霍明月 張鴿 蘇玉龍 李興 張海波 崢嶸 劉好寶

（1. 內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022；2. 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266101；3. 云南省煙草公司玉溪市公司元江縣分公司，玉溪 6531005；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；5. 中國煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克？?571100）

乙偶姻，又稱3-羥基丁酮，是一種具有奶油香氣的重要風(fēng)味物質(zhì)和平臺(tái)化合物［1］。1986年，我國衛(wèi)生部在《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-86）中規(guī)定其為允許食用［2］，且在醫(yī)藥及煙草工業(yè)中都具有廣泛的應(yīng)用［3-6］。目前，乙偶姻的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶學(xué)轉(zhuǎn)化法及微生物發(fā)酵法［1］，其中微生物發(fā)酵法以微生物為工具、原料來源豐富、工藝條件溫和、其產(chǎn)物具有綠色安全等優(yōu)點(diǎn)，并且滿足可持續(xù)發(fā)展理念而日益受到矚目。范宜曉等［7］在食品中分離得到一株產(chǎn)乙偶姻的枯草芽孢桿菌，發(fā)酵 96 h 后，乙偶姻產(chǎn)量可達(dá) 33.90 g/L。因此，開發(fā)有較好性能的高產(chǎn)乙偶姻的新菌株具有較高的理論研究價(jià)值和應(yīng)用意義。

在微生物的發(fā)酵中，葡萄糖常用為速效碳源。但是大部分微生物對(duì)糖濃度耐受有限，糖濃度過高會(huì)使菌株受到高糖滲透應(yīng)激的影響，導(dǎo)致菌株生長延滯、發(fā)酵時(shí)間過長，從而影響目的產(chǎn)物產(chǎn)量［8］。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，常采取分批補(bǔ)料的方法來解決該問題，以期提高產(chǎn)量，但因此不僅增強(qiáng)了染菌風(fēng)險(xiǎn)，也增加了工作成本［9-10］。針對(duì)菌株不能耐受高濃度糖這一問題，研究者們通常采用篩選高耐受菌株和利用高糖馴化和菌種誘變選育等方式來提高菌株耐受性。呂春微等［8］通過馴化米根霉菌株從而提高糖耐受性，并且發(fā)現(xiàn)耐高糖菌株細(xì)胞代謝動(dòng)力更大，發(fā)酵性能較優(yōu)。陳英［11］對(duì)野生釀酒酵母菌株進(jìn)行紫外誘變，篩選獲得一株在 40%（W/V）葡萄糖壓力下生長，并且提高了產(chǎn)乙醇能力的突變菌株。綜上，篩選出具有高糖耐受度的菌株對(duì)細(xì)胞的生長，產(chǎn)物的生產(chǎn)效率，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收均產(chǎn)生重要的影響，能簡化發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)工藝，對(duì)提高產(chǎn)物濃度具有重要意義［12］。

本研究利用篩選培養(yǎng)基從煙田土壤中篩選獲得一株全新的耐受高濃度葡萄糖且產(chǎn)乙偶姻的菌株，然后通過全基因組測序技術(shù)和遺傳進(jìn)化 16S rDNA 序列比對(duì)分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，并將該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行 GC-MS（氣相-質(zhì)譜）分析。此外，為確定該菌株對(duì)葡萄糖的耐受度，初步探索了菌株對(duì)不同濃度的葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)。最后，對(duì)該菌株進(jìn)行初步搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析該菌株產(chǎn)乙偶姻的能力，旨為該菌株的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）煙田土壤：取自湖南永州白芒煙草試驗(yàn)站煙田。（2）主要試劑：乙偶姻標(biāo)品（97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），1-萘酚（99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），肌酸（北京索萊寶科技有限公司），氫氧化鈉（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），葡萄糖（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），胰蛋白胨（OXOID），牛肉膏（上海麥克林生化科技有限公司）等。（3）培養(yǎng)基：耐糖微生物篩選培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖400 g/L，瓊脂1.5%，pH 7.0，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。葡萄糖耐受性驗(yàn)證培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖設(shè)置為100、200、300、400、500 g/L不同濃度，pH 7.0，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 微生物篩選 稱取煙田土壤1.0 g，利用5.0 mL無菌水溶解至50 mL無菌離心管中，室溫放置24 h，取1.0 mL上清液置于另一含有9.0 mL無菌水的試管中，混合均勻。利用無菌水進(jìn)行梯度稀釋［13］分別得到100、10-1、10-2、10-3和10-4不同稀釋度的土壤稀釋液。取不同稀釋度的土壤菌液涂布到耐糖微生物篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16 h，平板劃線法純化篩選到的微生物。

