姚 旭，王清華，茹 藝，高之苑

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110847）

骨關(guān)節(jié)炎是一種臨床常見的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，多見于髖、膝、手指關(guān)節(jié)。臨床上多以疼痛為首要表現(xiàn)，晚期多見關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，治療上仍以對癥治療為主。骨關(guān)節(jié)炎多見于中老年人，發(fā)病率逐年增加[1-3]。隨著對骨關(guān)節(jié)炎的研究越來越多，發(fā)現(xiàn)細胞自噬對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病具有重要作用，但是具體機制仍不明。本研究以軟骨細胞自噬為出發(fā)點，通過芍藥苷的干預(yù)，研究芍藥苷對骨關(guān)節(jié)炎細胞自噬的影響，揭示芍藥苷治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細胞：人正常軟骨細胞C28/I2，購買于美國ATCC細胞庫。主要試劑及藥品：芍藥苷（索萊寶，貨號：SP8030），TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），抗LC3 Ⅰ/Ⅱ抗體及抗Beclin 1抗體（Cell Signaling），抗p-PI3K抗體（Santa Cruz），抗p-AKT抗體（Proteintech）。主要儀器：細胞培養(yǎng)箱，伯樂電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，酶標儀，ECL顯影儀，細胞 超凈臺等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) C28/I2軟骨細胞采用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。待細胞長至培養(yǎng)皿的90%左右時，用胰酶進行消化，傳代培養(yǎng)。每2～3 d換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 芍藥苷對C28/I2活性的影響 對C28/I2細胞進行計數(shù)。實驗分組為空白對照組、不同濃度芍藥苷組，按分組分別加入不同濃度芍藥苷，空白對照組不加。加入CCK-8試劑，用酶標儀，取450 nm波長測定各組細胞的吸光度，觀察芍藥苷對C28/I2軟骨細 胞生長的影響。

1.2.3 芍藥苷對IL-1β 處理的軟骨細胞炎癥的影響 C28/I 2細胞分組：對照組、模型組、芍藥苷治療組、芍藥苷加3MA組。細胞貼壁生長24 h。按實驗分組分別加入試劑及藥品，24 h后收集細胞及細胞上清液，提取細胞總蛋白，進行western blot實 驗。

1.2.4 western blot對細胞總蛋白進行BCA蛋白定量，進行蛋白變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗孵育，4 ℃冰箱過夜。二抗室溫孵育1 h后，對含有蛋白條帶的PVDF膜進行ECL化學(xué)發(fā)光，并對發(fā)光結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 細胞免疫熒光實驗 細胞接種在無菌的細胞爬片上，加藥處理后，用4 %多聚甲醛溶液固定，經(jīng)Triton X-100通透，胎牛血清封閉后，經(jīng)稀釋的一抗于濕盒中，4 ℃孵育過夜。用熒光標記的特異性二抗孵育，封片。待晾干后，在暗室中進行拍照。

1.2.6 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α 和IL-6含量 實驗過程按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。統(tǒng)計結(jié)果采用均數(shù)±標準差（）表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對C28/I2軟骨細胞活性的影響 采用CCK-8法對不同濃度的芍藥苷對軟骨C28/I2細胞活力的影響進行檢測。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的軟骨細胞相比，芍藥苷小于25 μmol/L時，對細胞生長沒有影響；超過25 μmol/L時，細胞活性呈現(xiàn)下降趨勢。因此，25 μmol/L的芍藥苷為下一步實驗用藥濃度。

2.2 芍藥苷對IL-1β 引起的C28/I2軟骨細胞炎癥中自噬蛋白LC3和Beclin 1的影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組 細胞經(jīng)過IL-1β 處理后，細胞LC3 Ⅱ和Beclin 1蛋白明顯減低，表明炎癥時細胞的自噬能力降低；與模型組相比，IL-1β 處理后的細胞經(jīng)芍藥苷治療后，細胞LC3 Ⅱ和Beclin 1蛋白明顯增加，表明細胞自噬能力恢復(fù)（見圖1，表1）。

