李正風(fēng)，鐘 莉，朱 杰，唐 麗，吳 濤，廖頭根，夏玉珍，楊利擎

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,云南 昆明 650231；2.紅云紅河(集團(tuán))有限責(zé)任公司,云南 彌勒 652300;3.紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100；4.北京微普聯(lián)合生物科技有限公司，北京 102200)

【研究意義】土壤是優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)系統(tǒng)工程的基礎(chǔ)，是影響煙葉質(zhì)量的重要環(huán)境因素[1]。不同質(zhì)地土壤的理化性狀有顯著差異，土壤機(jī)械組成、通透性、水分、溫度和養(yǎng)分狀況與煙葉生長發(fā)育和風(fēng)格特色有著密切關(guān)系[2]。在煙葉種植過程中，植煙土壤由于長期使用化肥，導(dǎo)致土層板結(jié)，肥力下降，土壤微生物多樣性減少，將嚴(yán)重影響煙葉品質(zhì)[3-5]。如符菁等研究表明土壤施用復(fù)合微生物菌肥、光合菌劑均能提高土壤的酶活性[6]。所以，植煙土壤改良已受到煙草科研工作者們的高度關(guān)注?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，通過改良植煙土壤來提高煙葉產(chǎn)量及品質(zhì)的研究主要集中在耕作方式、土壤改良劑添加、不同肥料施用等對土壤肥力的改變方面 ，而有關(guān)煙草生產(chǎn)各階段的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化以及土壤理化參數(shù)、肥力效果與微生物群落結(jié)構(gòu)間的動(dòng)態(tài)變化機(jī)制等還未進(jìn)行系統(tǒng)深入研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要是以真菌的形態(tài)、生長以及生理生化等特征為依據(jù)。然而真菌的種類繁多，個(gè)體多態(tài)性不明顯，個(gè)體的生長、生理生化特征也會(huì)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定。因此，采用傳統(tǒng)的方法對真菌進(jìn)行正確的分類存在較大的困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer,ITS)高通量測序已被廣泛的應(yīng)用于真菌分類鑒定中[7-9]。ITS包含ITS1和ITS2兩種，ITS1位于真核生物核糖體rDNA序列的18S和5.8S之間，ITS2位于真核生物核糖體rDNA序列5.8S和28S之間，屬于中度保守的區(qū)域，利用它可將真菌歸類到種或亞種水平。而利用IonS5TMXL測序平臺對ITS1或ITS2區(qū)進(jìn)行單端測序，具有更長的讀長、利于鑒定低豐度群落物種，且費(fèi)用低，是研究真菌群落多樣性的首選之策?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用高通量測序技術(shù)，對云南7個(gè)地區(qū)不同肥力土壤中的真菌群落在煙草生長不同階段的演替特征進(jìn)行分析，并對土壤理化指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)規(guī)律進(jìn)行探究，以期為植煙土壤、肥料的選擇以及病害防治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在云南省7個(gè)縣(市)(昆明市宜良縣、玉溪市華寧縣、紅河州彌勒縣、玉溪市新平縣、曲靖市陸良縣、大理州南澗縣、楚雄州楚雄市)，對植煙前(2018年3月)、團(tuán)棵期(2018年5月)、成熟期(2018年6月)、成熟期(2018年9月)4個(gè)階段不同肥力的根際土壤采用“S”形取樣法，在每個(gè)采樣區(qū)隨機(jī)采集5個(gè)不同位點(diǎn)的土壤樣品(表1)，等量混合后作為該單元的代表性樣品。煙葉生長不同時(shí)期采集土壤樣品時(shí)保持與上一次采樣相同的地點(diǎn)進(jìn)行。采集0～20 cm深的土壤，用PVC管進(jìn)行打孔取樣，可以保證每個(gè)點(diǎn)的取樣深度和重量保持一致。每個(gè)采樣單元采集大約取1 kg左右土樣，如果采集樣品太多，用“四分法”棄去多余土壤，最后用無菌自封袋包裝，于-20 ℃保存，并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

表1 土壤采樣信息

1.2 理化參數(shù)的測定

在煙草不同生長時(shí)期(植煙前、團(tuán)棵期、旺長期、成熟期)均采用多點(diǎn)取樣法采集不同層次的土壤樣品。將所采土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后自然風(fēng)干，室溫保存，用于檢測土壤樣品的理化性質(zhì)(包括土壤酸堿度pH值、電導(dǎo)率EC值、速效氮、速效磷、速效鉀、總碳、總氮、有機(jī)碳、有機(jī)氮)。其中pH值采用pH計(jì)法(水土質(zhì)量比2.5∶1)測定，電導(dǎo)率EC值由EC計(jì)測定(水土質(zhì)量比2∶1)，速效氮、速效磷、速效鉀的測定分別采用堿解擴(kuò)散法、碳酸氫鈉法和醋酸銨法，總碳、總氮、有機(jī)碳、有機(jī)氮含量用元素分析儀測定。

