到體育館上課的學(xué)生數(shù)量大于其他10個(gè)樣品對(duì)應(yīng)學(xué)生數(shù)量；（2）在體育館里的活動(dòng)中，人體運(yùn)動(dòng)代謝產(chǎn)生產(chǎn)生更多的汗液、皮脂等等，為微生物生長和繁殖提供了營養(yǎng)物質(zhì)條件。至于食堂中微生物相對(duì)豐度和多樣性指數(shù)較低的原因，可能要?dú)w功于食堂中經(jīng)常進(jìn)行消毒滅菌。

圖1 不同場(chǎng)所樣品的物種豐富度（SV）和α多樣性分析-Shannon指數(shù)

依據(jù)上述SV的計(jì)算和預(yù)測(cè)，計(jì)算所有樣本基 于SV的Unweighted-Unifrac距 離 和Weighted-Unifrac距離，進(jìn)行主坐標(biāo)（PCoA）分析，以圖了解樣品微生物群落的聚類情況和群落結(jié)構(gòu)相似性。Weighted-Unifrac和Unweighted-Unifrac分析的區(qū)別在于Unweighted-Unifrac不考慮物種豐度。在PCoA圖中，如果樣本距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。結(jié)果顯示，各樣品按照?qǐng)鏊猛镜牟煌诘谝?、二坐?biāo)上有明顯區(qū)分。從Weighted-Unifrac分析（圖2-A）和Unweighted-Unifrac分析（圖2-B）結(jié)果，可以看出：來自于不同場(chǎng)所的樣品微生物群落大體按照?qǐng)鏊δ芏垲?，例如食堂、?shí)驗(yàn)樓、體育館、教室樓樣品中微生物群落基本各自聚在一起。進(jìn)一步利用PERMANOVA相似性分析，結(jié)果表明教學(xué)區(qū)域與食堂之間存在顯著差異，其中Weighted-Unifrac距離下P= 0.017，Unweighted-Unifrac距離下P= 0.006。

圖2 用Unweighted-Unifrac距離和Weighted-Unifrac距離計(jì)算的PCoA圖

2.3 不同場(chǎng)所微生物群落組成特征與變化

各樣品基于門水平的細(xì)菌組成分布見圖3-A。所有樣品共檢測(cè)到20個(gè)門，其中變形菌門（Proteobacteria，豐度范圍19.73%-90.40%），厚壁菌門（Firmicutes，豐度范圍1.67%-56.19%）和放線菌門（Actinobacteria，豐度范圍0.83%-16.88%）的相對(duì)豐度較高。各場(chǎng)所之間的物種組成相似，但微生物豐度有較大差異。其中變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）存在于所有建筑物場(chǎng)所，尤其是變形菌門（Proteobacteria）的物種豐富度占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在食堂3和食堂4中發(fā)現(xiàn)厚壁菌門（Firmicutes）的豐度顯著高于其他場(chǎng)所樣品。說明在校園各建筑物場(chǎng)所之間，由于人員流動(dòng)，這些優(yōu)勢(shì)物種在接觸過程中進(jìn)行了交流。