圖1 芍藥苷對軟骨細胞自噬功能的影響

表1 LC3 Ⅱ和Beclin 1蛋白分析統(tǒng)計結(jié)果（）

表1 LC3 Ⅱ和Beclin 1蛋白分析統(tǒng)計結(jié)果（）

注：實驗重復(fù)3次。與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，# P ＜0.05

2.3 芍藥苷對IL-1β 引起的C28/I2軟骨細胞炎癥中PI3K/AKT信號蛋白的影響 實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組細胞經(jīng)過IL-1β 處理后，細胞p-PI3K和p-AKT蛋白明顯增加；與模型組相比，IL-1β 處理后的細胞經(jīng)芍藥苷治療后，p-PI3K和p-AKT蛋白明顯降低；當(dāng)芍藥苷與3MA同時應(yīng)用，抑制了p-PI3K和p-AKT蛋白降低程度（見圖2，表2）。

圖2 芍藥苷對軟骨細胞PI3K/AKT信號蛋白影響

表2 p-PI3K和p-AKT蛋白分析統(tǒng)計結(jié)果（）

表2 p-PI3K和p-AKT蛋白分析統(tǒng)計結(jié)果（）

注：實驗重復(fù)3次。與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，# P ＜0.05

2.4 芍藥苷對IL-1β 引起的C28/I2軟骨細胞炎癥細胞上清液中TNF-α 和IL-6濃度的影響 與對照組相比，模型組細胞經(jīng)過IL-1β 處理后，細胞上清液中TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度明顯增加；與模型組相比，IL-1β 處理后的細胞經(jīng)芍藥苷治療后，TNF-α 和IL-6質(zhì)量濃度明顯降低；當(dāng)芍藥苷與3MA同時應(yīng)用，減弱了TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度降低程度。見表3。

表3 芍藥苷對軟骨細胞上清液中TNF-α 和IL-6質(zhì)量濃度的影響（）

表3 芍藥苷對軟骨細胞上清液中TNF-α 和IL-6質(zhì)量濃度的影響（）

注：與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨細胞病變是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為軟骨細胞損傷與凋亡[4]。自噬是細胞的一種自我保護機制，在細胞生命周期中發(fā)揮重要的生理功能。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中，細胞自噬能力降低，細胞清除自身衰老、受損及炎癥細胞內(nèi)容物的能力下降，導(dǎo)致細胞炎癥發(fā)展，出現(xiàn)軟骨細胞的受損及凋亡[5]。因此，恢復(fù)細胞自噬，增加自我修復(fù)的能力，可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的重要手段。

芍藥苷是中藥芍藥的主要藥效成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能減少IL-1β 處理的大鼠軟骨細胞中MMP的表達，抑制軟骨細胞中NF-κB的激活，減少軟骨細胞凋亡[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，由IL-1β 處理軟骨細胞，誘導(dǎo)軟骨炎癥發(fā)生時，細胞內(nèi)的自噬標志性蛋白LC3 Ⅱ和Beclin 1表達下降，與之前的研究一致[12]。經(jīng)過芍藥苷處理后，LC3 Ⅱ蛋白和Beclin 1蛋白表達增加，表明芍藥苷能夠增加關(guān)節(jié)炎時軟骨細胞的自噬能力，減少細胞損傷。同時結(jié)果還提示，芍藥苷可降低炎癥時TNF-α 和IL-6等炎癥細胞因子。

PI3K/AKT能夠調(diào)節(jié)眾多細胞內(nèi)信號級聯(lián)的激活，及多種炎癥介質(zhì)功能的發(fā)揮[13-14]。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中，抑制PI3K/AKT軸能夠防止關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的炎癥反應(yīng)、骨變性異常形成和軟骨細胞的衰老[15-16]。研究表明，PI3K/AKT信號通路對于細胞自噬發(fā)生起到重要作用[17]。有關(guān)骨關(guān)節(jié)炎的研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，炎癥可抑制大鼠軟骨細胞的增殖和細胞周期，降低自噬率。抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路可促進骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬，減輕炎癥反應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)：IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥時，PI3K/AKT信號被激活，促進炎癥的發(fā)展，與上述研究結(jié)果一致；經(jīng)過芍藥苷干預(yù)治療后，p-PI3K和p-AKT蛋白表達減低。應(yīng)用自噬抑制劑3MA后，部分拮抗p-PI3K和p-AKT蛋白的減少。這些結(jié)果表明，芍藥苷可通過抑制PI3K/AKT信號促進細胞自噬活力，減輕炎癥反應(yīng)，減少軟骨細胞的損傷，提示芍藥苷可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的有效藥物。