吳宇 王金華 趙筱

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068）

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，廢棄的秸稈給我國帶來了嚴(yán)重的負(fù)面影響，燃燒秸稈的方式不僅造成了能源的浪費，還會對環(huán)境造成極大的污染，如果將廢棄的秸稈制備成水解液，利用釀酒酵母的分解作用，可將其轉(zhuǎn)化為纖維乙醇，作為生物能源使用。

利用釀酒酵母生產(chǎn)纖維乙醇具有很大的優(yōu)勢，當(dāng)釀酒酵母大量繁殖時，可以抑制其他有害微生物的繁殖，并且釀酒酵母在發(fā)酵過程中啟酵快，發(fā)酵充分，最終酒精產(chǎn)量高［1］。由于秸稈水解液中含有許多對酵母菌生長抑制的物質(zhì)，如糠醛、弱酸以及酚類等，其中糠醛的抑制作用很強，它能誘導(dǎo)酵母細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，從而損傷細(xì)胞線粒體和液泡膜［2］。酵母在將糠醛還原成糠醇時，其轉(zhuǎn)化過程會導(dǎo)致輔酶的大量消耗，從而影響胞內(nèi)代謝，并會造成抗氧化蛋白的失活，使得酵母細(xì)胞受到氧化性破壞［3］。

為提高酵母菌對水解液抑制物的耐受性，科研人員利用了自然選育、馴化、誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合和基因工程等技術(shù)。鄒姝姝等［4］通過對耐酸酵母菌的自然選育實驗，挑取了4個能耐受pH 1.50的酒用酵母菌株。張譯之等［5］利用馴化和紫外誘變相結(jié)合的手段處理釀酒酵母，再通過分離篩選，獲得了3株抑制物耐受能力高于出發(fā)菌株的突變菌株。林貝等［6］采用紫外誘變結(jié)合馴化對工業(yè)釀酒酵母進(jìn)行選育，在復(fù)合抑制劑存在下，優(yōu)勢菌株發(fā)酵時間為48 h，乙醇平均產(chǎn)率0.19 g/（L·h），相比原始菌株，優(yōu)勢菌株發(fā)酵時間縮短65.22%，乙醇平均產(chǎn)率提高2.17倍。方佩佩等［7］采用大氣壓等離子體技術(shù)對釀酒酵母進(jìn)行誘變，獲得了一株發(fā)酵液酒精含量達(dá)18.24%的菌株，其產(chǎn)酒精能力提高了27.51%。吳帥等［8］用釀酒酵母AY-15，M1進(jìn)行雜交育種試驗，得到了一株在高滲環(huán)境中仍然保持較高產(chǎn)酒精能力的釀酒酵母，其在含鹽5%的培養(yǎng)基中，產(chǎn)酒精能力分別比AY-15，M1提高了19.6%和15.4%。茍敏等［9］利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育耐酸絮凝性釀酒酵母，通過對融合子的篩選獲得了一株乙醇收率比親本菌株高9.8%的菌株。Wan等［10］在培養(yǎng)基中加入硫酸鋅后，酵母的乙酸耐受能力得到提升，并測得胞內(nèi)丙氨酸含量是對照培養(yǎng)物含量的3.51倍，隨后在培養(yǎng)基中添加0.5 g/L的丙氨酸，發(fā)現(xiàn)在乙酸存在的條件下糖耗速率加快，ROS積累減少，說明丙氨酸可作為ROS清除劑。利用基因工程的技術(shù)能夠定向改造酵母，通過改變胞內(nèi)的能量代謝、丙氨酸代謝、谷氨酸代謝、甘油代謝、脯氨酸代謝、肌醇代謝以及改變胞內(nèi)谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)來提高菌體對抑制物的耐受能力。何艷艷等［11］在釀酒酵母中過表達(dá)了LCB4基因，其編碼的長鏈鞘氨醇激酶使發(fā)酵液中的甘油、海藻糖以及琥珀酸的含量提高，這些物質(zhì)有利于增強菌株的抑制物耐受性，在3 g/L糠醛的發(fā)酵過程中，重組菌株的乙醇發(fā)酵產(chǎn)率達(dá)到了0.76 g/（L·h），且比對照菌株提高了85.4%，發(fā)酵時間縮短了30 h。相瑞娟［12］先通過基因工程改造等手段實現(xiàn)膜轉(zhuǎn)運蛋白基因MDR1和ADP1的過表達(dá)來構(gòu)建抗性提高的釀酒酵母，再通過定向馴化來篩選具有良好抑制物抗性的酵母菌株。張克俞等［13］過表達(dá)了IMP環(huán)水解酶基因ADE17，使得酵母的最大乙醇生產(chǎn)強度達(dá)到了0.669 g/（L·h），較對照菌株提高了42.6%，發(fā)酵周期也縮短了23 h。Chen等［14］通過轉(zhuǎn)錄組分析方法發(fā)現(xiàn)多個基因在糠醛存在條件下表達(dá)上調(diào)，選擇基因ACE2和SFP1進(jìn)行過表達(dá)，使得過表達(dá)菌株在糠醛脅迫條件下的乙醇生產(chǎn)強度提高了4倍。Kim［15］過表達(dá)了谷胱甘肽合成路徑的基因GSH1和GLR1，加強了細(xì)胞對糠醛的耐受能力。陳洪奇［16］研究了在10 g/L乙酸脅迫條件下，GLN1基因的表達(dá)水平和蛋白水平在添加硫酸鋅后均上調(diào)，說明GLN1基因在提高酵母菌的抗逆性中起到了一定的作用。GLN1是編碼谷氨酰胺合成酶的基因，能促進(jìn)谷氨酰胺的合成。對于谷氨酰胺合成代謝途徑是否能提高酵母糠醛耐受性的問題，目前還鮮有報導(dǎo)。

