孔 瓊，袁盛勇，郭建偉，周銀麗，薛春麗，李 珣，羅武華

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自 661199)

【研究意義】野蠶豆根(CentrantheragrandifloraBenth)又名大花胡麻草、化血丹，是玄參科(Scrophulariaceae)胡麻草屬(Centranthera)多年生植物，分布海拔為500～1400 m的熱帶和亞熱帶地區(qū)，如越南、緬甸、印度，中國(guó)貴州、廣西、云南等地，其中云南的文山、紅河和屏邊等地都有分布[1]。全草均可入藥，其中根部入藥較為普遍，具有散瘀止血、消腫止痛、活血調(diào)經(jīng)等功效，在云南紅河州等地主要用于心血管疾病的防治[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雖然該藥主要是民間苗族用藥，但隨著國(guó)內(nèi)外消費(fèi)市場(chǎng)的需求，已經(jīng)供不應(yīng)求。自2014年以來，在云南屏邊已有野蠶豆根人工栽培的成功案例，隨著種植面積擴(kuò)大和種植年限延長(zhǎng)，多種病害也伴隨而來。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)野蠶豆根的研究?jī)H限于民間用藥、化學(xué)成分、藥效等方面[4-6]，有關(guān)病害種類、病原菌及防治方法均無相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者于2015-2017年在云南屏邊野蠶豆根種植基地田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該藥材在種植過程中常伴有白粉、霜霉、黑斑和根腐病害的發(fā)生，其中根腐病極為嚴(yán)重，對(duì)野蠶豆根的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重危害?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了指導(dǎo)野蠶豆根田間種植中的病害防治，在云南野蠶豆根主栽培區(qū)屏邊縣采集根腐病害樣品，進(jìn)行病原菌分離和鑒定，研究了病原菌的生物學(xué)特性，并對(duì)多種藥劑進(jìn)行室內(nèi)測(cè)定，以期為該病害的田間防治提供理論依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 病原菌鑒定

采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離，并用柯赫氏法則進(jìn)行致病性驗(yàn)證[7]。純化后的菌種，參照《植物病原真菌學(xué)》[8]和《鐮刀菌屬》[9]進(jìn)行種類鑒定。

1.2 病原菌生物學(xué)特性研究

采用在PSA平板上培養(yǎng)5 d的菌種進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)，其菌絲塊大小為5 mm×5 mm；培養(yǎng)條件為27 ℃恒溫暗培養(yǎng)(1.2.3和1.2.5除外)；培養(yǎng)基為PSA平板(1.2.1和1.2.2除外)。菌落直徑采用十字交叉法測(cè)定；產(chǎn)孢量測(cè)定：切取培養(yǎng)后4 mm×4 mm菌絲塊1塊，用2 mL無菌蒸餾水稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)量產(chǎn)孢量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPSv7.05進(jìn)行方差分析，再用Duncan法進(jìn)行多重比較，數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)根腐病病原菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量影響 將菌絲塊分別接入3種不同培養(yǎng)基(表2)，后置于27 ℃恒溫暗培養(yǎng)，5 d后測(cè)量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.2 不同碳氮源對(duì)根腐病病原菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響 以Czapek培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別用30 g葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源，配制成含不同碳源的培養(yǎng)基；同時(shí)分別用2 g的硝酸鉀、尿素、硝酸銨、硫酸銨作為氮源，配制成不同氮源的培養(yǎng)基。在上述不同培養(yǎng)基中接入菌絲塊，每個(gè)處理3次重復(fù)，5 d后測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.3 溫度對(duì)根腐病原孢子致死溫度、菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 菌絲生長(zhǎng)溫度范圍：將菌絲塊接種于PSA平板中央，于5、10、15、20、25、30、35 ℃溫箱中暗培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，5 d后測(cè)量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

孢子致死溫度：將配成的孢子懸浮液放入玻璃試管中于溫度為40、45、50、55、60 ℃的水浴鍋內(nèi)處理10 min，分別取1 滴孢子懸液于凹玻片上，快速風(fēng)干后于27 ℃恒溫保濕暗培養(yǎng)24 h后觀察孢子萌發(fā)情況。根據(jù)試驗(yàn)的具體情況，進(jìn)一步按l ℃梯度設(shè)計(jì)溫度，最終確定孢子的致死溫度。

