趙海燕 宋晨斌，2 劉正亞 馬興榮 尚會會 李安華 關(guān)現(xiàn)軍 王建設(shè)

（1. 安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 安陽市微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽 455000；2. 天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院，天水 741001）

淀粉是普遍存在于植物體內(nèi)，用于植物貯存能量的一種多糖［1］。目前生產(chǎn)淀粉的原料主要是玉米、小麥、薯類、稻谷等作物［2-3］。我國作為農(nóng)業(yè)大國，根據(jù)中國農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料顯示截止到2017年，上述四類作物的產(chǎn)量已占我國糧食總產(chǎn)量的90%以上［4］。淀粉是以葡萄糖為單位通過α-1，4糖苷鍵連接的高分子碳水化合物。依據(jù)單糖連接方式，淀粉可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉［5］。淀粉是人類的重要食物來源，也是多種工業(yè)生產(chǎn)的原料［6］。淀粉加工工藝主要有酸法、酶酸法、全酶法和雙酶法等。其中，酶法在國內(nèi)外加工淀粉中已廣泛應(yīng)用［7］。α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）是指通過水解淀粉分子內(nèi)部中的α-1，4-糖苷鍵，將淀粉水解為糊精、單糖、少量麥芽糖和葡萄糖的一類酶［8］。來源于細(xì)菌和真菌的α-淀粉酶被廣泛應(yīng)用于食品、生物燃料、造紙、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑、動物飼料等行業(yè)，占整個酶制劑市場的25%-30%［9-10］。在面團(tuán)發(fā)酵過程中，淀粉酶通過對淀粉的水解作用提高面團(tuán)的糖含量，進(jìn)而增大面包的體積，改善色澤［11-12］。在超聲波作用下對織物進(jìn)行酶退漿，不僅可以提高退漿效率，還縮短退漿時間［13］。在生物乙醇的生產(chǎn)過程中，淀粉酶發(fā)揮著將原料醪液液化的作用［14］。淀粉酶還可以將含淀粉的食物顆粒水解成小分子的水溶性寡糖，用水沖洗后可去除污漬。當(dāng)前90%的液體除垢劑中含有α-淀粉酶［15］。將淀粉酶添加到動物飼料中，可有效提高飼料中淀粉的消化率，有利于動物的生長發(fā)育［16］。