為克服糠醛對纖維乙醇生產(chǎn)的影響，我們擬將基因GLN1插入載體pESC-URA中，再導(dǎo)入釀酒酵母BY4741，促進(jìn)胞內(nèi)谷氨酰胺的合成，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽，使得胞內(nèi)谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的水平得到提升，進(jìn)而降低ROS的含量，使酵母細(xì)胞的抗糠醛脅迫能力得到增強，從而使產(chǎn)乙醇的效率得到提升。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 出發(fā)菌株為酵母菌BY4741，由本實驗室保存；質(zhì)粒pUC19，由本實驗室保存；質(zhì)粒pESC-URA，由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 氨芐青霉素購自Mersco公司；PCR 引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司合 成；DL5000 DNA Marker、Yeast RNAiso Kit購 自寶生物工程（大連）有限公司；變性鮭魚精DNA購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；酵母SC-URA培養(yǎng)基購自上海百風(fēng)生物科技有限公司；2×Accurate Taq預(yù)混液（含染料）、DNA Ligation Kit購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；T5核酸外切酶購自新海基因檢測有限公司；谷氨酰胺合成酶（GS）活性檢測試劑盒檢測購自北京索萊寶科技有限公司；NAD+/NADH檢測試劑盒購自碧云天公司。

SBA-40D型生物傳感分析儀（濟(jì)南研科實驗儀器有限公司），Waters e 2695型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），mycycler PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、酵母SC-URA固體培養(yǎng)基；選擇培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基加抗生素（50 mg/L氨芐青霉素）；糠醛耐受培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、糠醛1.55 g/L；模擬水解液培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖47.8 g/L、糠醛1.1g/L。