1.2.4 pH對(duì)根腐病病原菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響 用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH將滅菌后的PSA平板pH值調(diào)為5、6、7、8、9、10、11、12，并在平板中央接入菌絲塊，每個(gè)處理重復(fù)3次，5 d后測(cè)量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.5 光周期對(duì)根腐病病原菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響 菌絲塊接入PSA平板中央，置于全光照、光暗交替(L/D=12 h/12h)、和全黑暗條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，5 d后測(cè)量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.6 不同濕度對(duì)根腐病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響 參考方中達(dá)的《植病研究方法》中小容器空氣濕度調(diào)節(jié)的方法[7]。在密閉容器中將相對(duì)濕度分別恒定在50 %、65 %、75 %、90 %和100 %，取1滴孢子懸液于無菌玻片上，快速風(fēng)干后于不同濕度下25 ℃恒溫暗培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 室內(nèi)藥劑篩選

將10種殺菌劑(表1)配制成含不同濃度的含藥固體PSA平板，接入菌絲塊，7 d后測(cè)量菌落直徑，設(shè)不含藥PSA為空白對(duì)照，3次重復(fù)，計(jì)算相對(duì)抑制率。

表1 10種供試藥劑

相對(duì)抑制率(%)=[(對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑)÷對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑]×100[10]所得經(jīng)Finney幾率分析法和DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，求出各殺菌劑的毒力回歸方程、EC50及相關(guān)系數(shù)(r)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

根腐病發(fā)生后，地上植株表現(xiàn)為萎蔫，最終枯死；地下根部變色，腐爛，無臭味。將分離后的菌種經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證后，證明編號(hào)為YCD-7菌種是引起野蠶豆根根腐的病原菌。該菌在PSA平板上生長(zhǎng)迅速，氣生菌絲薄絨狀，淺灰色至淡藍(lán)色，間有蒼綠色的分生孢子座，初看像青霉菌污染(圖1-A)；小型分生孢子多，呈卵圓形或腎形，無隔或偶有1隔，大小為10～20 μm×3.7～5 μm。大型分生孢子馬特形，壁厚，3～5隔，大小為27～50 μm×3.5～5.7 μm(圖1-B)；產(chǎn)孢細(xì)胞在菌絲上形成長(zhǎng)筒形單瓶梗，少分枝，大小為62～200 μm×3～4 μm(圖1-C)；大米培養(yǎng)物為玫紅色(圖1-D)。根據(jù)《植物病原真菌學(xué)》和《鐮刀菌屬》將該致病菌鑒定為茄病鐮孢藍(lán)色變種[Fusariumsolanivar.coeruleum(Sacc.)Booth]。

A：菌落形態(tài)；B：大、小型分生孢子；C：產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)； D：培養(yǎng)物在米飯培養(yǎng)基上的色澤 A: Colony morphology on PSA medium; B: Microconidia and macroconidia; C: Sporogenous structure; D: Color of pathogen on rice medium

2.2 病原菌生物學(xué)特性研究

2.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)根腐病病原菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量影響 不同基本培養(yǎng)基對(duì)野蠶豆根根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量具有不同的影響(表2)。其中查氏培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑最大，但與PSA和PDA的處理差異不顯著；而在PSA平板上的產(chǎn)孢量最大，為(2.86±0.03)× 107個(gè)/mL，與其他2種培養(yǎng)基的處理差異顯著。因此，PSA培養(yǎng)基適合野蠶豆根根腐病原茄病鐮孢藍(lán)色變種菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的增加。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)根腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

2.2.2 不同碳氮源對(duì)根腐病病原菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量影響 在供試的4種碳源中，以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)最快(表3)，菌落直徑最大為(7.10±0.05)cm，其次為乳糖和可溶性淀粉，但3者間差異不顯著；產(chǎn)孢量以麥芽糖為碳源的處理最佳為(2.42±0.03)× 107個(gè)/mL，與以可溶性淀粉為碳源的處理差異不顯著，但2者顯著高于葡萄糖和乳糖的處理。綜合考慮，適合茄病鐮孢藍(lán)色變種病原菌的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量增加的碳源為可溶性淀粉。

