錢婷 葉建仁

（南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037）

磷是構(gòu)成有機(jī)化合物的重要組分之一，是限制作物產(chǎn)量的第二大營養(yǎng)要素。土壤中的磷絕大部分是以不能被植物直接利用的難溶性磷狀態(tài)存在。為了提高作物產(chǎn)量，每年都要向土壤中施用磷肥，但是磷肥被施入土壤后，與土壤中的Ca2+、Al3+等離子作用形成難溶性磷酸鹽，大部分磷肥又被固定在土壤中，以無效態(tài)儲存起來，還會破壞土壤結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致土壤板結(jié)［1-2］。長期向土壤中施用化學(xué)磷肥并非長遠(yuǎn)之計。如何將土壤中難溶磷轉(zhuǎn)化成植物可以吸收利用的有效態(tài)磷已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點。

在土壤中存在著廣泛可供利用的溶磷微生物，它們能夠?qū)⑼寥乐械碾y溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，供給植物有效的磷素［3］。溶磷微生物種類豐富，據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界目前已經(jīng)篩選出36屬89種溶磷微生物［4-5］，其中芽孢桿菌屬是研究最廣泛、最深入的溶磷微生物之一，而巨大芽孢桿菌作為解磷促生菌，也有一百多年的研究歷史，它不僅能夠分解土壤中難溶性磷，提高土壤速效磷含量，還能與解鉀菌、固氮菌互作，增強(qiáng)固氮解鉀能力［6-7］。20世紀(jì)80年代以后，我國也相繼研發(fā)出了多種芽孢桿菌組成的復(fù)合解磷菌劑，但由于溶磷微生物的施用條件不清楚、作用機(jī)制不明確、遺傳穩(wěn)定性差等問題，這些菌劑的田間施用效果并不理想，從而大大限制了溶磷微生物的應(yīng)用［8］。

我國對溶磷微生物的研究雖然已有一段時間，但發(fā)展不快，主要原因是溶磷微生物種類繁多，溶磷機(jī)制多樣且復(fù)雜，最常見的兩種觀點是酶解學(xué)說和酸解學(xué)說，即溶磷微生物在代謝過程中能夠分泌磷酸酶和有機(jī)酸，使土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可供植物吸收利用的有效磷［9-11］。已有的研究表明不同菌株之間溶磷機(jī)制存在差異，同一菌株在不同條件下溶磷機(jī)制也不盡相同，所以需要探索溶磷微生物溶磷機(jī)制，為創(chuàng)造出安全、繁殖快、溶磷能力強(qiáng)的多功能菌株提供理論支持，從而促進(jìn)溶磷微生物的生產(chǎn)與應(yīng)用［12-13］。

本實驗室前期從樟樹枝干上篩選出一株具有溶磷功能的細(xì)菌ZS-3，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌（B.megaterium），本研究針對該菌株從其溶無機(jī)磷特性出發(fā)，分析其溶磷的機(jī)理，探究菌株對樟樹生長及土壤理化因子的影響，旨為提高菌株對難溶性磷源的利用效率和開發(fā)溶磷微生物肥料等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和植物 供試菌株為巨大芽孢桿菌ZS-3菌株，保存于南京林業(yè)大學(xué)森林病理學(xué)實驗室；供試植物為一年生樟樹苗，來自廣西桂林市。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵 母 浸 粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.2-7.4。（2）NBPIP培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，Ca3（PO4）25.0，MgCl25.0，MgSO4·7H2O 0.25，KCl 0.2，（NH4）2SO40.1。

1.1.3 供試土壤 本實驗選擇2種不同類型的土壤，徐州土壤采自江蘇省徐州市沛縣天悅山莊，南京土壤采自南京林業(yè)大學(xué)北大山，在南京林業(yè)大學(xué)土壤測試實驗室分析了土壤理化性質(zhì)（表1）。

表1 原始土壤各項理化性質(zhì)