1.2 方法

1.2.1 酵母工程菌的構(gòu)建及驗證

1.2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 根據(jù)GLN1基因序列設(shè)計擴增引物P1和P2，如表1所示，該對引物下劃線序列與GLN1基因序列同源，兩邊各有20 bp與質(zhì)粒pUC19序列同源的同源臂，將目的基因GLN1與經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后的pUC19質(zhì)粒按照摩爾比為2∶1的比例混合，再向離心管中加入T5核酸外切酶，30℃反應(yīng)40 min，于冰上停止反應(yīng)，待100 μL感受態(tài)細(xì)胞解凍后，向其加入5 μL反應(yīng)液，混勻后置于冰上30 min，然后42℃熱沖擊60 s，隨后放置冰上2 min，加入900 μL的LB液體培養(yǎng)基，于37℃，250 r/min的搖床中培養(yǎng)1h，培養(yǎng)結(jié)束后取100 μL菌液涂布于氨芐抗性平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)12-16 h，對平板上長出的菌落用驗證引物P3、P4進(jìn)行驗證，驗證成功后，將質(zhì)粒命名為“pUCGLN1”。然后用T4 DNA連接酶將質(zhì)粒pUC-GLN1與質(zhì)粒pESC-URA進(jìn)行連接，先將兩質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ分別進(jìn)行雙酶切，隨后對酶切體系進(jìn)行切膠回收，按照2∶1的摩爾比加入酶切后的質(zhì)粒pUC-GLN1與酶切后的質(zhì)粒pESCURA，再向離心管中加入T4 DNA連接酶，16℃反應(yīng)30 min，于冰上停止反應(yīng)，待100 μL感受態(tài)細(xì)胞解凍后，向其加入5 μL反應(yīng)液，混勻后置于冰上30 min，然后42℃熱沖擊60 s，隨后放置冰上2 min，加入900 μL的LB液體培養(yǎng)基，于37℃，250 r/min的搖床中培養(yǎng)1 h，培養(yǎng)結(jié)束后取100 μL菌液涂布于氨芐抗性平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)12-16 h，對平板上長出的菌落用驗證引物P5、P6進(jìn)行驗證，驗證成功后，將質(zhì)粒命名為“pESC-GLN1”。

表1 實驗所需的引物

重組質(zhì)粒pESC-GLN1構(gòu)建成功后，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法［17］將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BY4741細(xì)胞中，將酵母BY4741培養(yǎng)在50 mL液體培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min振蕩過夜，用顯微鏡計數(shù)算出酵母的密度，然后接種酵母于50 mL液體培養(yǎng)基中，使得酵母密度為5×106個/mL。將搖瓶置于30℃、200 r/min培養(yǎng)3-5 h，當(dāng)酵母密度為2×107個/mL時，將菌液倒入50 mL無菌離心管，于2 500 r/min、4℃離心5 min，棄上清，加入25 mL預(yù)冷無菌水，重懸菌柄，重復(fù)上述離心操作后棄上清，加入1 mL預(yù)冷的濃度為100 mmol/L的LiAc，重懸后轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管，于10 000 r/min、4℃離心5 min，用移液器吸盡LiAc，再加入0.4 mL濃度為100 mmol/L的LiAc重懸，隨后取50 μL的細(xì)胞懸浮液于1.5 mL干凈離心管，于10 000 r/min、4℃離心5 min，再用移液器吸盡LiAc，按順序依次向離心管中加入50%PEG3350 240 μL、1 mol/L LiAc 36 μL、2 g/L變性鮭魚精DNA 25 μL、預(yù)冷無菌水50 μL以及重組質(zhì)粒10 μg，充分混合后，置于30℃水浴鍋中保溫30 min，然后在42℃水浴鍋中進(jìn)行熱休克20 min，隨后6 000 r/min、4℃離心30 s。用移液器吸除轉(zhuǎn)化混合液，將沉淀重新懸浮于0.4 mL無菌純水中，輕輕吹吸混勻，取200 μL菌液涂布于SC-URA固體培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)12-16 h，若在SC-URA固體培養(yǎng)基上長出菌落，則表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化，將重組菌株命名為YEA9。挑取YEA9菌株在SC-URA固體培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)8代以上，再保存至甘油管。

1.2.1.2GLN1基因轉(zhuǎn)錄水平差異分析 將YEA9菌株接入含20 g/L半乳糖的SC-URA液體搖瓶中，收集發(fā)酵24 h 的細(xì)胞，利用Yeast RNAiso Kit提取總RNA，然后利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再以cDNA為模板，用SYBR?Premix Ex TaqTMII配置實時定量PCR反應(yīng)體系，利用定量PCR儀進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。選擇β-actin作為參比基因，以β-actin轉(zhuǎn)錄水平為1計算GLN1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。用于β-actin基因定量的引物為P7和P8，用于GLN1定量的引物為P9和P10。定量PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，46℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。其測量結(jié)果如表2所示。

1.2.1.3 谷氨酰胺合成酶酶活的測定及谷氨酰胺含量的測定 用谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）活性檢測試劑盒對該酶活進(jìn)行檢測，稱取OD600為0.5的酵母細(xì)胞0.1 g，再加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，在8 000 r/min、4℃的條件下離心10 min，取上清進(jìn)行檢測。