表3 不同碳氮源對(duì)野蠶豆根根腐病原菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

野蠶豆根根腐病原茄病鐮孢藍(lán)色變種菌對(duì)供試的4種氮源利用有一定的差異(表3)。適合病原菌菌絲生長(zhǎng)的氮源為硝酸鉀，菌落直徑為(7.13±0.08)cm，其次為硝酸銨和硫酸銨，最差為尿素；而適合產(chǎn)孢的氮源為硫酸銨，產(chǎn)孢量最大為(2.49±0.02)× 107個(gè)/mL，顯著高于其他3種氮源。

2.2.3 溫度對(duì)根腐病原孢子致死溫度、菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 病原菌在40、45、50 ℃水浴10 min均能萌發(fā)，但在55、60 ℃處理10 min后孢子不能萌發(fā)，因此在50～55 ℃間將溫度梯度縮小為1 ℃，結(jié)果以55 ℃水浴10 min孢子不能萌發(fā)，說明該菌的孢子致死溫度為55 ℃、10 min。

由表4可知，在處理的7個(gè)溫度條件下，25 ℃處理下野蠶豆根根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑最大為(6.72±0.24)cm，顯著高于其他6個(gè)處理；同時(shí)產(chǎn)孢量也達(dá)到最高，顯著高于其他處理。但該菌在低溫條件下，生長(zhǎng)速度較慢，在5 ℃時(shí)，菌絲不生長(zhǎng)和不產(chǎn)孢。野蠶豆根根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢適合的溫度范圍25～30 ℃。

表4 不同溫度對(duì)根腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

2.2.4 pH對(duì)根腐病病原菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量影響 從表5可知，茄病鐮孢藍(lán)色變種菌對(duì)酸堿度有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。以pH 8時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最好，菌絲直徑最大，為(7.38±0.08)cm，顯著高于其他處理，其次是pH 7的處理。相似的結(jié)果也表現(xiàn)于產(chǎn)孢量測(cè)定中。因此，pH 7～8是適合茄病鐮孢藍(lán)色變種菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的條件。

表5 不同pH值對(duì)野蠶豆根根腐病原菌菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

2.2.5 光周期對(duì)根腐病病原菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量影響 由表6可看出，茄病鐮孢藍(lán)色變種菌在3種不同光照條件下，菌落直徑差異不顯著；但對(duì)產(chǎn)孢有一定的影響，其中連續(xù)光照處理下的產(chǎn)孢量顯著高于其他2種光周期處理。所以連續(xù)光照有利于病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。

表6 不同光周期對(duì)根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

2.2.6 不同濕度對(duì)根腐病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響 濕度對(duì)野蠶豆根根腐病病原菌茄病鐮孢藍(lán)色變種的分生孢子萌發(fā)率的影響較大，各處理間的孢子萌發(fā)率差異顯著，孢子萌發(fā)率與相對(duì)濕度呈正相關(guān)(圖2)。分生孢子在相對(duì)濕度≥50 %時(shí)均能萌發(fā)，且當(dāng)濕度為100 %時(shí)，分生孢子萌發(fā)率最高為(92.33±2.52) %，顯著高于其他處理。

圖2 不同濕度對(duì)根腐病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of different humidity on conidia germination of Fusarium solani var.coeruleum

2.3 室內(nèi)藥劑篩選

通過菌絲生長(zhǎng)抑制率法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)10種殺菌劑對(duì)野蠶豆根根腐病原菌的抑制效果各不相同(表7)。其中尚果乳油和應(yīng)得懸浮劑的抑制效果較好，其抑菌百分率分別為83.78 %和82.82 %，其EC50低于150 μg/mL，分別為100.94 和126.99 μg/mL；其次為撲海因可濕性粉劑、灰滅可濕性粉劑、甲基托布津可濕性粉劑和靈動(dòng)水分散粒劑，EC50分別為204.39、231.58、257.79和284.31 μg/mL；效果最差為翠貝，EC50為367.57 μg/mL。