1.2 方法

1.2.1 溶磷能力測定 在LB培養(yǎng)基中接種供試菌株，28℃，200 r/min搖培18 h后制成種子液。種子液以1%接種量（體積比）接種于50 mL NBRIP培養(yǎng)基中，以接相同體積LB培養(yǎng)基的NBRIP培養(yǎng)基為對照，28℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔24 h經(jīng)4℃、12 000 r/min離心10 min取5.0 mL發(fā)酵液，設(shè)3個重復(fù)。采用鉬銻抗比色法測定上清液中可溶性磷的含量［14］。采用pH計測定發(fā)酵液pH。采用酸堿滴定法測定可滴定酸度［15］。每隔24 h采用平板稀釋涂布法測定NBRIP培養(yǎng)基中的菌體含量。

1.2.2 菌株ZS-3對Ca3（PO4）2表面形態(tài)破壞作用的測定 在LB培養(yǎng)基中接種供試菌株制成種子液，以1%接種量（體積比）接種到裝有50 mL NBRIP培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，以接相同體積LB培養(yǎng)基的NBRIP培養(yǎng)基為對照，28℃、200 r/min培養(yǎng)7 d。用濾紙過濾的方式回收搖瓶中的Ca3（PO4）2粉末，于烘箱中40℃烘干，將完全干燥的樣品離子濺射噴金，采用掃描電鏡對Ca3（PO4）2粉末表面進(jìn)行觀察。

1.2.3 磷酸酶活性測定 在LB培養(yǎng)基中接種供試菌株制成種子液，以1%接種量（體積比）接種到裝有50 mL NBRIP培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，以接相同體積LB培養(yǎng)基的NBRIP培養(yǎng)基為對照。設(shè)3個重復(fù)，28℃、200 r/min培養(yǎng)，取發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜、細(xì)胞外酶活性參照李冠喜方法提取測定［16］。

1.2.4 有機(jī)酸測定 活化好的種子液以1%接種量（體積比）接種于裝有50 mL NBRIP培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，以接相同體積LB培養(yǎng)基的NBRIP培養(yǎng)基為對照，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d后，發(fā)酵液經(jīng)4℃、12 000 r/min離心10 min，過0.22 μm孔徑濾膜，采用高效液相色譜測定發(fā)酵液中有機(jī)酸的種類和含量，設(shè)3個重復(fù)。色譜條件為：色譜柱為安捷倫InfinityLab Poroshell 120 SB-C8，4.6 mm×100 mm，2.7 μm，流動相為0.02 mol/L NH4H2PO4-H3PO4（pH 2.9），流速0.4 mL/min，柱溫30℃，檢測波長210 nm。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品：草酸、葡萄糖酸、酒石酸、α-酮戊二酸、蘋果酸、甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和富馬酸。

1.2.5 盆栽實驗 挑取菌株ZS-3單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，6 000 r/min，15 min離心收集菌體，用無菌水清洗菌體3次，將細(xì)菌懸浮液濃度調(diào)至1×108CFU/mL。將生長一致的樟樹苗移栽到裝有徐州土壤和南京土壤的花盆中，每盆種植1株樟樹苗，每盆裝入土壤500.0 g，每盆澆入上述供試菌株ZS-3的細(xì)菌懸浮液50.0 mL，空白對照接種等量無菌水，處理分別為XCK（徐州土壤，不施菌）、X+ZS-3（徐州土壤，施菌）、NCK（南京土壤，不施菌）、N+ZS-3（南京土壤，施菌）。每個處理設(shè)15個重復(fù)。盆栽期間各組處理其他管理措施均一致，適當(dāng)澆灌水，30、60、90 d后測定各類指標(biāo)。樟樹葉片用H2SO4-H2O2法消煮，鉬銻抗比色法測定全磷含量，土壤pH采用pH計測定，土壤有效磷含量采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定［17］。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 使用Origin 2017和SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 巨大芽孢桿菌ZS-3菌株的溶磷能力