對(duì)于耐糖培養(yǎng)基中篩選得到的微生物利用乙偶姻顯色液進(jìn)行篩選，將顯色液（10% NaOH、5%1-萘酚、0.5%肌酸的溶液按照 1∶1∶1 的比例混合）混合熔化的LB固體培養(yǎng)基，倒入長有目標(biāo)菌落且含有高濃度葡萄糖的平板上，靜置30 min后觀察顏色變化［14］，選擇能使顯色液呈現(xiàn)粉色的菌株進(jìn)行保藏鑒定以及發(fā)酵產(chǎn)物鑒定。

1.2.2 篩選微生物的葡萄糖耐受性驗(yàn)證 挑取單菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min活化過夜培養(yǎng)，獲得種子液。將種子液按照5%的接種量接種至含有50 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度設(shè)置為100、200、300、400和500 g/L，每個(gè)葡萄糖濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，37℃ 培養(yǎng)36 h，利用分光光度法測定菌株的OD（Optical delnsity）值。

1.2.3 篩選微生物鑒定及進(jìn)化樹構(gòu)建 16S rDNA分子鑒定：利用16S rDNA通用引物：27F（5'-3'）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R（5'-3'）：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR反應(yīng)體系（表1）。PCR程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性，3 min；95℃ 變性，30 s，56℃退火，30 s，72℃延伸，90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min；4℃，∞。

表1 細(xì)菌鑒定體系表

PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖電泳檢測，片段大小符合理論大小（1 500 bp）的PCR產(chǎn)物送至華大基因公司（http：//www.genomics.cn/index）測序，測序 結(jié) 果通 過BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi）比對(duì)獲得鑒定結(jié)果，并利用MEGA7.0（Kumar，Stecher，Tamura 2015），選擇neighborjoining 方法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap為1 000。

1.2.4 篩選微生物發(fā)酵產(chǎn)物檢測 將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液以10 000 r/ min 離心3-5 min，獲得發(fā)酵液上清，過0.22 μm水相濾膜，送氣相-質(zhì)譜（GC-MS）檢測進(jìn)行定性鑒定。氣質(zhì)檢測條件：DB-5非極性柱，檢測溫度270℃，氣化溫度250℃，柱室初始溫度為50℃，保留2 min，20℃/min升溫到120℃，再以30℃/min升溫到240℃，保持5 min，降溫到50℃，完成檢測，檢測結(jié)果與譜庫檢索比對(duì)。

1.2.5 篩選微生物發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量測定 乙偶姻含量測定所需試劑：精確稱取乙偶姻（88.11 g/mol）標(biāo)準(zhǔn)品0.017 62 g溶于100 mL水制成2 mmol/L的乙偶姻溶液。0.5%肌酸，4℃保存；5% 1-萘酚，4℃保存；40% KOH，4℃保存。利用顯色法［14］測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將2 mmol/L的乙偶姻溶液梯度稀釋成0.25 mmol/L、0.2 mmol/L、0.15 mmol/L、0.1 mmol/L、0.05 mmol/L，以蒸餾水為對(duì)照，分別取上述溶液200 μL于1.5 mL離心管，依次加入140 μL肌酸溶液，200 μL 1-萘酚，200 μL KOH溶液。每加入一種試劑均需渦旋震蕩均勻。所有試劑加完后室溫下溫育15 min，測樣前再次渦旋震蕩，用分光光度計(jì)在560 nm波長下測吸光度值，得到乙偶姻溶液吸光度變化與濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

乙偶姻樣品濃度測定：取試樣200 μL于1.5 mL離心管，按照上述顯色步驟進(jìn)行顯色，560 nm 波長下測吸光度值，嚴(yán)格控制顯色時(shí)間。

1.2.6 乙偶姻的發(fā)酵 挑取單菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min活化過夜培養(yǎng)，獲得種子液。將種子液按照5%的接種量接種至含有50 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為100 g/L，測定微生物生長量、培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇恳约耙遗家霎a(chǎn)量。發(fā)酵期間根據(jù)殘?zhí)橇拷Y(jié)果適當(dāng)補(bǔ)糖，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度維持在100 g/L，發(fā)酵至40 h時(shí)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度一次性補(bǔ)到200 g/L，直至發(fā)酵結(jié)束后不再補(bǔ)糖。

2 結(jié)果

2.1 微生物篩選

在耐糖培養(yǎng)基上不同稀釋度的土壤稀釋液100、10-1、10-2、10-3和10-4微生物的生長情況也不同。其中，100和10-1平板的微生物種類及數(shù)量較多，不易挑出單菌落。10-4平板上沒有長出微生物單菌落。從稀釋度為10-2和10-3的平板上成功篩選到4株單菌落微生物，再將篩選的微生物利用乙偶姻顯色液進(jìn)行篩選，得一株產(chǎn)乙偶姻的菌株。