在不同的應(yīng)用領(lǐng)域，對淀粉酶性能的要求不同。特別是工業(yè)化生產(chǎn)中的高溫、低溫、高鹽、堿性、酸性等苛刻條件制約著淀粉酶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［17-18］。因此，隨著全球資源環(huán)境壓力的持續(xù)增大和綠色合成產(chǎn)業(yè)的需求，酶的應(yīng)用和需求量迅速增加，酶基因資源的挖掘和開發(fā)顯得非常迫切。目前，熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶主要來源于細(xì)菌（特別是芽孢桿菌），而放線菌和真菌來源的報(bào)道較少［19］。高溫放線菌類群是一類能夠在極端環(huán)境下生長代謝的革蘭氏陽性、化能異養(yǎng)菌。微生物學(xué)界認(rèn)為它是介于細(xì)菌和放線菌之間的一類微生物。高溫放線菌具有代謝產(chǎn)物豐富，很多具有重要的工業(yè)價值，其中蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纖維素酶等應(yīng)用廣泛［20］。2005年，Yoon等［21］報(bào)道高溫放線菌-萊斯氏屬（Laceyella）。其主要分布于大曲［22-23］、溫泉［24］、海洋［25］、土壤［26］、堆肥［27］等。朱國東等［28］從云南騰沖熱泉中篩選到一株嗜熱放線菌Laceyellasp.RHA1，淀粉酶的最適溫度為60℃。來源于Laceyella sacchari5-氨基乙酰丙酸合成酶LS-ALAS不僅具有良好的熱穩(wěn)定性，還有較高的酶活力［29］。研究還發(fā)現(xiàn)，高溫放線菌Laceyella sacchari有一定的降解纖維素的能力［30］。Singh［31］研究了Laceyella sacchariB42的木聚糖酶活性，其研究表明，最適反應(yīng)溫度和pH分別為9.0和60℃。在60℃處理6 h后還保存90%的活性。Dolashki等［32］研究了Laceyella sacchari酪氨酸酶的性質(zhì)。Laceyella sacchari嗜熱蛋白酶在乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，且重組酶的熱穩(wěn)定性好，還在pH 6.0-11.0范圍內(nèi)具有較高的活性［33］。來源于Laceyella putida葡聚糖酶LpGluA的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度分別為4.2和60℃［34］。Laceyella sacchari亮氨酸脫氫酶Ls-LeuDH也具有較好的熱穩(wěn)定性［25］。在50℃處理72 h時，Laceyella sacchariLP175菌株聚乙丙交酯降解酶的粗酶對PLLA的分解效率達(dá)到91%［26］。另外，其還具有高效的生淀粉降解能力，生物乙醇的產(chǎn)量高達(dá)90.9 g/L［35］。Laceyellasp. DS3 α-淀粉酶AmyLa最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和7.0，其固定化酶的最適反應(yīng)溫度沒有變化，但是提高了在pH4.0-7.0范圍內(nèi)的酶活性［36-37］。來源于Laceyella sacchariTSI-2的α-淀粉酶在70℃和pH7.0時表現(xiàn)出最高活性，能夠高效去除棉布上的淀粉污漬，其固定化酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)［19，38］。四甲基吡嗪作為Laceyella sacchari產(chǎn)生的大量代謝物，還被認(rèn)為是醬香白酒風(fēng)味的主體成分之一［23］。因此，積極開展嗜熱放線菌Laceyellasp.的相關(guān)研究十分重要。

本研究從安陽面粉廠附近土壤里分離篩選產(chǎn)α-淀粉酶的Laceyellasp.菌株，采用同源克隆技術(shù)獲取α-淀粉酶基因。其次，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行功能研究。最后，基于同源建模方法的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，分析差異氨基酸位點(diǎn)與酶學(xué)性質(zhì)上的差異，為進(jìn)一步的分子改良提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品、菌株及質(zhì)粒 樣品：采集自安陽市面粉廠附近的土壤。

菌株：E.coli Trans1-T1、E.coliBL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

質(zhì)粒：pET-22b（+）表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體淀粉篩選培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g。

高氏一號培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SPECOOD S600分光光度計(jì)：德國耶拿分析儀器有限公司；HNY-ⅢB搖床：天津歐諾儀器股份有限公司；CF16RN高速離心機(jī)：株式會社日立制作所；電泳儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；?KTA蛋白純化儀：通用電氣醫(yī)療集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選及鑒定 取適量土樣加入到50 mL無菌水中制成土壤懸液，37℃，180 r/min培養(yǎng)20 min，作為原液。取原液進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6的稀釋菌懸液100 μL涂布于固體淀粉篩選培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h。在固體淀粉篩選培養(yǎng)基上滴加碘液，選取能產(chǎn)生無色透明圈的菌落，且透明圈直徑與菌落直徑之比較大者進(jìn)行菌株鑒定。

依據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行提取DNA操作。以細(xì)菌通用鑒定引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，擴(kuò)增菌株的16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增完成后，取適量產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，以TAE緩沖液作為電泳緩沖液，電壓150 V，20 min。條帶大小驗(yàn)證正確后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至公司測序。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站上，選用BLASTn程序?qū)甑?6S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。最后，依據(jù)LPSN（http：//www.bacterio.net/）公布的Laceyellasp.屬標(biāo)準(zhǔn)菌株，通過MEGA7.0軟件［39］的鄰位相連法［40］，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 α-淀粉酶基因AmyL的克隆 以Laceyellasp.DS3（GenBank號：LN901326）基因組序列中的α-淀粉酶基因序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)正向引物MF-8-1 F：5'-GAAGTGACCCAGCTACGAGATGAGC-3'以 及反向引物MF-8-1 R：5'-GACCCCAACTATATCAAGC CAGAATTCGG-3'，通過PCR擴(kuò)增得到α-淀粉酶基因AmyL全長。