1.3 DNA提取和高通量測序

采用MP FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒對土壤樣本的基因組DNA進(jìn)行提取。取適量樣品DNA于離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ng/μl，使用帶Barcode的特異性引物ITS5-1737F(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS2-2043R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)進(jìn)行真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS,Internal Transcribed Spacer)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后將PCR產(chǎn)物送至諾禾致源生物信息科技有限公司，利用Thermo Fisher Scientific的Ion S5 XL進(jìn)行單端測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

使用Cutadapt軟件[10]過濾和按Barcode拆分樣本后，通過UCHIME與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對檢測嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse方法進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類[11]，對每個(gè)OTU代表序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

對標(biāo)準(zhǔn)化后的樣本相對豐度和物種數(shù)進(jìn)行計(jì)算。為進(jìn)一步探究分組樣品間的群落結(jié)構(gòu)差異，使用ANOSIM分析方法對分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，通過NMDS降維圖展示群落結(jié)構(gòu)差異，并選用LEfSe算法計(jì)算各組中差異類群的LDA分值，對差異最顯著的類群(LDA分值大于4)進(jìn)行研究。使用RDA分析探索群落組成與環(huán)境因子之間的關(guān)系，并由向前選擇(Forward Selection)得到顯著影響群落變化的環(huán)境影響因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 植煙前后土壤理化指標(biāo)的變化

由表2可見，植煙前土壤的pH值多在4.5～5.5，團(tuán)棵期較植煙前的pH值有所升高，達(dá)到煙草生長最適范圍(pH5.5～6.5)，pH值的變化與肥料的施用有一定關(guān)系。土壤電導(dǎo)率呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(表2)。云南植煙土壤速效氮含量處于豐富水平，除新平土壤速效氮水平在適宜烤煙生產(chǎn)范圍(45～135 mg/kg)內(nèi)，其他地區(qū)都偏高。各地區(qū)速效磷分布不均，玉溪、陸良、昆明3地較適宜烤煙生產(chǎn)范圍(10～35 mg/kg)偏高，其他地區(qū)都在適宜的范圍內(nèi)。多數(shù)地區(qū)速效鉀含量高于適宜烤煙生產(chǎn)范圍(120～200 mg/kg)，只有新平、玉溪兩地在適宜范圍內(nèi)。楚雄和南澗土壤中的總碳、總氮、有機(jī)碳、有機(jī)氮含量都較其他地區(qū)高。

表2 各階段土壤理化指標(biāo)

2.2 植煙前后土壤真菌群落組成的變化

植煙前(3月)，土壤真菌群落相對豐度高的科是叢赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、Plectosphaerellaceae科、麥角菌科(Clavicipitaceae)、曲霉科(Aspergillaceae)(圖1-A)。植煙前土壤中，相對豐度高的真菌屬是鐮刀菌屬(Fusarium)、枝孢屬(Cladosporium)、青霉菌屬(Penicillium)、小不整球殼屬(Plectosphaerella)、被孢霉屬(Mortierella)等(圖1-B)。

A為豐度最高的10個(gè)科；B為豐度最高的10個(gè)屬。下同A is the 10 families with the highest abundance; B is the 10 genera with the highest abundance.The same as below

團(tuán)棵期(5月)土壤真菌群落，相對豐度高的是叢赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、白蘑科(Tricholomataceae)、曲霉科(Aspergillaceae)等(圖2-A)，相對豐度高的屬是鐮刀菌屬(Fusarium)、香蘑屬(Lepista)、被孢霉屬(Mortierella)、鏈格孢屬(Alternaria)等(圖2-B)。

圖2 團(tuán)棵期土壤真菌優(yōu)勢類群Fig.2 The most abundant fungal taxa in the soil during rosette stage

旺長期(6月)，土壤真菌群落相對豐度高的科是叢赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、Trimorphomycetaceae科、毛殼菌科(Chaetomiaceae)等(圖3-A)，相對豐度高的屬是鐮刀菌屬(Fusarium)和Saitozyma屬等(圖3-B)。

圖3 旺長期土壤真菌優(yōu)勢類群Fig.3 The most abundant fungal taxa in the soil during vigorous growing stage

成熟期(9月)，土壤真菌群落相對豐度高的科是叢赤殼科(Nectriaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)、Trimorphomycetaceae科、暗球腔菌科(Phaeosphaeriaceae)等(圖4-A)，相對豐度高的屬是鐮刀菌屬(Fusarium)、Saitozyma屬、Setophoma屬、被孢霉屬(Mortierella)、錐蓋傘屬(Conocybe)等(圖4-B)。

圖4 成熟期土壤真菌優(yōu)勢類群Fig.4 The most abundant fungal taxa in the soil during mature stage

對植煙前及植煙后煙葉生長的3個(gè)階段土壤真菌群落組成進(jìn)行了比較分析，4個(gè)階段土壤中真菌群落組成具有顯著差異(表3)，其中植煙前與植煙后3個(gè)階段土壤真菌群落組成的差異最為顯著，旺長期與成熟期植煙土壤真菌群落組成差異最小(圖5,表3)。

