王曉莉 張文文 吳慶 曹云娥

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

隨著人們生活水平提高，餐飲行業(yè)飛快發(fā)展，餐廚廢棄物的產(chǎn)生量在持續(xù)上升。據(jù)相關(guān)調(diào)查美國目前每年約產(chǎn)生6.1×107t餐廚廢棄物，歐盟每年約產(chǎn)生9.8×107t餐廚廢棄物［1］，僅2017年，我國餐廚廢棄物產(chǎn)生量約在9.9×107t［2］。處理餐廚廢棄物迫在眉睫。就目前來看，堆肥法處理餐廚廢棄物是一種實現(xiàn)餐廚廢棄物減量化、資源化和無害化的較為有效的方法［3-5］。但是，餐廚廢棄物堆肥過程中產(chǎn)生的惡臭污染物種類一直較為復(fù)雜，惡臭強(qiáng)度相對較高，惡臭物質(zhì)種類主要包括硫化氫、氨、乙醇、甲硫醇、二甲二硫醚、甲硫醚、乙硫醚、乙酸乙酯、乙醛、丁醛和檸檬烯等［6］。惡臭物質(zhì)在造成環(huán)境污染的同時，也威脅人們的身體健康。目前針對畜禽糞除臭菌的篩選研究報道較多［7］，許啟有等［8］在大慶地區(qū)豬場采集豬糞樣本，篩選出兩株除臭菌，即X-3為短狀桿菌屬和X-5為副球菌屬，H2S去除率分別為6.8%和54.5%；韓保安等［9］在新鮮豬糞和堆肥豬糞中篩選出3株除臭菌，對NH3具有較高的降解作用；簡保全等［10］在豬糞中篩選出41株可以直接利用NH3的菌株餐，對41株菌株復(fù)篩得到一株松鼠葡萄球菌，其H2S去除率達(dá)到85.7%；安然等［11］以蠟狀芽孢桿菌、放線菌和酵母菌等有益微生物為除臭菌劑，對家禽糞中的氨氣、硫化氫和甲基吲哚等有害毒氣體具有明顯的去除作用。廚廢棄物除臭菌的篩選報道較少，餐廚廢棄物處理過程中主要的除臭方法有廢氣收集、噴淋洗滌、局部噴灑除臭液和吸附措施［12］，張景輝等［13］利用活性炭材料對餐廚廢棄物處理尾氣進(jìn)行吸附，除臭率可以達(dá)到99%；Chen等［14］開發(fā)了一種新型兩級化學(xué)洗滌法去除餐廚垃圾堆肥過程中產(chǎn)生的臭氣，洗滌塔中酸性洗滌其中的液體為低氯酸鈉，堿性洗滌器中氫氧化鈉或者亞硫酸氫鈉。物理和化學(xué)除臭方法與微生物除臭法相比具有耗資大，操作復(fù)雜等特點。因此，本實驗從寧夏園林場餐廚廢棄物堆肥中分離篩選除臭微生物。以期用于餐廚廢棄物堆肥，減少餐廚廢棄物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的惡臭氣體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株篩選來源 寧夏回族自治區(qū)園林場堆肥，分別為餐廚廢棄物+木屑（Kitchen waste + wood chips，KW），餐廚廢棄物+秸稈+木屑（Kitchen waste + straw + wood chips，KSW），以下簡稱為KW堆肥和KSW堆肥。KW堆肥pH為8.07，可溶性鹽濃度Electrical conductivity，EC）為3.64 ms/cm，全氮為8.22 g/kg，全磷為1.8 g/kg、全鉀為26.83 g/kg，有機(jī)質(zhì)為73.65g/kg，速氮為16.61 mg/kg，速磷為59.98 mg/kg，速鉀為334.62 mg/kg。KSW堆肥pH為8.14，EC為4.09 ms/cm，全氮為3.56 g/kg，全磷為1.82 g/kg，全鉀為32.16 g/kg，有機(jī)質(zhì)為80.89 g/kg，速氮為7.71 mg/kg，速磷為37.88 mg/kg，速鉀為146.08 mg/kg，兩種堆肥的C/N均為25∶1。