1.2.3 pET-22b-AmyL重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以重疊延伸PCR［41］（Overlap-PCR）構(gòu)建重組表達(dá)載體。根據(jù)α-淀粉酶基因AmyL以及質(zhì)粒pET-22b（+）的序列設(shè)計(jì)引物Amy MF-8-1 F1：5'-GGATATCGGAATT AATTCGGATCCGAATTCGCTTTCTCCTGCGGATTGGC AAG-3'、Amy MF-8-1 R1：5'-GTGGTGGTGGTGGTGC TCGAGTTTGGTGAATATCTTTACTTCTTTGGGGC-3'、Amy MF-8-1 F2：5'-GCCCCAAAGAAGTAAAGATAT TCACCAAACTCGAGCACCACCACCACCAC-3'、Amy MF-8-1 R2：5'-CTTGCCAATCCGCAGGAGAAAGCG AATTCGGATCCGAATTAATTCCGATATCC-3'。其中Amy MF-8-1 F1與Amy MF-8-1 R2反 向 互 補(bǔ)，Amy MF-8-1 R1與Amy MF-8-1 F2反向互補(bǔ)。

通過上述引物對基因以及質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入同源臂。再以質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物為模板、基因擴(kuò)增產(chǎn)物為大引物，兩者按照質(zhì)量比為1∶10構(gòu)建反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，吸取部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將經(jīng)由PCR擴(kuò)增后構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體命名為pET22b-AmyL，并轉(zhuǎn)化至E.coli Trans1-T1，同時選取菌液PCR驗(yàn)證正確的單克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.4 重組α-淀粉酶AmyL的表達(dá)及純化 將測序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）中表達(dá)，然后以1%的接菌量轉(zhuǎn)接于200 mL LB液體培養(yǎng)基（氨芐霉素濃度：100 μg/mL）中，37℃、180 r/min培養(yǎng)2 h至OD600達(dá)到0.6-0.8之間，加入400 μL 0.5 mol/L IPTG，30℃、180 r/min誘導(dǎo)4 h。

通過?KTA蛋白純化系統(tǒng)純化胞內(nèi)總蛋白溶液［42］：（1）將胞內(nèi)總蛋白溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾；（2）用結(jié)合緩沖液平衡層析柱；（3）取經(jīng)過濾膜過濾的樣品上樣；（4）用洗脫緩沖液進(jìn)行線性洗脫；（5）收集洗脫峰進(jìn)行酶活性的測定。對純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE以及HPLC-MS/MS質(zhì)譜分析鑒定。

1.2.5 重組α-淀粉酶AmyL活性測定及性質(zhì)研究 采用二硝基水楊酸（DNS）法［43］進(jìn)行α-淀粉酶的酶活力測定。將900 μL 1%淀粉酶底物在45℃預(yù)熱5 min，加入100 μL稀釋的酶液反應(yīng)10 min后，用DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴5 min。反應(yīng)液冷卻至室溫后，測定540 nm的吸光值。淀粉酶的酶活單位定義為：在最適溫度和最適pH下，每毫升反應(yīng)體系每分鐘分解淀粉生成1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位。

1.2.5.1 最適反應(yīng)溫度的測定 在pH6.0反應(yīng)體系下，分別測定溫度在25-60℃時的酶活力，反應(yīng)時間為10 min。酶活力最高點(diǎn)即為酶的最適反應(yīng)溫度，同時計(jì)算不同溫度下的相對酶活力。

1.2.5.2 最適反應(yīng)pH的測定 在45℃反應(yīng)條件下，以檸檬酸緩沖液和磷酸緩沖液配制，分別測定pH為4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0時的酶活力，反應(yīng)時間為10 min。酶活力最高點(diǎn)即為酶的最適反應(yīng)pH，同時計(jì)算其他pH下的相對酶活力。