2.2 微生物鑒定結(jié)果

篩選出的菌體在顯微鏡下呈現(xiàn)球形或稍橢圓形，排列成葡萄狀，無鞭毛，無芽孢。在LB固體培養(yǎng)基表面，菌體形成不透明的淺黃色小菌落，菌落干，邊緣整齊。將測序公司的測序結(jié)果提交至NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，得到該菌株與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），相 似 度99.04%，命名為PX03。菌種保藏編號(hào)為：CGMCC No.10671。對(duì)該菌株進(jìn)行全基因組測序，序列提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)為NO. LFOJ00000000（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LFOJ00000000）。利用MEGA7.0 構(gòu)建進(jìn)化樹（圖1），結(jié)果顯示，PX03 菌株與Staphylococcus aureusstrain 親緣關(guān)系更近。

圖1 PX 03進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

2.3 PX03菌株高濃度葡萄糖耐受性驗(yàn)證

由（圖2）結(jié)果可知，不同濃度的葡萄糖對(duì)菌株的生長有較顯著的影響，其中在300 g/L的葡萄糖濃度中菌株生長最好，OD600達(dá)到了100，在500 g/L的葡萄糖濃度中也可以生長。由此可見，菌株P(guān)X03可耐受較高濃度葡萄糖。

圖2 PX03 菌株對(duì)高濃度葡萄糖耐受性結(jié)果

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物鑒定

對(duì)該菌株發(fā)酵產(chǎn)物做 GC-MS 定性分析結(jié)果（圖3，表2）顯示，發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)較豐富的香氣物質(zhì)，其中主要產(chǎn)物為乙偶姻（22.51%）和2，3-丁二醇（21.29%）大量的香氣成分，還同時(shí)產(chǎn)乙酸（13.97%）、3，4-二羥基-3，4-二甲基己烷-2，5-二酮（8.52%）、吡 喃 酮（5.24%）、3-甲 基-丁 酸（4.47%）、2-乙基-丁酸（0.5%）、糠醛（0.25%）、2，4-二羥基-2，5-二甲基-3（2 h）-呋喃-3-酮（0.14%）和菠蘿酮（0.32%）等少量的香氣成分。

圖3 發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS定性檢測結(jié)果

2.5 PX03菌株發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻結(jié)果

繪制乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=659.907 04×X-0.849 36，R2=0.998.

為了進(jìn)一步探究菌株P(guān)X03的生長和產(chǎn)乙偶姻的情況，對(duì)其進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果（圖4）顯示，

OD600值和乙偶姻產(chǎn)量隨著時(shí)間的推移是向上升高的趨勢，但是在發(fā)酵期間出現(xiàn)了幾個(gè)下降的點(diǎn)，OD600值分別是在 16 h、36 h和44 h時(shí)出現(xiàn)了下降，乙偶姻產(chǎn)量在 20 h和 44 h時(shí)出現(xiàn)了下降。最終，在發(fā)酵72 h 后，菌株 OD600值最高可達(dá)到 66，乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到 41 g/L。該野生菌株是目前已報(bào)道較高產(chǎn)量的乙偶姻發(fā)酵菌株。初步發(fā)酵結(jié)果證明該菌株具有較好的乙偶姻生產(chǎn)潛力。