在 屬 水 平 上（圖3-B），一 共 檢 測(cè) 到466個(gè) SV，相對(duì)豐度較高的SV主要屬于棲水菌屬（Enhydrobacter，豐度范圍0.49%-56.26%），鏈球菌屬（Streptococcus，豐度范圍0.36%-17.63%），葡萄球菌（Staphylococcus，豐度范圍0.53%-11.26%）等。相較于門水平上微生物群落差異不顯著，各樣品在屬水平的物種分布呈現(xiàn)出較大的個(gè)體差異，如教學(xué)樓相對(duì)豐度前5的菌屬有異球藻科（Xenococcaceae），鏈球菌屬（Streptococcus），棲水菌屬（Enhydrobacter），葡萄球菌（Staphylococcus），甲基桿菌屬（Methylobacterium）。實(shí)驗(yàn)樓相對(duì)豐度前5的菌屬有棲水菌屬，葡萄球菌，馬賽菌屬（Massilia），副球菌屬（Paracoccus），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）。體育館相對(duì)豐度前5的菌屬有異球藻科，馬賽菌屬，微紅微菌屬（Rubellimicrobium），小雙孢菌屬（Microbispora），副球菌屬（Paracoccus）。食堂相對(duì)豐度前5的菌屬有棲水菌屬，氣球菌屬（Aerococcus），鏈球菌屬，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），葡萄球菌。在各場(chǎng)所相對(duì)豐度前5的菌屬中發(fā)現(xiàn)教學(xué)樓獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬有甲基桿菌屬，實(shí)驗(yàn)樓獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)菌屬有棒狀桿菌屬，體育館的優(yōu)勢(shì)菌屬有微紅微菌屬和小雙孢菌屬，食堂的優(yōu)勢(shì)菌屬棲水菌屬，氣球菌屬。Venn 圖分析結(jié)果表明，在屬水平下，4種用途的建筑物中有 94個(gè)共有菌屬，教學(xué)樓、實(shí)驗(yàn)室、體育館和食堂各自獨(dú)有的菌屬分別為 47 個(gè)、28個(gè)、88 個(gè)和 43 個(gè)（圖4-A）?？梢钥闯鲶w育館扶手表面的微生物物種多樣性顯著高于其他3個(gè)場(chǎng)所設(shè)施表面微生物。各場(chǎng)所內(nèi)部樣品的Venn 圖反映了建筑物內(nèi)部的相似菌屬與各自獨(dú)有的菌屬（圖4-B-E）。

圖3 各樣品基于門與屬水平的細(xì)菌組成

雖然在不同組別樣品中都發(fā)現(xiàn)棲水菌屬，但在小食堂中其豐度顯著高于其他組的樣品。并發(fā)現(xiàn)大食堂樣品中氣球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，而在其他場(chǎng)所中并未發(fā)現(xiàn)有此情況。推測(cè)這與大食堂供應(yīng)的菜品有關(guān)，蔬菜肉類等會(huì)攜帶某些菌群，在接觸過程中導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生交流，從而在大食堂內(nèi)占據(jù)較高豐度。

圖4 各建筑物場(chǎng)所屬水平下Venn圖

3 討論

本研究采用高通量測(cè)序的方法研究了校園內(nèi)不同場(chǎng)所中微生物群落的組成特征。發(fā)現(xiàn)校園細(xì)菌群落的分布具有按場(chǎng)所用途進(jìn)行區(qū)分的特征。體育館的物種豐富度顯著高于其他場(chǎng)所，而食堂的Shannon指數(shù)顯著低于其他場(chǎng)所。體育館是青少年運(yùn)動(dòng)的場(chǎng)所，運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的汗液和豐富的皮脂給微生物提供了生長發(fā)育的有利條件。食堂作為飲食場(chǎng)所，消毒和衛(wèi)生應(yīng)是各場(chǎng)所之間最為嚴(yán)格的，這也是導(dǎo)致其微生物的多樣性較低的原因。其次，教學(xué)活動(dòng)頻繁的區(qū)域越有可能更容易發(fā)生物種的交流，集體教學(xué)活動(dòng)可能是影響校園建筑物微生物群落特征的主要原因。密集的人員活動(dòng)會(huì)增加微生物的傳播幾率，從而提高公共區(qū)域微生物的多樣性與穩(wěn)定性。