1.1.2 培養(yǎng)基 脫硫菌液體選擇培養(yǎng)基［15］：蛋白胨10 g，牛肉膏2 g，NaCl25 g，Na2S.9H2O 2 g，蒸餾水1 L。脫硫菌固體篩選培養(yǎng)基：脫硫菌液體選擇培養(yǎng)基加瓊脂。菌株保存培養(yǎng)基：LB營養(yǎng)瓊脂。菌株活化培養(yǎng)基：LB肉湯。

1.2 方法

1.2.1 富集 各取10 g KW堆肥和KSW堆肥分別于100 mL三角瓶中，加入90 mL無菌水，震蕩30 min制成菌懸液。將10 mL菌懸液接種于裝有100 mL脫硫菌液體選擇培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃、120 r/min條件下培養(yǎng)30 d。每隔3 d向三角瓶中加入7%的Na2S·9H2O溶液，以淘汰不能利用硫化物的微生物［16］。

1.2.2 菌株的分離純化 取1 mL富集的菌液做梯度稀釋，將10-4、10-5和10-6菌液吸取100 μL分別接種到脫硫菌固體選擇培養(yǎng)基平板上，每個梯度3次重復(fù)，于30℃倒置培養(yǎng)3 d。待菌落長出來，挑取長勢較好的菌落進(jìn)行反復(fù)劃線純化，直至顯微鏡下觀察得到純菌株為止，保存在4℃冰箱里備用。

1.2.3 除臭微生物的篩選

1.2.3.1 菌種的初篩 將純化好的每個菌株接種到LB肉湯培養(yǎng)基中，放在30℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)2 d制成菌懸液，將制好的菌懸液按照20%的接種量接入到裝有50 g餐廚垃圾的500 mL廣口瓶中，同時接種20%的無菌水作為對照，每組處理設(shè)置3個重復(fù)。放在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3、5、8、11、15、18和21 d用感官法初步判定菌株除臭效果，將除臭能力明顯的菌株留下進(jìn)行復(fù)篩試驗。臭味等級按照“0”無臭味、“1”輕微臭味、“2”明顯臭味、“3”較強(qiáng)臭味、“4”強(qiáng)烈臭味、“5”極強(qiáng)臭味劃分［17-18］。

1.2.3.2 菌種的復(fù)篩 將初篩出來除臭效果較好的菌株經(jīng)過液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，制成菌懸液，按照20%的接種量接種到裝有50 g餐廚垃圾的500 mL 廣口瓶中，同時接種20%的無菌水作為對照，每組處理的廣口瓶中放一個盛有20 mL氫氧化鎘-聚乙烯醇磷酸銨吸收液的50 mL小燒杯，廣口瓶用雙層塑料膜密封，每隔3、5、8、11、15、18和21 d用亞甲基藍(lán)分光光度法檢測菌株的除臭效果［19-21］。選出除臭效果好的菌種斜面保存，以待下一步研究。計算公式：

1.2.4 菌種的鑒定

1.2.4.1 菌落的形態(tài)觀察 將篩選的菌株接種到菌株保存培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)文獻(xiàn)［22］觀察平板上單菌落形狀、大小和顏色等特征。挑取菌落置于載玻片上，做革蘭氏染色，芽孢染色和鞭毛染色，在光學(xué)顯微鏡觀察菌體的形態(tài)。

1.2.4.2 生理生化鑒定 對除臭菌株進(jìn)行以下生理生化試驗［23］：甲基紅（MR）試驗、乙酰甲基甲醇（V-P）試驗、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗、纖維素水解試驗和明膠液化試驗。

1.2.4.3 菌株分子鑒定 將除臭菌株送至北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司，使用細(xì)菌16S通用引物（27f/1492r）來擴(kuò)增基因組DNA，將產(chǎn)物測序。將所得測序序列置于NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，得到最佳匹配的物種分類信息。