表2 菌株發(fā)酵液氣相-質(zhì)譜（GC-MS）結(jié)果分析

圖4 PX03菌株生長及發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻產(chǎn)量

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高，乙偶姻的用量在食品、醫(yī)藥以及煙草工業(yè)中不斷增長，微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法有諸多優(yōu)點(diǎn)而引起人們的廣泛關(guān)注。自然界中能以糖質(zhì)原料天然合成乙偶姻的微生物主要有腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬、乳球菌屬和芽孢桿菌屬等［15］。Roncal 等［5］利用一株乳球菌亞種突變株 CML B4 進(jìn)行乙偶姻發(fā)酵，乙偶姻產(chǎn)量可達(dá)到 40 g/L，分批發(fā)酵可達(dá) 59 g/L。Li 等［16］將野生型地衣芽孢桿菌 WX-02 經(jīng)代謝工程及發(fā)酵控制優(yōu)化，分批發(fā)酵 96 h 乙偶姻產(chǎn)量達(dá) 78.79 g/L。Zhang等［17］將陰溝腸桿菌經(jīng)乙偶姻還原酶和副產(chǎn)物途徑失活，輔助因子工程等策略，乙偶姻發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到55.22 g/L。本研究對(duì)金黃色葡萄球菌 PX03 進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在發(fā)酵期間由于菌株自身的生長周期的特點(diǎn)以及前期根據(jù)殘?zhí)橇窟m當(dāng)補(bǔ)糖至100 g/L，在發(fā)酵到40 h時(shí)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度一次性補(bǔ)到200 g/L導(dǎo)致OD600出現(xiàn)了多個(gè)拐點(diǎn)。由于菌株的濃度和生長活力對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)量有較大的影響，所以隨著OD600的變化乙偶姻的產(chǎn)量也出現(xiàn)了變化；另一方面，在乙偶姻生物合成中，乙偶姻可被乙偶姻還原酶/2，3-丁二醇脫羧酶（AR/BDH）還原為2，3-丁二醇，在一定條件下2，3-丁二醇也會(huì)被逆向轉(zhuǎn)化為乙偶姻［18］。通過基因工程平衡兩種產(chǎn)物的研究也逐漸深入，該菌株的獲得為乙偶姻的分子操作進(jìn)一步奠定了基因基礎(chǔ)。最終，初步發(fā)酵 72 h 后菌株 OD600值最高可達(dá)到 66，乙偶姻產(chǎn)量可達(dá) 41 g/L，為高產(chǎn)乙偶姻提供了新菌株，對(duì)乙偶姻的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。但是乙偶姻發(fā)酵產(chǎn)量還有待進(jìn)一步提高。發(fā)酵培養(yǎng)基成分及發(fā)酵參數(shù)對(duì)微生物發(fā)酵結(jié)果至關(guān)重要，Xiao等［19］對(duì)產(chǎn)乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，搖瓶水平上產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá) 37.90 g/L。后期實(shí)驗(yàn)中，對(duì)該菌株進(jìn)行高糖發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)提升乙偶姻產(chǎn)量具有重要意義。

葡萄糖是常見的微生物發(fā)酵底物，一般微生物發(fā)酵時(shí)底物濃度過高會(huì)使微生物生長受到限制，因而高滲微生物在發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用前景廣泛。李夢(mèng)琦等［20］篩選得到一株能在 550 g/L 葡萄糖培養(yǎng)基上生長的耐高糖且產(chǎn)香的魯氏酵母菌株。目前對(duì)高滲微生物的研究主要集中在酵母高糖耐受機(jī)制研究中［21-22］，由于酵母菌安全性高且富含多種營養(yǎng)物質(zhì)而被廣泛應(yīng)用，但是酵母菌生長緩慢，發(fā)酵周期長。而原核生物有容易培養(yǎng)，易于改造，發(fā)酵周期短等優(yōu)勢。本研究通過分子鑒定，確定 PX03 菌株為金黃色葡萄球菌，是條件致病菌［23］。PX03 菌株在發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻和高糖耐受性方面具有較明顯優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明 PX03 在 500 g/L的葡萄糖濃度中依然能生長，最適葡萄糖濃度為 300 g/L，能耐受較高葡萄糖濃度。該菌株為進(jìn)一步提高乙偶姻產(chǎn)量的高糖底物發(fā)酵及發(fā)酵時(shí)的耐糖機(jī)制研究奠定菌株基礎(chǔ)。菌株測序后，結(jié)合分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因操作實(shí)現(xiàn)乙偶姻合成代謝途徑構(gòu)建及增強(qiáng)等研究逐漸增多［24-27］。

此外，基于前期本研究組關(guān)于雪茄煙葉發(fā)酵中微生物群落演替研究及分離鑒定結(jié)果，葡萄球菌屬在雪茄煙葉發(fā)酵微生物群落中占有較大比重［28-29］，結(jié)合國內(nèi)關(guān)于熏肉及火腿等食品研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬在食品的增香提質(zhì)中起著重要作用［30-31］。另外，結(jié)合本研究中對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)物的 GC-MS 檢測結(jié)果，該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中香氣成分豐富，有望在雪茄煙葉發(fā)酵提質(zhì)增香中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

本研究從煙田土壤中篩選得到菌株P(guān)X03，經(jīng)過分子鑒定為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），相似度為 99.04%。該菌株對(duì)高濃度葡萄糖有較好耐受性，在 300 g/L葡萄糖濃度下生長最好，在 500 g/L的葡萄糖濃度中依然能生長。此外，對(duì)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物用 GC-MS 鑒定出豐富的香氣成分，其中主要香氣成分是乙偶姻和2，3-丁二醇，最后對(duì)該菌株進(jìn)行初步搖瓶發(fā)酵，乙偶姻產(chǎn)量可達(dá)到 41 g/L。