1.2.5.3 溫度穩(wěn)定性的測定 取適當(dāng)酶液，分別放置在40、45、50、60℃下水浴保溫10、20、30、50 min，測定殘余的酶活力，以未處理的酶液作對照，計(jì)算處理不同時間后殘余的相對酶活力。

1.2.5.4 pH穩(wěn)定性的測定 取適當(dāng)酶液在溫度為45℃下，分 別 在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0下保溫1 h后，以未處理的酶液作對照，測定不同pH下處理后殘余的相對酶活力。

1.2.5.5 酶促反應(yīng)動力學(xué)研究 以經(jīng)過蛋白質(zhì)純化后的目的蛋白，對淀粉酶的動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定。配制不同濃度的淀粉底物，基于淀粉酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH，測定酶的活力，同時測定蛋白濃度，計(jì)算出酶的比活力。比活力定義：每毫克酶蛋白所含的酶活力單位。以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/比活為縱坐標(biāo)，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖［44］。

1.2.5.6 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響 在酶學(xué)性質(zhì)測定反應(yīng)體系中加入終濃度分別為1、5和10 mmol/L的不同離子及化學(xué)試劑，測定酶活力，以不加化學(xué)試劑的反應(yīng)體系作為對照。探究不同金屬離子及化學(xué)試劑對淀粉酶活力的影響。

1.2.5.7 底物特異性研究 將可溶性淀粉、支鏈淀粉、馬鈴薯淀粉、普魯蘭多糖、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精等底物分別溶解于0.1 mmol/L pH 6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，終濃度為 5 mg/mL。加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的重組淀粉酶AmyL，在45℃下反應(yīng)10 min。以可溶性淀粉為底物時的酶活力為100%，分別計(jì)算其他底物的相對酶活力。

1.2.6 重組酶的同源建模 從PDB數(shù)據(jù)庫中檢索與AmyL序列相似且功能已知的α-淀粉酶，以來源于Anoxybacillus的α-淀粉酶（PDB ID號：5A2B；序列一致性：56%）為模板，利用 Discovery Studio 2018軟件對淀粉酶AmyL進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的建模。然后使用相關(guān)模塊對構(gòu)建好的模型進(jìn)行能量最小化和結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并采用Ramanchandran Plot和Profile-3D評估模型。Deepview軟件也應(yīng)用于部分結(jié)構(gòu)功能分析。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選及鑒定

土壤樣品經(jīng)稀釋涂布后，在固體淀粉篩選培養(yǎng)基上，選取具有較大透明圈的菌落作為候選菌株。在多次分離、純化的基礎(chǔ)上，獲得目的菌株，編號為MF-8-1。菌株MF-8-1在固體淀粉篩選培養(yǎng)基上的菌落特征為純白色、干燥、多皺、邊緣不規(guī)則，能產(chǎn)生明顯的透明圈。

提取MF-8-1的基因組，利用引物27F和1492R擴(kuò)增其16S rDNA序列后進(jìn)行測序。經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)其與Laceyellasp.屬的16S rDNA序列（GenBank號：EU430566.1）的一致性最高，序列相似性為99%。依據(jù)高溫放線菌科及Laceyellasp.屬的不同種16S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明MF-8-1與Laceyella sediminis（GenBank號：FJ422144）的進(jìn)化距離最小。

2.2 α-淀粉酶基因AmyL的克隆及序列分析

以MF-8-1基因組DNA為模板，MF-8-1 F、MF-8-1 R為引物，在KOD-Plus-Neo高保真聚合酶的作用下，擴(kuò)增出一條2.2 Kb左右的片段，與預(yù)期DNA片段大小符合。測序結(jié)果表明該基因全長為1467 bp，編碼488個氨基酸和一個終止密碼子，將該基因命名為AmyL。利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對AmyL編 碼 蛋 白 進(jìn)行信號肽預(yù)測。結(jié)果表明AmyL編碼蛋白具有一個由35個氨基酸殘基組成的信號肽，剪切位點(diǎn)介于Leu35和Ser36之間。

