嚴(yán)光俊 許京 王瑞海 苗青 郭昌洪 張維 劉麗梅

蓼科酸模屬植物網(wǎng)果酸模RumexchalepensisMill.(又名紅絲酸模)的干燥根及根莖，地方臨床藥用稱之為金不換，始載于《中藥志》，主要分布在湖北、江西、河南、浙江及安徽等地[1-4]，其具有清熱解毒、通便、殺蟲(chóng)之功效，民間用于止血和治療痢疾[5]。

網(wǎng)果酸模為地方草藥，多為栽培品，有關(guān)網(wǎng)果酸?；瘜W(xué)成分報(bào)道較少[6-8]，有效成分報(bào)道僅有酸模素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等，有限的幾個(gè)成分很難全面概括或評(píng)價(jià)其質(zhì)量[9]。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，該技術(shù)已被廣泛用于中藥的質(zhì)量控制領(lǐng)域，因其可較全面地反映中藥材及植物藥產(chǎn)品的藥效學(xué)物質(zhì)特征，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性及一致性而受到國(guó)際的認(rèn)可[10-11]，目前，未見(jiàn)有網(wǎng)果酸模HPLC指紋圖譜相關(guān)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用中藥指紋圖譜技術(shù)，首次建立了網(wǎng)果酸模HPLC指紋圖譜，使用相似度對(duì)不同地塊、不同采收年限、不同采收季節(jié)網(wǎng)果酸模樣品進(jìn)行分析，為網(wǎng)果酸模質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100系列，包括G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315B DAD檢測(cè)器，HP化學(xué)工作站。Agilent Extend- C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫)，SB-5200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，CP2202S電子天平(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 藥物與試劑

大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：PS010712)、酸模素對(duì)照品(批號(hào)：PS170608-03)、大黃素對(duì)照品(批號(hào)：PS000259)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)：PS010475)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào)：PS000263)均購(gòu)自成都普思科技股份有限公司。大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：AF8032001)購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司。

乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(Fisher 公司)，其他試劑均為分析純，水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

16批網(wǎng)果酸模采自湖北省荊州市公安縣章莊鋪鎮(zhèn)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為網(wǎng)果酸模，去掉根莖殘基，根及根莖洗凈，切片，陰干，得其飲片。具體信息見(jiàn)表1。

表1 16批湖北省荊州市章莊鋪鎮(zhèn)網(wǎng)果酸模采樣信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，254 nm波長(zhǎng)處二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～40分鐘，35%→60%A；40～65分鐘，60%→95%A；65～70分鐘，95%→100%A)，流速1 mL/分鐘，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為5 μL，分析時(shí)間為70分鐘。該條件下得到的網(wǎng)果酸模指紋圖譜色譜峰多且分離度好。見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品2.08 mg、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品2.49 mg、大黃素甲醚對(duì)照品2.51 mg分別置于10 mL容量瓶中；酸模素對(duì)照品3.03 mg、大黃素對(duì)照品2.09 mg、大黃酚對(duì)照品2.61 mg分別于5 mL量瓶中，精密稱定，加適量二氯甲烷溶解，加甲醇分別制成每1 mL含大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、酸模素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為208 μg、249 μg、251 μg、606 μg、418 μg和522 μg的溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取網(wǎng)果酸模粉末(過(guò)50目篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，稱定重量，超聲1小時(shí)，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(S1)，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，以酸模素為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(S1)，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于 0、2、4、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣，以酸模素為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD均<5%，表明24 小時(shí)內(nèi)供試品溶液的成分是穩(wěn)定的。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(S1)，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以酸模素為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均<5%，表明重復(fù)性良好。