1.2.5 菌株除臭條件優(yōu)化

1.2.5.1 菌株生長曲線 在100 mL的液體培養(yǎng)基中，分別以10%（體積比）的接種量接入種子液，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床上恒溫培養(yǎng)52 h，分別在4 h、12 h、20 h、28 h、36 h、44 h和52 h測定OD600值，繪制菌株生長曲線圖。

1.2.5.2 菌株除臭條件優(yōu)化 對除臭菌株分別采用不同的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始PH值和接種量3個培養(yǎng)條件，按照脫硫菌株復(fù)篩的方法，檢測菌株對硫化氫氣體的去除率，每組設(shè)置3個重復(fù)，試驗設(shè)計如表 1所示。

表1 除臭條件優(yōu)化

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)計算與處理，采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用LSD法在P＜0.05水平下進(jìn)行單因素顯著性分析，采用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 脫硫菌株的初篩

兩種堆肥經(jīng)過富集、分離、純化總共得到15株菌，根據(jù)不同的來源分別命名為KW1-7；KSW1-8；經(jīng)過初篩，與對照相比有6株菌具有除臭效果，其結(jié)果見表 2。

表2 菌種初篩試驗結(jié)果（接種21 d）

2.2 脫硫菌的復(fù)篩

脫硫菌的復(fù)篩結(jié)果如圖 1所示，在21 d的檢測當(dāng)中硫化氫釋放量一直在增加，在第6天達(dá)到最大值，之后釋放量逐漸下降，18 d和21 d時達(dá)到最小值。如圖 2所示，在整個檢測過程中菌KW1、KSW2、KSW3與CK相比，在中期除臭效果較好，KW1在第 9、12、15和18天硫化氫去除率分別達(dá)到55.4%、68.92%、64.52%和42.82，但是在前期第6天和后期第21天不能除臭，反而會增加硫化氫的釋放。KSW2在第6、9、12、15和18天硫化氫去除率分別達(dá)到55.57%、88.74%、27.02%、8.39%和47.58%，前期第3天、后期第21天會增加硫化氫的釋放。KSW3第9、12、15和18天硫化氫去除率分別達(dá)到83.92%、68.92%、22.59%和14.23%，在前期第3天和第6天，后期第21天會增加硫化氫的釋放，菌KW4在整個測定過程中除了第18天硫化氫去除率有所增加，前期和后期都會增加硫化氫的釋放。整個檢測過程中KW6和KSW8的除臭效果一直比較穩(wěn)定，以KW和KSW8兩株菌為主。在7次測定中KW6和KSW8的硫化氫去除率平均為28.25%和50.08%。因此，以下研究都以CM6和CJM8兩株菌為主。

圖1 各菌株對硫化氫釋放量的影響

圖2 各菌株對硫化氫的去除率的影響

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 如圖 3所示，KW6為奶油狀白色圓點，不透明，培養(yǎng)基上菌落直徑大于1 mm，表面凸起，邊緣完整，革蘭氏染色呈陽性。如圖 4所示，KSW8為白色圓形，半透明菌落，培養(yǎng)基生上直徑約為1 mm，菌落表面凸起有光澤，邊緣完整，半透明，柔軟易碎，革蘭氏染色呈陽性。

圖3 KW6菌落形態(tài)

圖4 KSW8菌落形態(tài)

2.3.2 菌株生理生化鑒定 對菌株KW6和KSW8進(jìn)行生理生化試驗，結(jié)果（表3）顯示，菌株KW6和KSW2革蘭氏染色呈陽性，其均可使淀粉水解。在甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇試驗、氧化酶試驗中兩株菌均呈陰性；而在葡萄糖氧化發(fā)酵試驗中兩株菌均呈陽性。在過氧化氫酶試驗中KW6呈陽性，KSW8呈陰性；在纖維素試驗中KW6不能分解纖維素，KSW8可以分解纖維素；在明膠液化試驗中，KW6可以讓明膠液化，KSW2不能讓明膠液化。