分析結(jié)果（圖1-A）表明，菌株ZS-3在培養(yǎng)的168 h期間，溶磷量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在培養(yǎng)初期約24 h后溶磷量明顯增長，達(dá)109 μg/mL，在96 h時達(dá)到最大值188 μg/mL，然后呈緩慢下降趨勢，168 h后溶磷量為168 μg/mL。菌株在NBRIP培養(yǎng)基中的生長結(jié)果表明，菌株ZS-3從接種到96 h一直持續(xù)增長，菌體含量最大2.34×109CFU/mL。由圖1-B可以看出，在菌株培養(yǎng)過程中，前24 h內(nèi)pH下降速度最快，從8.06降到5.14，此后呈緩慢下降趨勢。培養(yǎng)基的pH與菌株溶磷量呈負(fù)相關(guān)?？傻味ㄋ岫瘸示徛仙厔荩?2 h時可滴定酸度值最大，達(dá)26.07 mmol/L。

2.2 Ca3（PO4）2表面形態(tài)的觀察

由圖2可知，未經(jīng)菌株ZS-3作用的Ca3（PO4）2（圖2-A）表面較光滑平整，邊緣規(guī)則，棱角分明。菌 株ZS-3與Ca3（PO4）2作 用7 d后（圖2-B），Ca3（PO4）2表面變得凸凹不平，棱角模糊，并且Ca3（PO4）2表面的薄層有脫落的趨勢。由此可知，菌株ZS-3對Ca3（PO4）2有明顯的溶蝕作用。

2.3 巨大芽孢桿菌ZS-3菌株的磷酸酶活性

圖1 168 h內(nèi)菌株ZS-3溶磷動力學(xué)

圖2 溶磷菌ZS-3發(fā)酵液對Ca3（PO4）2表面的溶蝕作用

酸酶活性測定結(jié)果（圖3）表明，菌株ZS-3既可以產(chǎn)生酸性磷酸酶，也能產(chǎn)生堿性磷酸酶，這2種酶在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜和細(xì)胞外均有分布。其中細(xì)胞外酶分別為125.72 μmol/（L·h）和125.51 μmol/（L·h），細(xì)胞內(nèi)次之，酶活為72.59 μmol/（L·h）和84.49 μmol/（L·h），細(xì)胞膜上的磷酸酶活性最低，分別為44.21 μmol/（L·h）和52.66 μmol/（L·h）。因此，可以確定菌株ZS-3的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶主要定位于細(xì)胞外，即主要是通過分泌到胞外以達(dá)到溶解難溶性磷源的目的。

2.4 巨大芽孢桿菌ZS-3菌株產(chǎn)生有機(jī)酸的能力

圖3 巨大芽孢桿菌ZS-3磷酸酶活性測定

由測定結(jié)果（表2）可知，菌株ZS-3在NBRIP培養(yǎng)基中總有機(jī)酸分泌量達(dá)838.05 ng/μL，其中以分泌乙酸和甲酸為主，含量分別為484.12 ng/μL和255.1 ng/μL；其次是蘋果酸、檸檬酸和酒石酸，以及微量的富馬酸、α-酮戊二酸、乳酸和琥珀酸，菌株ZS-3在該培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生葡萄糖酸?？梢娫诹酌{迫下，菌株ZS-3可通過產(chǎn)生有機(jī)酸來溶解難溶性磷以達(dá)到溶磷效果，乙酸的大量產(chǎn)生在溶磷過程中發(fā)揮主要作用，推測乙酸產(chǎn)生是該菌株溶無機(jī)磷的一個重要機(jī)制。

表2 菌株ZS-3在培養(yǎng)基中分泌的有機(jī)酸

2.5 菌株ZS-3對樟樹生長及土壤理化性質(zhì)的影響

從表3可看出，2種土壤栽種的樟樹苗施菌處理后各項生長指標(biāo)均有改善。徐州土壤和南京土壤接種樟樹苗施菌處理后株高增長率和地徑增長率都高于各自對照組，但菌株ZS-3對兩種土壤栽種的樟樹促生長作用存在一定差異，徐州土壤施菌處理組樟樹的促生作用更為明顯，優(yōu)于南京土壤施菌處理組且差異顯著。施菌組樟樹葉片全磷含量也均有增加，徐州土壤施菌組葉片全磷含量與對照組相比提高了40.63%，存在顯著性差異，南京土壤施菌處理后全磷含量高出對照19.9%，但差異不顯著。

