王文杰,余敏紅,范世珍,周新榮,于波海*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001;2.黑龍江省大慶市人民醫(yī)院;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院)

宮頸癌是全球嚴(yán)重威脅婦女健康的第四大惡性腫瘤。2012年，全世界宮頸癌新增病例約為528 000例，宮頸癌死亡人數(shù)為266 000人[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌的重要危險因素，其中99.0%的宮頸癌與HPV感染有關(guān)。目前已鑒定出100多種人乳頭瘤病毒類型。根據(jù)其致癌能力可分為高風(fēng)險和低風(fēng)險兩類。hrHPV包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和82[2]。約71%的宮頸癌與HPV16和HPV18感染有關(guān)。HPV的患病率和類型具有種族差異，在亞洲，HPV52和HPV58的感染更為常見[3]。hrHPV感染被認(rèn)為是宮頸癌及其前體病變的主要危險因素[4]。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，參與到基因調(diào)控過程中。DNA甲基化異常是導(dǎo)致腫瘤抑制基因功能失活和轉(zhuǎn)錄抑制的關(guān)鍵機(jī)制之一。DNA甲基化變化的積累與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。PAX1隸屬于配對盒基因家族，是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，PAX1通過調(diào)控細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞定向遷移等參與胚胎發(fā)育過程中重要器官的形成。性別決定區(qū)域 Y1(sexdeterming region Y-box1,SOX1)是編碼 SOX 家族轉(zhuǎn)錄因子中的一個成員，具有參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)以及決定細(xì)胞存亡的功能。研究表明，SOX1和PAX1基因基因啟動子區(qū)域甲基化普遍存在于中國女性宮頸癌患者中，在宮頸癌前病變階段，該基因啟動子甲基化是早期事件，宮頸癌組織中的甲基化顯著的高于正常組織，能夠?qū)⑦M(jìn)展為癌前病變的高危人群和正常人群加以區(qū)分，所以可作為宮頸癌早期診斷的特異性甲基化分子標(biāo)志物[5，6]。

國內(nèi)外已有研究表明SOX1和PAX1基因啟動子甲基化有望成為新型的檢測宮頸癌的分子生物標(biāo)志物。本研究檢測SOX1和PAX1基因啟動子甲基化在感染不同風(fēng)險HPV型別的患者中檢出率，探究SOX1和PAX1基因啟動子甲基化和不同風(fēng)險HPV型別的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象及標(biāo)本采集

本研究獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(福田)倫理委員會的批準(zhǔn)。研究對象為宮頸細(xì)胞學(xué)異常和/或?qū)m頸HPV異常，需要陰道鏡進(jìn)一步檢查的患者，且無子宮切除史，孕婦以及有泌尿系統(tǒng)腫瘤或泌尿系統(tǒng)感染的患者不納入本試驗。本次研究共收集宮頸脫落細(xì)胞樣本例數(shù)為324例。在婦科檢查室，患者在陰道鏡檢查前，醫(yī)生使用凱普公司的宮頸細(xì)胞采樣刷采集宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，并將取樣刷放入配套保存液中(粵潮械備20150018號)。

1.2 標(biāo)本處理

將樣本轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，采用凱普的核酸提取或純化試劑(粵穗械備20170053號)提取宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的DNA，按試劑盒說明書提供的方法操作。以上提取的DNA保存在-15℃以下。

1.3 HPV檢測

所有樣本的HPV檢測采用凱普37種人乳頭狀瘤病毒分型檢測試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)，共可以檢測37種HPV基因型(HPV6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、84)，其中HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68為14種HPV高危型別。

1.4 亞硫酸鹽修飾法

采用凱普的核酸提取或純化試劑(粵穗械備20181080號)對提取樣本DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理(模板DNA的濃度不低于200 ng)，按試劑盒說明書提供的方法操作。以上亞硫酸鹽修飾后的DNA保存在-15℃以下。

1.5 甲基化特異性聚合鏈反應(yīng)

反應(yīng)體系共20 μl，主要包括：2 × PCR reaction mix(promega，M5122)10 μl；SOX1基因上、下游引物各0.5 μl；PAX1基因上、下游引物各0.5 μl；內(nèi)參基因ACTB基因上、下游引物0.5 μl；SOX1基因、PAX1基因和內(nèi)參基因ACTB的探針各0.4 μl；純水3.4 μl；DNA聚合酶0.5 μl；模板(亞硫酸氫鹽修飾 DNA)1 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；然后95℃變性20 s，60℃退火及延伸30 s，共進(jìn)行45個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV型別與SOX1和PAX1基因甲基化檢出率的相關(guān)性

不同HPV型別中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率如表1所示。由結(jié)果可知，在感染最高風(fēng)險致癌型別HPV16/18患者中，SOX1和PAX1基因甲基化檢出率最高為54.9%；其次是感染非16/18 hrHPV患者中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率為24.0%；在感染其他型別HPV患者中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率為11.1%；在HPV檢測陰性患者中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率為2.2%。