圖1 菌株MF-8-1的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 重組α-淀粉酶AmyL的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21，通過PCR方法驗(yàn)證，獲得重組表達(dá)菌株。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組菌的細(xì)胞破碎液具有很高的淀粉酶活性，而空白對照無法檢測出淀粉酶活性。同時，對培養(yǎng)兩種重組菌的上清液進(jìn)行淀粉酶活性的檢測后，結(jié)果顯示上清液均無活性，表明淀粉酶基因AmyL在周質(zhì)中表達(dá)。

圖2 重組α-淀粉酶AmyL的SDS-PAGE分析

對重組菌的胞內(nèi)總蛋白進(jìn)行蛋白純化，并對純化后蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果表明AmyL基因在E.coliBL21（DE3）中得到了較好的表達(dá)（圖2），在55 kD附近出現(xiàn)了較為明顯的條帶，且與預(yù)期大小相符。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，有32個肽段與理論上的肽段相匹配，其肽段覆蓋率為73%，說明重組子表達(dá)的蛋白質(zhì)為AmyL。

2.4 重組α-淀粉酶AmyL的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 重組α-淀粉酶AmyL的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 重組α-淀粉酶AmyL的最適反應(yīng)溫度為45℃，在40-50℃下可保持較高酶活力，在60℃下酶活力全部損失（圖3）。在40-50℃下，酶的穩(wěn)定性較好，保溫50 min后酶活力仍能維持在80%左右。但在60℃下處理50 min后，酶活力全部損失（圖4）。

圖3 溫度對重組α-淀粉酶AmyL酶活力的影響

圖4 重組α-淀粉酶AmyL的溫度穩(wěn)定性

2.4.2 重組α-淀粉酶AmyL的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性 重組α-淀粉酶AmyL的最適反應(yīng)pH值為6.0，在pH 5.6-6.8下具有較高的酶活性，其相對酶活在80%以上。pH＜5.6后，酶活力急劇下降。在pH 4.8、8.0處，酶活力完全損失（圖5）。在pH 6.0-10.0時，酶活力均無下降且有些許上升，說明該酶能耐受偏堿性環(huán)境（圖6）。

圖5 pH對重組α-淀粉酶AmyL酶活力的影響

圖6 重組α-淀粉酶AmyL的pH穩(wěn)定性

2.4.3 重組α-淀粉酶AmyL的動力學(xué)參數(shù) 以0.1、0.4、0.7、1.0、2.0、3.0和5.0 mg/mL濃 度 的可溶性淀粉作底物，測定酶的活力；做Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖（圖7），數(shù)據(jù)分析后得出酶的比活、Km和Vmax分別為185.39 U/mg、0.95 mg/mL、343.12 μmol/（min·mg）。進(jìn)一步計(jì)算得出，AmyL的Kcat為315.28 s-1，催化效率Kcat/Km為331.13 mL/（s·mg）。

圖7 重組α-淀粉酶AmyL的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖

2.4.4 金屬離子及化學(xué)試劑對重組α-淀粉酶AmyL的影響 以未加化學(xué)試劑的反應(yīng)體系作為對照，得到不同濃度的金屬離子及化學(xué)試劑對重組酶活力的影響如表1所示。當(dāng)體系中Na+、K+、Ca2+濃度達(dá)到10 mmol/L濃度時，對酶活力有一定的保護(hù)作用，而較低濃度下會使酶活力損失；Mn2+、Mg2+、EDTA對重組α-淀粉酶AmyL均存在抑制作用，但Mn2+的抑制作用比Mg2+、EDTA略強(qiáng)；SDS對重組α-淀粉酶AmyL具有強(qiáng)抑制作用，即使只有1 mmol/L，也能使酶活力全部喪失，說明重組α-淀粉酶AmyL對SDS敏感。