谷氨酰胺的含量用高效液相色譜法［18］來測量，色譜柱Bio-Rad HPX-87H離子交換柱，流動相50 mmol/ L磷酸二氫鉀∶乙腈=70∶30，流速0.4 mL/min，柱溫45℃，進(jìn)樣量10 μL，采用215 nm紫外吸收檢測器。

1.2.2 菌株耐受性能及發(fā)酵的測定

1.2.2.1 原始菌株耐受性能的測定 先對酵母菌BY4741的糠醛耐受性進(jìn)行探索，將酵母菌BY4741接入50 mL的YPD液體搖瓶中，待OD600長到0.5時，以1%的接種量分別轉(zhuǎn)接于150 mL含有0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/L的糠醛培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每6 h取樣測量OD600，繪制生長曲線，以確定能抑制原始菌株BY4741生長的糠醛濃度。

1.2.2.2 重組菌株生長及耐受性能的測定 根據(jù)1.2.2.1中所確定的糠醛濃度，對重組酵母YEA9進(jìn)行耐受性能評估，將菌株YEA9和菌株BY4741分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，再將兩瓶的OD600均調(diào)到0.5，從兩瓶中分別取1.5 mL置于含糠醛的150 mL液體培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每12 h取樣測量OD600、葡萄糖含量和乙醇含量，繪制細(xì)胞的生長曲線、糖耗曲線以及乙醇生產(chǎn)曲線。

1.2.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物檢測分析 谷胱甘肽（GSH）的含量用四氧嘧啶法［19］進(jìn)行測定。取5 mL發(fā)酵48 h后的菌液，于8 000 r/min離心3 min后去掉上清液，加入20 mL無菌水重懸并離心，清洗兩次后再加入5 mL的無菌水，于100℃沸水中加熱5 min，隨后置于冰上3 min。細(xì)胞懸液經(jīng)8 000 r/min離心5 min后，取上清液用于測定胞內(nèi)GSH含量。

使用NADH氧化酶測試盒［20］測定細(xì)胞內(nèi)NADH氧化酶酶活。發(fā)酵48 h后取9 mL發(fā)酵液，于8 000 r/min離心3 min后收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，根據(jù)試劑盒的方法對NADH氧化酶酶活進(jìn)行測定。

用NAD+/NADH檢測試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)的NAD+/NADH水平。取9 mL發(fā)酵48 h后的發(fā)酵液，于8 000 r/min離心3 min，去掉上清后用PBS洗滌2次，超聲破碎細(xì)胞后將懸浮液煮沸5 min，隨后在冰浴中快速冷卻。在離心管中先后加入500 μL的樣品和500 μL 0.2 mol/L NaOH或0.2 mol/L HCl，將混合物于10 000 r/min離心10 min后，收集上清液，測定其NAD+/NADH的含量。

使用探針2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）測定2 g/L糠醛條件下重組菌株和對照菌株細(xì)胞內(nèi)ROS水平［21］。取9 mL發(fā)酵6 h后的發(fā)酵液，將OD600調(diào)為0.25，取4.5 mL發(fā)酵液，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗2遍菌體，然后用500 μL的PBS緩沖液重懸，再加入40 μL H2DCFDA，在黑暗條件下于30℃，200 r/min反應(yīng)1 h。離心收集細(xì)胞，再用PBS洗去多余的熒光染料，用500 μL的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，吸取200 μL于96孔板中，使用全波長掃描儀，在485 nm激發(fā)光和535 nm發(fā)射光下測定其熒光強度，并以熒光強度表示胞內(nèi)ROS的量。

1.2.3 水解液發(fā)酵實驗

1.2.3.1 小麥秸稈水解液制備 小麥秸稈取自武漢江夏區(qū)農(nóng)田，除去小麥葉部后粉碎，過40目分樣篩篩成直徑為0.2-0.45 mm的粉末狀樣品以備用［22］。稱取10 g粉碎后的小麥秸稈置于500 mL三角瓶中，按照質(zhì)量比為1∶10的固液比加入2%的H2SO4于121℃滅菌鍋水解1 h。處理完畢后，經(jīng)NaOH調(diào)節(jié)pH至5.0，按酶用量30 FPU/g加入纖維素酶，在45℃下進(jìn)行酶解，其工藝條件參照相關(guān)文獻(xiàn)［23］。水解液制備完成后，檢測其葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和糠醛含量，用于后續(xù)纖維乙醇發(fā)酵實驗。

