趙凌昆，譚九峰，崔萬里*，晉學(xué)飛*

(1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033)

腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是腎癌中最常見的亞型，約占70%[1]。因?yàn)閏cRCC對放、化療敏感性較差，故手術(shù)是ccRCC的主要治療手段[2]。但約30%的病人在術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[3]。雖然目前已有針對ccRCC的靶向治療和免疫治療，但預(yù)后仍不甚理想[4]。因此，探尋ccRCC進(jìn)展的分子機(jī)制，將有助于改善ccRCC患者的預(yù)后。微管相關(guān)蛋白Tau(MAPT)在細(xì)胞內(nèi)維持微管的穩(wěn)定，主要表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞中[5,6]。最近有研究表明，在某些惡性腫瘤中MAPT的異常表達(dá)可能與預(yù)后相關(guān)[7]。關(guān)于MAPT在腫瘤生物學(xué)中的作用尚不清楚。且目前國內(nèi)無相關(guān)MAPT在腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)中的數(shù)據(jù)。本研究擬通過TCGA數(shù)據(jù)庫和我院收集到的數(shù)據(jù)觀察MAPT在腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)中的表達(dá)情況，與臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及對預(yù)后的評估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料本次研究所納入對象分為癌癥圖譜(TCGA)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列。TCGA隊(duì)列患者資料從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://https://portal.gdc.cancer.gov/)中提取，包含RNA測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的ccRCC患者共525例，另有72例正常組織的數(shù)據(jù)作為對照。驗(yàn)證隊(duì)列患者為佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科2013年1月至2018年12月期間，腎透明細(xì)胞癌根治術(shù)標(biāo)本和對應(yīng)的癌旁正常腎組織標(biāo)本共79對。年齡35-82歲，平均年齡(60.5±12.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后病理證實(shí)為ccRCC；(2)臨床資料/隨訪資料完整；(3)RNA提取質(zhì)量合格。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其它惡性腫瘤；(2)曾接受過化療、靶向治療、免疫治療、中醫(yī)治療等抗腫瘤治療；(3)圍術(shù)期發(fā)生死亡。病理分期采用TNM分期(2010年AJCC發(fā)布)，并根據(jù)Fuhrman核分級進(jìn)行分級。本次研究通過佳木斯大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。兩隊(duì)列患者的基本信息見表1。

表1 TCGA隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列患者基本信息

1.3 復(fù)查與隨訪方法術(shù)后2年內(nèi)，每3個(gè)月復(fù)查1次；第3年起，每6個(gè)月復(fù)查一次。復(fù)查內(nèi)容包括血清腫瘤標(biāo)志物檢查、胸腹盆腔CT等。所有患者均實(shí)行門診或電話隨訪。終止時(shí)間定義為經(jīng)病理學(xué)診斷為復(fù)發(fā)、因腫瘤死亡，或隨訪滿60個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS(Ver 25.0 IBM，NY)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示，Studentt檢驗(yàn)，總生存率應(yīng)用Kaplan-Meier方法計(jì)算，組間比較應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)。以P<0.05定義為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MAPT的表達(dá)與病理資料的關(guān)系在TCGA隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中，MAPT在ccRCC組織中的表達(dá)均顯著高于正常組織(P<0.05)。分析MAPT的表達(dá)與病理因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在TCGA隊(duì)列中，MAPT的表達(dá)與病理T分期(pT)、AJCC分期、Fuhrman分級和是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)；在驗(yàn)證隊(duì)列中，MAPT的表達(dá)與T分期(pT)和AJCC分期顯著相關(guān)(P<0.05)，見圖1。

圖1 MAPT在TCGA和驗(yàn)證隊(duì)列中的表達(dá)(a-e：MAPT在TCGA隊(duì)列中，病理T分期、AJCC分期、核分級和是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的表達(dá)；f-h：MAPT在驗(yàn)證隊(duì)列中，病理T分期和AJCC分期中的表達(dá))