表7 10種藥劑對(duì)野蠶豆根根腐病原菌的抑制效果

3 討 論

根腐病是一種危害極大的土傳病害，其病原主要有細(xì)菌、真菌和線蟲，其中真菌引起的根腐病占2/3，主要有鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、輪枝孢屬(Verticilliumsp.)、絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)、疫霉屬(Phytophthorasp.)、角擔(dān)菌(Ceratobasidiumsp．)和球殼孢屬(Macrophominasp.)等真菌，其中由各種鐮刀菌引起的根腐病危害極大[11-14]。根據(jù)野蠶豆根的根腐病病原菌采集和病原分離鑒定，確定為茄病鐮孢藍(lán)色變種[Fusariumsolanivar.coeruleum(Sacc.)Booth]。通過對(duì)野蠶豆根根腐病致病菌菌株YCD-7的生物學(xué)特性觀察，適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基種類較多，在所測(cè)試的3種培養(yǎng)基中，PSA為最佳培養(yǎng)基，相似結(jié)果也表現(xiàn)于由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysprum)引起的白術(shù)根腐病中[15]。同時(shí)該菌生長(zhǎng)的溫度范圍較廣，最適溫度為25 ℃；生長(zhǎng)pH范圍也廣，最適為pH 7～8；對(duì)多種碳源均能利用，菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適碳源為可溶性淀粉；對(duì)多種無機(jī)氮源也能利用，而菌落擴(kuò)展的最適氮源是硝酸鉀，產(chǎn)孢最適氮源為硫酸銨；菌絲在連續(xù)光照下生長(zhǎng)最快，產(chǎn)孢量最高；分生孢子萌發(fā)需要在高濕條件下，濕度越高，萌發(fā)率越高，其致死溫度為55 ℃、10 min。病原的生物學(xué)特性與野蠶豆根根腐病易在屏邊種植基地常年發(fā)生有關(guān)，且多發(fā)于多雨夏季的6-8月。

菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定10種殺菌劑對(duì)野蠶豆根腐病原菌的室內(nèi)抑制效果，差異較大，其中尚果乳油(氟硅唑)、應(yīng)得懸浮劑(腈苯唑)和撲海因可濕性粉劑(異菌脲)的抑制效果較好，其EC50分別為100.94、126.99 和204.39 μg/mL，且前2種藥劑都屬于三唑類殺菌劑，而撲海因?qū)儆诙柞啺奉?。大量研究發(fā)現(xiàn)三唑類農(nóng)藥對(duì)鐮刀菌具有很好的抑制效果，如對(duì)葫蘆砧木萎蔫病(Fusariumsolani)具有較好抑制效果的20 %硅唑·咪鮮胺水乳劑；抑制草莓枯萎病(F.oxysporum)的有效藥劑25 %腈菌唑乳油；能明顯抑制馬鈴薯枯萎病(F.oxysporum)的75 %肟菌·戊唑醇乳油[16-18]。甲氧基丙烯酸酯類的吡唑醚菌酯和嘧菌酯、吡啶基乙基苯甲酰胺類的氟吡菌酰胺很少用于該屬病害的防治，這些藥劑常用于灰霉病(Botrytiscinema)、白粉病(Erysiphesp.)和番茄漆斑病(Myrotheciumroridum)的防治中[19-20]。因此在田間藥效防治試驗(yàn)之前，有必要進(jìn)行病害病原菌鑒定和室內(nèi)藥劑篩選準(zhǔn)備。

上述結(jié)果表明野蠶豆根根腐病原茄病鐮孢藍(lán)色變種的適應(yīng)性強(qiáng)，能夠利用多種碳氮源，生長(zhǎng)和存活的溫度及酸堿范圍較廣，喜中性偏堿性環(huán)境，高溫高濕條件有利于該病的發(fā)生。因此在野蠶豆根種植過程中，可通過改變?cè)耘喹h(huán)境、合理施肥、輪作或化學(xué)防治等方法來抑制病原菌的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢，從而減輕該病的發(fā)生。如選擇地勢(shì)較高的地塊進(jìn)行種植，有利于排水；選擇酸性肥料進(jìn)行施肥，以改善土壤的酸堿環(huán)境；也可在雨季來臨之前用防效好的藥劑進(jìn)行灌根或噴霧等。

4 結(jié) 論

通過形態(tài)學(xué)、病害癥狀觀察和柯赫氏法則，確定野蠶豆根根腐的致病菌是茄病鐮孢藍(lán)色變種Fusariumsolanivar.coeruleum，本論文是首次關(guān)于野蠶豆根根腐病的報(bào)道；同時(shí)獲得了影響該菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類和環(huán)境因素，菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適合碳源為可溶性淀粉，最適合溫度為25 ℃，最適pH為7～8，濕度對(duì)孢子萌發(fā)影響較大；室內(nèi)藥劑篩選出400 g/L氟硅唑、24 %腈苯唑和50 %異菌脲對(duì)野蠶豆根根腐病病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，可作為防治該病害的化學(xué)殺菌劑。