表1 感染不同HPV型別患者中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率

2.2 HPV16/18陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率

HPV16/18陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率如表2所示。由結(jié)果可知，HPV16/18陽性的CIN3+患者的甲基化檢出率為86.0%，HPV16/18陽性的CIN2患者的甲基化檢出率為35%，HPV16/18陽性的病理正常/CIN1患者的甲基化檢出率為14.3%。

表2 HPV16/18陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率

2.3 非HPV16/18 hrHPV陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率

非HPV16/18 hrHPV陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率如表3所示。由結(jié)果可知，非HPV16/18 hrHPV陽性的CIN3+患者的甲基化檢出率為80.0%，非HPV16/18 hrHPV陽性的CIN2患者的甲基化檢出率為37%，非HPV16/18 hrHPV陽性的病理正常/CIN1患者的甲基化檢出率為5.3%。

表3 非HPV16/18 hrHPV陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率

2.4 其他HPV型別陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率

其他HPV型別陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率如表4所示。由結(jié)果可知，CIN3+的患者中未發(fā)現(xiàn)僅感染除14種hrHPV的其他HPV型別，而其他HPV型別陽性的CIN2患者的甲基化檢出率為33.3%，非其他HPV型別陽性的病理正常/CIN1患者的甲基化檢出率為6.7%。

表4 其他HPV型別陽性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率

2.5 HPV檢測陰性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率

HPV檢測陰性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率如表5所示。由結(jié)果可知，在病理正常/CIN1患者的甲基化檢出率為97.4%。存在5例CIN2的患者HPV檢測和甲基化檢測結(jié)果皆為陰性，1例CIN3+的患者HPV檢測和甲基化檢測結(jié)果皆為陰性。

表5 HPV檢測陰性的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率

3 討論

高危型HPV的持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要因素已得到公認(rèn)，所以以HPV為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于宮頸癌篩查。研究表明，不同hrHPV基因型別具有不同致病風(fēng)險。在世界范圍內(nèi)，大約70%的宮頸癌是由于HPV16和18持續(xù)性感染導(dǎo)致的。由于大部分HPV感染是一過性感染，在12個月內(nèi)90%的HPV感染能夠通過自身機(jī)體的免疫力自動清除，而HPV DNA檢測無法區(qū)別一過性感染和持續(xù)性感染，所以HPV DNA檢測的靈敏度較高，特異性較低。所以很多患者雖然HPV DNA檢測為陽性，但并未發(fā)生有臨床意義的宮頸病變。

特異性基因甲基化檢測是一種新的癌癥篩查策略，一個最佳的生物標(biāo)志物將有助于早期發(fā)現(xiàn)癌癥。研究發(fā)現(xiàn)PAX1、SOX1、ZNF582以及POU4F3等宮頸癌特異性甲基化基因在檢測CIN3+樣本具有較好的表現(xiàn)，宿主基因甲基化檢測CIN2或CIN3的敏感性在69%-74%之間，特異性在66%-82%之間顯示了其臨床價值[3,5-7]。

在本研究中，感染不同風(fēng)險HPV型別的患者的甲基化水平也是不一致的，隨HPV型別風(fēng)險的增大，其甲基化水平也是增加的。在感染高危型HPV16/18的患者的甲基化水平明顯高于其他12中高危HPV型別和其他低危HPV型別；HPV16/18陽性下SOX1和PAX1基因在病理陰性/CIN1的患者中的甲基化檢出率僅為14.3%。無論在HPV16/18陽性、非HPV16/18 hrHPV陽性或者其他型別HPV陽性下的不同級別宮頸病變者的甲基化檢出率也是隨病變級別的加深而增大。DNA甲基化是抑制外來DNA和病毒基因組入侵的一種常見的細(xì)胞防御機(jī)制。STEENBERGEN等人研究發(fā)現(xiàn)高危型HPV持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌及癌前病變的主要因素，且hr-HPV還能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生遺傳及表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致癌變[8]。所以在感染高風(fēng)險HPV型別的患者的甲基化水平是明顯高于低風(fēng)險HPV型別的患者，尤其是HPV16和/或18中。按照ASCCP在2014年制定的子宮頸癌篩查中期指南，建議HPV16和/或18陽性者可直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，而其他高危型別陽性者需根據(jù)細(xì)胞學(xué)而定，細(xì)胞學(xué)異常者直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，無異常者則1年后隨訪。如何利用特異性的分子標(biāo)志物將高度病變的人群識別，避免低風(fēng)險人群不必要的轉(zhuǎn)診導(dǎo)致過度診療，對HPV陽性人群的分流管理是HPV檢測作為初篩要面臨的棘手問題。將宿主基因甲基化分析與人乳頭瘤病毒基因檢測相結(jié)合似乎是宮頸癌篩查的一種新策略。宿主基因良好的特異性可以提高HPV陽性女性宮頸異常檢測的準(zhǔn)確性。