表3 接種菌株ZS-3對樟樹生長指標(biāo)的影響

由圖4-A可知施菌處理對2種土壤pH影響不同。徐州土壤初始pH為8.15，施菌處理后土壤pH降低，尤其是施菌30 d后，土壤pH從8.11降至7.78，差異顯著。南京土壤施菌組pH總體呈上升趨勢，在接菌處理30 d、60 d和90 d后pH均高于對照。

施菌處理后樟樹根際土壤速效磷含量與各自CK比較有提高（圖4-B）。施菌30 d后，徐州土壤速效磷含量從6.72 mg/kg增加到10.29 mg/kg，提高了53.12%，南京土壤施菌組速效磷含量從12.85 mg/kg增加到13.51 mg/kg，提高了5.22%，隨著栽培時間的延長，各處理根際土壤速效磷的含量普遍下降，但仍高于對照，90 d后徐州土壤施菌組與南京土壤施菌組速效磷含量無顯著性差異。

3 討論

本研究采用液體培養(yǎng)法測定巨大芽孢桿菌ZS-3對無機(jī)磷源的溶解能力，結(jié)果表明菌株ZS-3最高溶磷量為188 μg/mL，高于大部分已報道的溶磷細(xì)菌在相同條件下溶磷能力。例如，Pandey等［18］獲得的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）AU-3溶無機(jī)磷能力為87.34 mg/L，程園園等［19］分離的巨大芽孢桿菌WXD3-1溶解Ca3（PO4）2的量最高為93.20 mg/L，Pradhan等［20］從酸性土壤中分離到一株洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）KHD08，其溶解無機(jī)磷能力達(dá)115.5 mg/L。因此，菌株ZS-3是一株高效溶磷菌，為微生物磷肥料的制備提供了材料，其應(yīng)用前景十分廣泛。菌株ZS-3在液體培養(yǎng)基中的有效磷含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在第4天時有效磷含量達(dá)到最大值，該結(jié)果與薛應(yīng)鈺等［21］測定菌株P(guān)-1407溶磷能力、Behera等［22］分析菌株P(guān)SB-26溶磷特性的結(jié)果一致，其原因可能是隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基里的營養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗，限制菌體活動和有機(jī)酸的產(chǎn)生，其次培養(yǎng)基中已有的可溶性磷含量會抑制對Ca3（PO4）2的進(jìn)一步溶解，因此一定時間后發(fā)酵液中可溶性磷含量不再增加。

圖4 施菌處理對樟樹根際土壤pH和速效磷含量的影響

目前被人們廣泛接受的微生物溶磷機(jī)理主要有2種方式，一是酸解作用，溶磷微生物在代謝過程中能夠分泌有機(jī)酸，既能降低培養(yǎng)基pH，使難溶性磷在酸性條件下溶解，又能與Ca2+、Fe3+、Al3+等金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)，將PO43-釋放出來［23-24］。二是酶解作用，即溶磷微生物會產(chǎn)生磷酸酶、植酸酶、核酸酶等［25-26］。從實驗結(jié)果可以看出菌株ZS-3在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜和細(xì)胞外均有分布酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，但酶活活性較低。衛(wèi)星等［27］研究巨大芽孢桿菌NCT-2溶磷機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，該菌株以Ca3（PO4）2為磷源酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性都很低，鐘傳青等［28］發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌P17溶解有機(jī)磷源時產(chǎn)生的磷酸酶活性顯著高于溶解無機(jī)磷產(chǎn)生的酶活，說明巨大芽孢桿菌溶解無機(jī)磷并不主要依賴于磷酸酶。在培養(yǎng)過程中pH顯著降低，培養(yǎng)液中可溶性磷含量顯著增加，這表明菌株ZS-3產(chǎn)生了酸類物質(zhì)達(dá)到溶磷目的，此研究結(jié)果與許多報道一致。任友花等［29］研究巨大芽孢桿菌11433-D溶磷機(jī)理時，發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸的產(chǎn)生促進(jìn)了溶磷量提高且使發(fā)酵液pH降低，主要有機(jī)酸為乙酸、葡萄糖酸、丙酸。吳海燕等［30］從缺磷黑土中分離到1株溶磷巨大芽孢桿菌，主要通過分泌葡萄糖酸溶解無機(jī)磷。本研究初步確定菌株ZS-3在溶磷過程中總有機(jī)酸分泌量達(dá)838.05 ng/μL，其中以分泌乙酸為主，與劉文干等［31］、蕭龍珍等［32］研究一致，即乙酸含量的高低可能是決定溶磷量高低的重要因素。關(guān)于乙酸與菌株ZS-3溶磷能力的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。