表3 菌株生理生化鑒定

2.3.3 菌株的分子鑒定 將菌株KW6和KSW8的16S rRNA基因序列測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)，KW6與Bacillus aryabhattaistrain相 似 性 高達(dá)99.44%，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）顯示KW6與Bacillus聚為一支，屬于芽孢桿菌屬。KSW8與Rhizobium pusensestrain菌株的基因序列相似性達(dá)到99.02%，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 6）顯示KSW8與Rhizobium聚為一支，屬于根瘤菌屬。

圖5 KW6的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 KSW8的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株除臭條件優(yōu)化

2.4.1 菌株生長曲線 在4 h-44 h，菌株KW6和KSW8處于快速生長期，在44 h-52 h，菌株處于穩(wěn)定生長期（圖7）。

圖7 菌株生長曲線圖

2.4.2 菌株培養(yǎng)溫度 將KW6和KSW8分別接入裝有餐廚廢棄物的燒杯中，放在不同溫度下培養(yǎng)21 d，結(jié)果（圖8）顯示，在20-30℃之間KW6有不同程度的脫硫效果。在30℃時KW6硫化氫去除率最高達(dá)到83.5%，溫度為35℃和40℃時，KW6的硫化氫去除率開始下降，說明高溫條件不適合KW6的生長。在20-35℃之間KSW8有不同程度的脫硫效果，在溫度為35℃時，KSW8的硫化氫去除率最高達(dá)到85.8%，溫度為40℃時，KSW8的硫化氫去除率達(dá)到66.3%之后急劇下降。

2.4.3 菌株培養(yǎng)初始pH值 將菌KW6和KSW8的液體培養(yǎng)基pH值分別設(shè)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，分別接入裝有餐廚廢棄物的燒杯中培養(yǎng)21 d。結(jié)果（圖9）顯示，KW6和KSW8在不同的pH下都具有除臭效果，KW6在pH為7.5的時候硫化氫去除率最高達(dá)到65.3%。在pH為6.5的時候，KSW8的硫化氫去除率最高達(dá)到75.8%，高于6.5或者低于6.5都會抑制菌株對硫化氫氣體的去除作用。另外，KW6在pH為7.5條件下培養(yǎng)18 d后的硫化氫去除率開始下降，到21 d的時候硫化氫去除率為51.5%，KSW8在pH為6.5的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18 d后硫化氫去除率也下降，到21 d的時候硫化氫去除率為70.75%。

圖8 不同培養(yǎng)溫度對菌KW6和KSW8硫化氫去除率的影響

2.4.4 接種量 兩株菌分別按照5%、10%、12%、15%和20%等不同的接種量加到餐廚廢棄物中，在不同接種量下均可以不同程度的脫硫。KW6在接種量為12%的時候脫硫率一直處于較高的水平，在達(dá)到73.8%之后稍有下降，下降至71.5%，KSW8的脫硫率隨著接種量的增加而增加，接種量為20%的處理脫硫率達(dá)到72.4%（圖10）。

圖9 不同初始pH值對菌KW6和KSW8硫化氫去除率的影響

圖10 不同接種量對菌KW6和KSW8硫化氫去除率的影響

3 討論

3.1 芽孢桿菌具有除臭作用

徐明明在蚯蚓糞中篩選出的菌株HS5屬于芽孢桿菌屬，其對H2S的去除率達(dá)到43.08%［15］；石太莉［19］在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗豬場采集豬糞，在其中篩選出的蠟樣芽孢桿菌的H2S去除率為29.3%，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的H2S去除率分別為3.1%和28.1%；余海晨等［24］在垃圾滲濾液中篩選分離出8株有效菌C1-C8，初步鑒定這8株菌均為芽孢桿菌，C1-C8的混合菌群對H2S的去除率達(dá)到82%。本實驗中的KW6屬于芽孢桿菌屬，對于H2S的去除作用較好，這與前人研究結(jié)果一致。據(jù)報道，芽孢桿菌進(jìn)入豬的腸道后可以增強(qiáng)乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量，乳酸菌可以產(chǎn)生乳酸和細(xì)菌素使血液中的毒素和氨減少，使腸道內(nèi)pH值和NH3含量降低［25］。因此釋放到空氣中的氨氣含量也較低［26］。這說明芽孢桿菌有除臭的可能，本試驗在開始之前曾做過篩選除氨菌的預(yù)試驗，并未篩選出除氨菌，可能是堆肥過程中pH逐漸升高，NH3大量損失的原因。