物種群落組成結(jié)果表明，在門水平上，變形菌門，厚壁菌門和放線菌門構(gòu)成樣品微生物群落的主要微生物，這些微生物在其他場(chǎng)所環(huán)境中也廣泛分布，是不同場(chǎng)所設(shè)施表面主要的微生物組成［13］。不同功能區(qū)微生物群落特征和豐度分布有顯著差異，最為優(yōu)勢(shì)的變形菌門相對(duì)豐度為食堂＞實(shí)驗(yàn)室＞教學(xué)樓＞體育館。在屬水平上，棲水菌屬，鏈球菌屬，葡萄球菌構(gòu)成樣品微生物群落的主要微生物［14］。有報(bào)道指出在前臂、手等部位這些微生物種類相對(duì)豐富［15-16］，說明這些物種通過人手部的接觸在各場(chǎng)所設(shè)施表面之間進(jìn)行了交流，導(dǎo)致在各場(chǎng)所之間廣泛分布。葡萄菌屬是報(bào)道中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬［17］，且葡萄球菌屬的部分菌株是引起人類化膿性感染的常見病原菌［18］。甲基桿菌屬（Methylobacterium）分離于土壤、塵土、淡水、湖泥、葉表等環(huán)境［19］。此類菌屬在初一1-2層扶梯出現(xiàn)較多，可能是學(xué)生在室外活動(dòng)回教室的過程中沒有洗手，在上樓過程中與樓梯扶手產(chǎn)生接觸使該菌屬產(chǎn)生交換。棒狀桿菌屬（Corynebacterium）寄生于人鼻腔、咽喉、眼結(jié)膜和皮膚等處，當(dāng)人體抵抗力下降時(shí)，可引起化膿性感染、肺炎等疾?。?0］。在空氣細(xì)菌樣品中發(fā)現(xiàn)甲基桿菌屬，馬賽菌屬（Massilia），副球菌屬（Paracoccus），微紅微菌屬（Rubellimicrobium）為優(yōu)勢(shì)菌屬［21］，這類菌屬在體育館樣品中相對(duì)豐度較高，由于體育館是相對(duì)封閉的空間，這類細(xì)菌在進(jìn)入空氣后由于環(huán)境適宜，學(xué)生活動(dòng)又產(chǎn)生汗液等營養(yǎng)物質(zhì)給這類菌提供了良好的生存環(huán)境。小食堂出現(xiàn)最多的棲水菌屬是人體皮膚中的優(yōu)勢(shì)菌屬［22］，且在魚類等水產(chǎn)中分布較廣［23］，可能由于小食堂供給魚類等水產(chǎn)食物時(shí)，廚師直接與食物接觸后又觸碰其他物品，通過人員流動(dòng)，手觸碰餐具、桌椅、把手等公共物品時(shí)，手部微生物與物體表面微生物進(jìn)行交流，導(dǎo)致小食堂內(nèi)該菌屬微生物豐度最高。在大食堂發(fā)現(xiàn)的氣球菌屬，該菌廣泛分布于空氣、腌肉的鹽水及蔬菜等上［24］，而食堂正是蔬菜肉類等食物的供應(yīng)場(chǎng)所。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）廣泛分布于自然界和人體的皮膚表面［25-26］，?？梢鸱窝啄X膜炎、菌血癥等各種難治性感染［27］。因此，在學(xué)校的日常教學(xué)活動(dòng)和飲食生活中，學(xué)校要加強(qiáng)對(duì)校園公共區(qū)域衛(wèi)生的管理，對(duì)學(xué)生做好衛(wèi)生教育和知識(shí)普及，養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣，從而降低流行性疾病的傳播幾率。

4 結(jié)論

本研究主要研究中學(xué)校園不同場(chǎng)所的微生物群落構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)微生物群落構(gòu)成與場(chǎng)所功能相關(guān)。本研究僅在不同場(chǎng)所設(shè)施表面進(jìn)行了采樣，分析其群落結(jié)構(gòu)和多樣性，但對(duì)于不同時(shí)間段各點(diǎn)的微生物群落特征并未做進(jìn)一步研究，下一步有待完善不同時(shí)間點(diǎn)各場(chǎng)所微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，進(jìn)而為校園衛(wèi)生安全提供更有利的依據(jù)。