2.5 參照峰的選擇

酸模素色譜峰(4號(hào)峰)為所有樣品中共有，而且與相鄰峰分離度良好，出峰時(shí)間適中，峰面積較大，故選擇其作為參照峰。

2.6 網(wǎng)果酸模指紋圖譜的建立

2.6.1 相似度分析 將16批樣品以 AIA 格式依次導(dǎo)入至國(guó)家藥典委員會(huì) “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2008版” 軟件，以 S8 為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗口設(shè)置為0.10，經(jīng)多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜(圖2)，平均相似度為91.3%

2.6.2 共有峰標(biāo)定及化學(xué)成分指認(rèn) 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。將對(duì)照品、樣品的色譜峰保留時(shí)間及色譜圖進(jìn)行分析，指認(rèn)了其中6種成分，分別為大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷(2號(hào))、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷(3號(hào))、酸模素(6號(hào))、大黃素(8號(hào))、大黃酚(9號(hào))、大黃素甲醚(10號(hào))，具體見(jiàn)圖2。

圖1 網(wǎng)果酸模HPLC色譜圖

注： 2號(hào)峰:大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷;3號(hào)峰:大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷; 6號(hào)峰:酸模素;8號(hào)峰:大黃素;9號(hào)峰:大黃酚;10號(hào)峰:大黃素甲醚。

2.6.3 不同地塊樣品指紋圖譜分析 將“1號(hào)”“2號(hào)”“3號(hào)”地塊樣品以 AIA 格式依次導(dǎo)入至國(guó)家藥典委員會(huì) “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2008版”軟件，計(jì)算不同地塊網(wǎng)果酸模指紋圖譜相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同地塊網(wǎng)果酸模指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

2.6.4 不同生長(zhǎng)年限指紋圖譜分析 將1年生、 2年生、 3年生樣品以 AIA 格式依次導(dǎo)入至國(guó)家藥典委員會(huì) “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2008版”軟件，計(jì)算不同年限網(wǎng)果酸模指紋圖譜相似度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同年限網(wǎng)果酸模指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

2.6.5 不同采收季節(jié)樣品指紋圖譜分析 將春季、秋季樣品以 AIA 格式依次導(dǎo)入至國(guó)家藥典委員會(huì) “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2008版”軟件，計(jì)算不同采收季節(jié)網(wǎng)果酸模指紋圖譜相似度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同采收季節(jié)網(wǎng)果酸模指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

3 討論

通過(guò)對(duì)提取方法(超聲、回流提取)、不同的提取溶劑和提取時(shí)間的考察，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)確定了本節(jié)“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法。

通過(guò)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)的考察，發(fā)現(xiàn)本節(jié)“2.1”項(xiàng)下HPLC色譜條件下指紋圖譜信息量最大，且各色譜峰分離較好。

通過(guò)計(jì)算相似度并進(jìn)行分析，對(duì)比分析不同地塊、不同年限、不同采收季節(jié)的網(wǎng)果酸模HPLC指紋圖譜。結(jié)果顯示2號(hào)地塊相似度97.4%、3號(hào)地塊相似度94.2%、1號(hào)地塊相似度92.3%，盡管這三個(gè)地塊均在湖北省荊州市公安縣章莊鋪鎮(zhèn)，但三塊地指紋圖譜相似度還是有一定差異，說(shuō)明網(wǎng)果酸模生態(tài)環(huán)境影響其相似度。網(wǎng)果酸模隨生長(zhǎng)年限增加，共有峰減少，相似度呈減少趨勢(shì)，2年生相似度較低，可能與樣品量少有關(guān)；網(wǎng)果酸模春季采收其指紋圖譜相似度略高于秋季采收，說(shuō)明春季采挖對(duì)于保證其質(zhì)量更有利。

本實(shí)驗(yàn)建立了16批次網(wǎng)果酸模HPLC指紋圖譜，平均相似度>90%，不同地塊、不同年限、不同采收季節(jié)網(wǎng)果酸模HPLC指紋圖譜，雖有差異，但相似度均>90%。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)所建立網(wǎng)果酸模HPLC指紋圖譜可為網(wǎng)果酸模質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。