3.2 H2S與根瘤菌屬有一定聯(lián)系

KSW8屬于根瘤菌屬，根瘤菌是豆科植物、牧草、樹種生長最重要的共生伙伴之一，其作用是固定大氣中的氮氣為植物所用，可促進(jìn)植物生長和作物增產(chǎn)［27］。研究表明，H2S氣體分子可以調(diào)節(jié)根瘤菌的固氮作用。閆小武等［28］在研究H2S信號分子在刺槐-根瘤菌共生固氮體系中的作用中發(fā)現(xiàn)，H2S發(fā)揮作用可以通過上調(diào)植物和根瘤菌中共生基因和許多代謝途徑基因的表達(dá)，促進(jìn)根瘤的發(fā)育，提高了根瘤中固氮酶的活性，增強(qiáng)固氮的效率。鄒杭等［29］在研究H2S信號分子在大豆-根瘤菌共生固氮體系中的調(diào)控作用及其機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，外源H2S可以促進(jìn)大豆植株的結(jié)瘤和根瘤菌固氮酶的活性，從而提高大豆植物的氮素積累，內(nèi)源H2S可以作為根瘤中重要的抗氧化劑維持根瘤的固氮活性，同時避免ROS的積累以及氧化損傷的出現(xiàn)。這說明H2S氣體分子與根瘤菌之間存在一定的關(guān)系，但是根瘤菌對H2S的去除機(jī)制尚未明確，還需要進(jìn)一步研究。也可能是新的菌種有除臭能力，據(jù)2016年ICSP根瘤菌和農(nóng)桿菌分類小組委員會會議統(tǒng)計，僅在2014-2016年間，根瘤菌中共有2個新屬83個新種被描述發(fā)表，且新的根瘤菌物種也在不斷被發(fā)現(xiàn)［30-31］。

3.3 惡臭物質(zhì)除臭方法

餐廚廢棄物處理常用的除臭方法有物理方法、化學(xué)方法和生物方法。王婷等［24］和馬梅榮等［25］用生物除臭方法研究表明，用微生物除臭處理具有徹底、無二次污染的優(yōu)良特性，同樣也存在菌株除臭不穩(wěn)定的情況。在初篩中有6株菌具有除臭效果，但是在復(fù)篩過程中只有KW6與KSW8保持穩(wěn)定的除臭效果，其他4株菌除臭效果極不穩(wěn)定，這與前人的研究結(jié)果一致，說明菌株活性受到多種不確定因素的影響，菌株的除臭能力也受到一定的影響。

本次試驗研究結(jié)果表明［9，15，21，32］，適宜的環(huán)境可以不同程度上提高微生物的生長速率，減少硫化氫等惡臭氣體的排放。試驗中兩株脫硫菌KW6和KSW8在培養(yǎng)條件優(yōu)化中硫化氫的去除率均可以達(dá)到60%以上。

4 結(jié)論

從餐廚廢棄物+木屑（KW）和餐廚廢棄物+秸稈+木屑（KSW）兩種堆肥中篩選得到兩株脫硫菌KW6和KSW8，分別使硫化氫釋放量與CK相比平均降低了28.83%和50.08%。

經(jīng)初步鑒定KW6屬于芽孢桿菌屬，KSW8屬于根瘤菌屬。菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化表明KW6在溫度為30℃、pH 7.5、接種量為12%的時候硫化氫去除率最高，分別為83.5%，65.3%和73.8%。KSW8在溫度為35℃、pH6.5、接種量為20%的時候硫化氫去除率最高，分別為85.8%、75.8%和72.4%。優(yōu)化條件表明在18 d以后菌的脫硫效果會有所下降，出現(xiàn)這種情況可能是是因為檢測時間持續(xù)長，菌的活性下降所致，在生產(chǎn)中需要及時添加菌株。