2.2 MAPT的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系根據(jù)ROC曲線計(jì)算MAPT的cut-off值，并據(jù)此將患者分為MAPT-High和MAPT-Low組。在TCGA隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中，MAPT-High組的總體生存率(Overall Survival，OS)均顯著高于MAPT-Low組(P<0.05)，見圖2。

圖2 MAPT的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系(a：TCGA隊(duì)列；b：驗(yàn)證隊(duì)列)

2.3 敲降MAPT可能會促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖和侵襲為了觀察MAPT對ccRCC細(xì)胞系生物學(xué)功能的影響，我們應(yīng)用shRNA對786-O和Caki-1兩種細(xì)胞系敲降，構(gòu)建MAPT敲降的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，用WB和qPCR進(jìn)行驗(yàn)證(圖3)，并檢測細(xì)胞增殖和侵襲的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降MAPT可以促進(jìn)786-O和Caki-1的增殖和侵襲(圖4)。

圖3 MAPT在細(xì)胞系中敲降結(jié)果(a：Western blot；b：qPCR)

圖4 MAPT敲降對細(xì)胞增殖和侵襲的影響(a、b：對細(xì)胞增值的影響；c、d：對細(xì)胞侵襲的影響)

3 討論

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫作為研究隊(duì)列，我院收治的ccRCC患者的標(biāo)本作為驗(yàn)證隊(duì)列，對腎透明細(xì)胞癌和癌旁正常腎組織中MAPT的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常腎組織中MAPT的表達(dá)很低，而在腫瘤組織中，隨著病理T分期提高，其表達(dá)也逐漸降低，這與Chen的研究結(jié)果相似[8]。這提示MAPT在ccRCC的發(fā)生和發(fā)展中可能也起到一定的作用。Chen等認(rèn)為，MAPT作為一種與缺氧相關(guān)的基因，在腫瘤發(fā)生后，由于腫瘤體積的快速增長，其乏氧的微環(huán)境可能激活了MAPT的表達(dá)。在最近的一項(xiàng)研究中，Brooks等利用一種基于34個(gè)基因的分類器(ClearCode34)，通過檢測ccRCC腫瘤組織中轉(zhuǎn)錄組，試圖對ccRCC患者的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估，這其中就包含MAPT基因[9]。

在本研究所納入的兩個(gè)隊(duì)列中(TCGA隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列)，根據(jù)MAPT的表達(dá)水平，將患者分為MAPT高表達(dá)組和低表達(dá)組，并對患者的預(yù)后進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)MAPT高表達(dá)的患者，預(yù)后顯著由于MAPT低表達(dá)患者。這提示MAPT的表達(dá)確實(shí)與預(yù)后相關(guān)。新近的幾項(xiàng)研究結(jié)果表明，在多種癌癥中，MAPT的低表達(dá)與對紫杉醇的抵抗有關(guān)[10-12]。故綜合本研究的結(jié)果，在臨床上是否可以根據(jù)MAPT的表達(dá)情況，來確定患者是否需要進(jìn)行輔助治療，或制定不同的輔助治療方案。

通過分析兩個(gè)隊(duì)列中MAPT的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，MAPT的表達(dá)與病理T分期和AJCC分期有關(guān)，腫瘤浸潤深度越深、分期越晚，MAPT的表達(dá)越低。然而關(guān)于MAPT在ccRCC細(xì)胞中的作用尚不明確。我們應(yīng)用786-O和Caki-1兩種ccRCC細(xì)胞系進(jìn)行了一系列功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降MAPT可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲。Yang等發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞系中敲降MAPT，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[13]，Li等在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[14]。這提示MAPT可能在ccRCC中起到抑癌的作用。

本研究的不足之處在于：本研究為回顧性研究，可能會存在患者的選擇偏倚，以及治療方案的不同，比如近年將酪氨酸激酶抑制劑應(yīng)用到ccRCC的輔助治療中之后，改善了ccRCC的生存率[15]。驗(yàn)證隊(duì)列中患者數(shù)量較少，導(dǎo)致各個(gè)分期中患者分布不均，pT4期和IV期患者較少，可能存在一定偏倚。本研究僅進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。