表1 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響

2.4.5 重組α-淀粉酶AmyL的底物特異性 重組α-淀粉酶AmyL不僅可以高效地催化可溶性淀粉的水解，對其他底物也表現(xiàn)出較高的水解活性。將重組α-淀粉酶AmyL對可溶性淀粉的酶活定義為100%時，AmyL對于支鏈淀粉和馬鈴薯淀粉的相對酶活力分別為180.3%和111.6%，對β-環(huán)糊精和普魯蘭多糖的相對酶活力分別為2.5%和0.8%，而以α-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精為底物時，未檢測到活性。

2.5 α-淀粉酶AmyL同源建模及結(jié)構(gòu)分析

AmyL與 來 源 于Laceyella sacchari的α-淀 粉酶（TCW41560）的序列一致性為99%，與晶體結(jié)構(gòu)已知的Anoxybacillusα-淀粉酶5A2B的一致性為56%。以5A2B作為模板，對AmyL進(jìn)行同源建模。從結(jié)構(gòu)上可以看出（圖8），AmyL由3個結(jié)構(gòu)域組成，即結(jié)構(gòu)域A、B、C。結(jié)構(gòu)域A由8個α-螺旋和8個β-折疊交替組成的TIM桶構(gòu)成；結(jié)構(gòu)域B是TIM桶的第3個α-螺旋和β-折疊之間形成的不規(guī)則β-like結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域C由位于蛋白質(zhì)C端的8個反平行β-折疊以及一些無規(guī)則卷曲構(gòu)成。通過分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)域A的β3、β4、β5和β7折疊C端附近存在GH13家族的4個CSR：CSR I（152DVVANH157）、CSR II（228DGLRVDTVKHVPKWFWREF246）、CSR III（256GEVFHG261）和CSR IV（317FIDNHD322）。

圖8 AmyL的三維結(jié)構(gòu)

3 討論

淀粉酶廣泛存在于動植物及微生物中，其中微生物來源的淀粉酶具有各種不同的性質(zhì)，在淀粉酶的開發(fā)研究中具有相當(dāng)重要的地位。國內(nèi)外報(bào)道產(chǎn)淀粉酶的微生物［29-35］主要有：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［45］、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）［46］、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［47］、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）［48］、多粘類芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）［49］、高溫放線菌（Thermoactinomyces）［50］等。

本研究根據(jù)Laceyellasp.DS3基因組序列中的α-淀粉酶基因序列，采用同源克隆從Laceyellasp.中克隆出α-淀粉酶基因AmyL并在大腸桿菌中表達(dá)。其最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH值為6.0，高濃度的Na+、K+、Ca2+能提高該淀粉酶的穩(wěn)定性。朱國東等［28］從云南騰沖熱泉中篩選到一株嗜熱放線菌Laceyellasp.RHA1，經(jīng)過硫酸銨沉淀和分子篩層析，獲得低分子量的淀粉酶（11.2 kD）。其最適溫度為60℃，最適pH值為6.0，Ca2+能夠提高野生酶的最適反應(yīng)溫度。Lomthong等［35］利用發(fā)酵條件優(yōu)化方法，研究了Laceyella sacchariLP175的分解酶對木薯生淀粉的降解能力；且生物乙醇的產(chǎn)量高達(dá)90.9 g/L（理論產(chǎn)量的88%）。來源于溫泉的Laceyella sacchariTSI-2α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，在37-100℃都具有酶活性，100℃處理1 h還保留70%以上的活性。其最適反應(yīng)pH值為7.0，在pH 4.0-9.0內(nèi)有酶活性；在pH 4.0條件下處理3 h，還保留60%以上的相對酶活力；在pH9.0條件下處理6 h，還保留70%以上的相對酶活力；固定化酶提高了在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性；表面活性劑還可提高相對酶活力；能夠高效去除棉布上的淀粉污漬［19，38］。嗜熱微生物Thermomyces dupontiiL18的TdAmy A的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為50℃和6.5［51］。