1.2.3.2 測量方法 用生物傳感分析儀測量秸稈發(fā)酵液中葡萄糖的含量，用高效液相色譜法測量木糖、阿拉伯糖和糠醛的含量。

木糖和阿拉伯糖［24］：色譜柱為Bio-Rad HPX-87H離子交換柱，流動相4 mmol/LH2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，示差檢測器。

糠醛［25］：色譜柱Bio-Rad HPX-87H離子交換柱，流動相4 mmol/ L H2SO4，流速0.4 mL /min，柱溫45℃，進(jìn)樣量10 μL，采用277 nm紫外吸收檢測器。

1.2.3.3 發(fā)酵實驗 參照1.2.3.1中所測得的小麥秸稈水解液中葡萄糖、五碳糖和糠醛的濃度，人工模擬水解液，比較BY4741和YEA9的發(fā)酵情況，以探究GLN1基因的過表達(dá)對釀酒酵母產(chǎn)纖維乙醇的影響。

2 結(jié)果

2.1 酵母工程菌YEA9的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒的鑒定 用驗證引物P5、P6對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗證，并以空載體質(zhì)粒pESC-URA作為對照，GLN1基因自身長度為1 113 bp。用驗證引物P5、P6經(jīng)進(jìn)行PCR，擴增出的片段應(yīng)為1 264 bp。實驗結(jié)果如圖1所示，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段與預(yù)期片段大小基本相符，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 GLN1基因的RCR擴增電泳圖

2.1.2GLN1基因轉(zhuǎn)錄水平分析及相關(guān)產(chǎn)物的測定 在轉(zhuǎn)錄水平上對菌株進(jìn)行分析，比較菌株BY4741和YEA9在無抑制物條件下的基因轉(zhuǎn)錄水平情況，并對胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶酶活以及谷氨酰胺的含量進(jìn)行測定，每個實驗重復(fù)3次，其測量結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，在無抑制物的條件下，YEA9的GLN1基因相對轉(zhuǎn)錄水平比BY4741提高了1.95倍，谷氨酰胺合成酶的酶活提高了17.1%，谷氨酰胺的濃度提高了22.0%，表明GLN1基因的過表達(dá)，增強了谷氨酰胺合成酶的酶活，提高了谷氨酰胺的濃度。

表2 測量GLN1相對轉(zhuǎn)錄水平、谷氨酰胺合成酶酶活以及谷氨酰胺含量的結(jié)果

2.2 重組菌株糠醛耐受性能評價

2.2.1 對照菌株BY4741的耐受性實驗 為考察糠醛抑制對照菌株BY4741生長的效果，將BY4741置于含有0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/L糠醛的YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，測量并繪制細(xì)胞的生長曲線，每個實驗重復(fù)3次，如圖2所示。

圖2 對照菌株BY4741在不同糠醛濃度下的生長曲線

以上結(jié)果表明，隨著糠醛濃度的不斷提升，菌株BY4741的生長受到抑制，高濃度的糠醛不僅抑制了細(xì)胞的生長，還降低了細(xì)胞在對數(shù)生長期的生長速度。當(dāng)糠醛濃度達(dá)到2 g/L時，菌體的生長完全受到抑制，在54 h后，其OD600僅為0.51。我們將菌株BY4741在不同糠醛濃度下的最高OD600繪成曲線，從而選擇具體的糠醛濃度進(jìn)行后續(xù)的耐受性實驗。

如圖3所示，我們將菌株BY4741的最大OD600和與之對應(yīng)的糠醛濃度進(jìn)行擬合，計算得出糠醛的IC50（半抑制濃度）為0.76 g/L，IC75（75%抑制濃度）為1.55 g/L。為了篩選出耐受性較強的菌株，我們選擇1.55 g/L的糠醛濃度來探索重組酵母菌YEA9的生長情況。

圖3 對照菌株BY4741在不同糠醛濃度下的最高OD值

2.2.2 BY4741和YEA9在1.55 g/L糠醛濃度下的發(fā)酵結(jié)果 為探索重組菌株YEA9對糠醛的耐受效果，將BY4741和YEA9在1.55 g/L糠醛濃度下進(jìn)行葡萄糖單糖發(fā)酵，初始糖濃度為20 g/L，每12 h測量菌體的OD600及搖瓶中乙醇和葡萄糖的含量，每個實驗重復(fù)3次，生長情況的結(jié)果如圖4所示，乙醇生產(chǎn)情況及葡萄糖消耗情況的結(jié)果如圖5所示。