已有的研究表明，溶磷菌能否將土壤中的難溶性磷釋放成可溶性磷不僅取決于菌株溶磷能力的強(qiáng)弱，也與供試土壤理化性質(zhì)有關(guān)，低水平的可溶性磷酸鹽會誘導(dǎo)溶磷菌產(chǎn)生溶磷作用，而在高水平外源可溶性磷酸鹽作用下則會被抑制［33-34］。故本實驗首次選用2種類型的土壤進(jìn)行盆栽實驗，徐州土壤為堿性缺磷土壤，以難溶性鈣磷為主，南京土壤為中性土壤，土壤速效磷含量高。實驗結(jié)果表明施加菌株ZS-3后徐州土壤pH顯著下降，主要是因為在磷脅迫下誘導(dǎo)菌株ZS-3分泌多種有機(jī)酸，在一定程度上降低徐州土壤的酸堿度，這一結(jié)果與前期室內(nèi)實驗結(jié)果相一致，菌株在無機(jī)磷培養(yǎng)基中搖培一定時間后產(chǎn)生有機(jī)酸導(dǎo)致pH下降。而南京土壤速效磷含量高，菌株在代謝過程中多產(chǎn)生蛋白質(zhì)和脂類等堿性物質(zhì)，故土壤pH上升。2種土壤施菌組的速效磷含量均高于對照且徐州土壤速效磷含量增長量更顯著，徐州土壤是低磷土壤，低水平的可溶性磷酸鹽更利于菌株ZS-3發(fā)揮作用，誘導(dǎo)菌株在代謝過程中產(chǎn)生了酸性物質(zhì)、生長素等物質(zhì)，提高了土壤根系速效磷和多種酶活活性。因此，對樟樹促生作用也更加顯著，這一實驗結(jié)果為菌株ZS-3的施用范圍提供了一些理論性支持。

溶磷微生物作為生物肥料，生產(chǎn)成本低，施用后不僅能提高土壤中速效磷含量，促進(jìn)植物生長，還能改良鹽堿地，改善土壤結(jié)構(gòu)，對保持生態(tài)環(huán)境平衡具有重要意義［35-37］。本研究以Ca3（PO4）2為磷源，揭示了菌株ZS-3溶無機(jī)磷特性，探索其溶磷機(jī)制，為創(chuàng)造出安全、溶磷能力強(qiáng)的多功能菌株提供理論支持。在后續(xù)實驗中，筆者將對菌株ZS-3的發(fā)酵工藝以及菌肥復(fù)配等方面做進(jìn)一步研究，為其在肥料應(yīng)用中的推廣進(jìn)行深入探索。

4 結(jié)論

巨大芽孢桿菌ZS-3在無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，最高溶磷量為188 μg/mL，菌體數(shù)量最大達(dá)2.34×109CFU/mL，pH從8.06降至5.14，可滴定酸度呈緩慢上升趨勢。ZS-3與Ca3（PO4）2作用后能使其表面變得凸凹不平。ZS-3在溶磷過程中分泌酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和大量有機(jī)酸。施菌處理對2種不同類型土壤栽種的樟樹都具有促生作用，土壤速效磷含量均提高且缺磷土壤中速效磷含量增長量更顯著。