Laceyellasp.DS3的α-淀粉酶的野生酶的最適溫度為50℃，在E.coli中表達(dá)的重組AmyLa最適溫度為55℃，最適pH為7.0；游離酶在pH3-5時的相對酶活力小于20%，在pH 6-7時的相對酶活力在80%以上；而固定化酶在pH3-8時相對酶活力保持在80%以上［36-37］。本研究的AmyL與α-淀粉酶AmyLa以及來源于Thermoactinomyces的α-淀粉酶AmyTV1［52］的酶學(xué)性質(zhì)存在較大差異（表2）。但通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)三者的序列一致性極高，只存在4個位點(diǎn)的差異，分別是261、342、361、420位氨基酸。

為了從分子層面探究其酶學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生差異的原因，通過Discovery Studio 2018軟件構(gòu)建了AmyL、AmyLa、AmyTV1的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)三者的整體三維結(jié)構(gòu)基本保持一致，其中261、361位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域A的α-螺旋上、342位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域A的loop結(jié)構(gòu)上、420位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域C的反平行β-折疊上（圖8）。以AmyL作為參照，利用Deepview軟件分析AmyLa、AmyTV1在上述4個氨基酸位點(diǎn)的氫鍵數(shù)目變化。結(jié)果顯示，當(dāng)361位氨基酸由組氨酸（AmyL）變 為 酪 氨 酸（AmyLa、AmyTV1）時，Tyr361與Thr365之間會形成一個新的氫鍵，該位點(diǎn)的氫鍵由4個變?yōu)?個。在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成一個氫鍵所獲得平均能量約為0.6 kcal/mol［53］。Suvd等［54］通過比較來源于嗜中溫微生物Bacillus licheniformis的α-淀粉酶（Bacillus licheniformisα-amylase，BLA）以及來源于嗜熱微生物Bacillus stearothermophilus的α-淀粉酶（Bacillus stearothermophilusα-amylase，BSTA）的 結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，BSTA較BLA在三維結(jié)構(gòu)上增加了9個氫鍵，使得BSTA獲得了更好的熱穩(wěn)定性。因此，氫鍵數(shù)量是重組酶AmyL的最適反應(yīng)溫度低于AmyLa、AmyTV1的最適反應(yīng)溫度的因素之一。此外，α-淀粉酶AmyL具有典型的（α/β）8桶狀結(jié)構(gòu)（TIM桶），該結(jié)構(gòu)是α-淀粉酶具有催化活性的關(guān)鍵因素［55］。α-淀粉酶AmyL的361位點(diǎn)位于TIM桶的第8個α-螺旋C端上，氫鍵數(shù)量的增加使其在折疊成螺旋結(jié)構(gòu)時易產(chǎn)生較大的構(gòu)象張力［56］，進(jìn)而引起熵變的增加使得AmyL的最適溫度較AmyLa、AmyTV1有所下降。因此，361位點(diǎn)對AmyL的最適反應(yīng)溫度及最適反應(yīng)pH具有重要影響。

表2 α-淀粉酶AmyL、AmyLa、AmyTV1的最適反應(yīng)溫度及pH比較

4 結(jié)論

本研究從安陽面粉廠附近土壤中篩選到一株具有淀粉酶活性的菌株，經(jīng)過分子生物學(xué)鑒定，確定為Laceyellasp.。將其α-淀粉酶基因克隆，并在E.coliBL21（DE3）中成功表達(dá)。α-淀粉酶基因AmyL全長1 467 bp，編碼488個氨基酸和一個終止密碼子，在Leu35和Ser36之間存在信號肽酶切割位點(diǎn)。重組酶AmyL的最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH值為6.0，在溫度為40-50℃、pH值為6.0-10.0的范圍內(nèi)具有較穩(wěn)定的酶活力，其Km和Vmax分別為0.95 mg/mL和343.12 μmol/（min·mg），高 濃 度 的Na+、K+、Ca2+對重組酶AmyL酶活力有保護(hù)作用。