在菌株生長方面，BY4741菌株和YEA9菌株能達(dá)到的最大OD600值分別為0.74和2.74，即在1.55g/L糠醛濃度下，YEA9的生物量較BY4741提高了3.7倍（圖4）。在利用葡萄糖方面，BY4741的平均耗糖率為0.024 g/（L·h），而YEA9的平均耗糖率為0.207 g/（L·h），較BY4741提高了8.6倍；在產(chǎn)乙醇方面，BY4741最終乙醇濃度為0.943 g/L，而YEA9最終乙醇濃度為8.64g/L，較BY4741提高了9.2倍，且BY4741的糖醇轉(zhuǎn)化率為80.2%，YEA9的糖醇轉(zhuǎn)化率為88.7%，較BY4741提高了10.6%；在發(fā)酵周期方面，YEA9在84 h發(fā)酵結(jié)束，而BY4741的葡萄糖并未耗完，殘?zhí)橇繛?8.5%（圖5）。

圖4 BY4741與YEA9在1.55 g/L糠醛濃度下的生長曲線

圖5 BY4741與YEA9在1.55 g/L糠醛濃度下的乙醇生產(chǎn)及糖耗曲線

2.2.3 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的測定

2.2.3.1 谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的檢測 按照1.2.2.3中的測量方法，分別測量BY4741和YEA9中的谷胱甘肽含量、NADH氧化酶酶活以及NAD+/ NADH，每個實驗重復(fù)3次，其測量結(jié)果見表3。由表3可知：YEA9的谷胱甘肽含量較BY4741提高了22.4%，NADH氧化酶酶活提高了5.1%，但是NAD+/NADH的數(shù)值沒有明顯變化，說明GLN1基因的過表達(dá)有助于谷胱甘肽的合成，能增強NADH氧化酶的酶活，不改變胞內(nèi)還原力的平衡。

表3 測量谷胱甘肽含量、NADH氧化酶酶活以及NAD+/NADH的結(jié)果

2.2.3.2 胞內(nèi)活性氧自由基檢測 由于糠醛能誘導(dǎo)酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，為進(jìn)一步探索GLN1基因的過表達(dá)與ROS含量的關(guān)系，對BY4741和YEA9的胞內(nèi)活性氧自由基進(jìn)行檢測，每個實驗重復(fù)3次，檢測結(jié)果如圖6所示。

圖6 BY4741和YEA9的ROS水平測定

通過測量過表達(dá)前后兩菌株的ROS含量，發(fā)現(xiàn)重組酵母YEA9的ROS水平較釀酒酵母BY4741降低了32.26%，計算得P值小于0.01，說明該兩組數(shù)據(jù)是有極顯著差異性的，表明過表達(dá)GLN1基因可以降低胞內(nèi)的ROS水平，從而減少ROS對細(xì)胞的傷害。

2.3 小麥秸稈水解液糖濃度檢測結(jié)果

2.3.1 小麥秸稈水解液含量的測定 對小麥秸稈水解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和糠醛的濃度進(jìn)行檢測，每個實驗重復(fù)3次。

根據(jù)檢測結(jié)果可知，葡萄糖濃度為47.8 g/L，木糖濃度為23.1 g/L，阿拉伯糖濃度為3.0 g/L、糠醛濃度為1.1 g/L，根據(jù)此數(shù)值模擬水解液，將模擬水解液的培養(yǎng)基定為：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖47.8 g/L，糠醛濃度為1.1 g/L。

2.3.2 重組菌株在水解液中的生長情況 為探索重組菌株YEA9在水解液中的耐受情況，將BY4741和YEA9在模擬水解液中進(jìn)行發(fā)酵，每12 h測量菌體的OD600及搖瓶中乙醇和葡萄糖的含量，每個實驗重復(fù)3次，生長情況的結(jié)果如圖7所示，乙醇生產(chǎn)情況及糖耗情況的結(jié)果，如圖8所示。

在菌株生長方面，BY4741菌株和YEA9菌株能達(dá)到的最大OD600值分別為2.04和6.07，即在模擬水解液中，重組菌株YEA9的生物量較BY4741提高了2.98倍（圖7）。在利用葡萄糖方面，BY4741的平均耗糖率為0.13 g/（L·h），而YEA9的平均耗糖率為0.79 g/（L·h），較BY4741提高了6.1倍；在產(chǎn)乙醇方面，BY4741最終乙醇濃度為3.9g/L，而YEA9最終乙醇濃度為20.5 g/L，較BY4741提高了5.3倍，且BY4741的糖醇轉(zhuǎn)化率為84.4%；YEA9的糖醇轉(zhuǎn)化率為84.8%，較BY4741提高了0.5%；在發(fā)酵周期方面，YEA9在60 h發(fā)酵結(jié)束，而BY4741的葡萄糖并未耗完，其殘?zhí)橇繛?1.2%（圖8）。

圖7 BY4741與YEA9在模擬水解液下的生長曲線

3 討論

對比釀酒酵母YEA9和BY4741的發(fā)酵情況，我們可以看出，無論是在1.55 g/L的糠醛培養(yǎng)基中，還是在模擬水解液中，YEA9的生長量、葡萄糖消耗速率、最終乙醇濃度以及糖醇轉(zhuǎn)化率都比BY4741高，表明YEA9有更強的抗糠醛脅迫能力，更有利于纖維乙醇的生產(chǎn)。過表達(dá)GLN1基因后，釀酒酵母中的谷胱甘肽含量有所提高，NADH氧化酶的酶活也得到了增強，表明胞內(nèi)的谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)水平提升了，從而降低了胞內(nèi)ROS的積累，避免了由于糠醛產(chǎn)生的ROS對細(xì)胞線粒體和液泡膜的損害，進(jìn)而提高了釀酒酵母的糠醛耐受性。

圖8 BY4741與YEA9在模擬水解液下的乙醇生產(chǎn)及糖耗曲線

方青［26］在釀酒酵母中過表達(dá)了編碼谷胱甘肽依賴的氧化還原酶基因GRX5，使得谷胱甘肽過氧化物酶的活性提高了158%，且重組菌株在糠醛濃度為0.5 g/L的模擬玉米秸稈水解液中，其糖醇轉(zhuǎn)化率為81%。而在本實驗中，重組菌株YEA9在糠醛濃度為1.1 g/L的模擬小麥秸稈水解液中的糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到了85%，表明YEA9在高濃度糠醛存在的條件下，其糖醇轉(zhuǎn)化率依然很高。Wang等［27］通過過表達(dá)脯氨酸和甾醇代謝途徑的關(guān)鍵基因PRO1和INO1，在0.8 g/L糠醛脅迫的條件下，重組菌株的糖耗速率為0.36 g/（L·h），乙醇產(chǎn)率為0.17 g/（L·h），而本實驗通過過表達(dá)谷氨酰胺合成酶基因GLN1，使得該菌在1.1 g/L糠醛脅迫下，其糖耗速率為0.79 g/（L·h），乙醇產(chǎn)率為0.43 g/（L·h），通過對比可以看出，重組菌株YEA9在生產(chǎn)乙醇方面具有更好的優(yōu)越性。

綜上，重組菌株YEA9可以在較高濃度的糠醛脅迫下產(chǎn)生更多的乙醇，并能降低胞內(nèi)ROS水平，利用基因工程的方法來增強胞內(nèi)的代謝通路，為探索機理提供更多的途徑。然而在纖維乙醇的生產(chǎn)過程中，釀酒酵母在水解液中的生長不僅受到糠醛的抑制，還會受到弱酸及酚類的抑制作用，我們可以通過基因工程的手段對釀酒酵母進(jìn)行進(jìn)一步的改造，從而增加釀酒酵母對多種抑制物的耐受能力。

4 結(jié)論

本研究以原始酵母菌BY4741為出發(fā)菌株，通過過表達(dá)GLN1基因，成功構(gòu)建了重組菌株YEA9，該菌的糠醛耐受性較原始菌株得到了提升，最終乙醇產(chǎn)量也有所提高，并發(fā)現(xiàn)GLN1基因的過表達(dá)能降低胞內(nèi)ROS水平，從而提高胞內(nèi)的抗氧化能力，以此來增強其對糠醛的耐受性。