表3 不同階段土壤真菌群落組成差異的ANOSIM分析結(jié)果

圖5 不同階段土壤樣品中真菌群落MDS圖Fig.5 MDS plot of fungal communities in the soil in different stages

LDA分析顯示，植煙前，隸屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)、煤炱目(Capnodiales)、枝孢霉屬(Cladosporium)的致病菌Cladosporiumchasmanthicola和小叢殼目(Glomerellales)、Plectosphaerellaceae科、小不整球殼屬(Plectosphaerella)的Plectosphaerellacucumerina豐度顯著高于植煙后的各個(gè)階段(圖6-A)。在植煙后的團(tuán)棵期，植煙土壤中白蘑科(Tricholomataceae)、香蘑屬(Lepista)的花臉香蘑(Lepistasordida)和格孢腔菌科(Pleosporaceae)的鏈格孢屬(Alternaria)具有顯著優(yōu)勢(圖6-A、B)，但花臉香蘑(Lepistasordida)僅在昆明低肥力土壤中大量出現(xiàn)。在旺長期土壤中叢赤殼科(Nectriaceae)的鐮刀菌屬(Fusarium)具有顯著優(yōu)勢(圖6-A、B)。到了成熟期，糞銹傘科(Bolbitiaceae)、錐蓋傘屬(Conocybe)的大孢錐蓋傘(Conocybemacrospora)以及叢赤殼科(Nectriaceae)、鐮刀菌屬(Fusarium)的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)相比于其他3個(gè)階段具有顯著優(yōu)勢(圖6-A、B)，大孢錐蓋傘(Conocybemacrospora)僅在楚雄中等肥力土壤中大量出現(xiàn)。

不同階段不同地區(qū)土壤中的真菌物種數(shù)通過比較顯示，昆明土壤中的物種數(shù)較高，新平土壤中的物種數(shù)較低(圖7)。

A：植煙前；B：團(tuán)棵期；C：旺長期；D：成熟期。KM:昆明；YX:玉溪；CX:楚雄；LL:陸良；ML:彌勒；NJ:南澗；XP:新平A: Pre-planting stage; B: Rosette stage; C: Vigorous growing stage; D: Mature stage.KM:Kunming; YX:Yuxi; CX:Chuxiong; LL:Luliang; ML:Mile; NJ:Nanjian; XP:Xinping

2.3 真菌群落與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過RDA分析的向前選擇確定土壤真菌群落的差異主要與土壤速效磷(AP)、有機(jī)氮(ON)含量以及土壤墑情(SM)有關(guān)。從不同階段土壤真菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系來看，植煙前和團(tuán)棵期土壤中的有機(jī)氮和速效磷含量較高，土壤墑情較低，到了旺長期和成熟期，土壤有機(jī)氮和速效磷含量有所下降，土壤墑情有所升高，這顯著影響了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)(圖8)。

圖8 土壤真菌群落與環(huán)境因子的RDA分析圖Fig.8 RDA plot analysis of the relationship between the fungal communities in the soil and environmental factors

3 討 論

土壤真菌群落的差異主要與土壤中的速效磷、有機(jī)氮含量以及土壤墑情有關(guān)。從不同階段來看，植煙前和團(tuán)棵期土壤有機(jī)氮含量較高，到了旺長期和成熟期有所下降；土壤速效磷在旺長期最高，成熟期最低。土壤有機(jī)氮含量的變化趨勢主要與土壤施肥的時(shí)間有關(guān)，而土壤速效磷含量在旺長期升高很可能與土壤中解磷菌的作用有關(guān)。土壤墑情在旺長期和成熟期明顯高于植煙前和團(tuán)棵期，這與降水量有很大關(guān)系，云南省降水量一般在6-8月達(dá)全年最大。

各地區(qū)的土壤中優(yōu)勢真菌類群有所不同，但是病害菌——鐮刀菌屬(Fusarium)在各地區(qū)都是豐度最高的屬。鐮刀菌是一類世界性分布的真菌，可引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等多種病害，能侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導(dǎo)組織維管束，并在生長發(fā)育代謝過程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產(chǎn)量和品質(zhì)，是生產(chǎn)上防治最艱難的重要病害之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬在各地?zé)煵莞H土壤中的相對豐度與土壤肥力沒有明顯的相關(guān)性，高肥力和低肥力地區(qū)土壤中均有豐度較高的情況，但各地土壤中在煙草旺長期該屬的豐度是最高的，因此煙葉旺長期是防治這類病害的最重要時(shí)期。

在不同階段，土壤中的真菌群落組成以及主要病害種類均發(fā)生明顯的變化。枝孢屬(Cladosporium)的Cladosporiumchasmanthicola在植煙前土壤中的豐度顯著高于植煙后的各階段，如昆明、楚雄、陸良植煙前的土壤中。Plectosphaerellacucumerina的豐度也高于植煙后各階段，如彌勒煙區(qū)該類群豐度均較高。Plectosphaerellacucumerina可侵染黃瓜、甜瓜、番茄、煙草等多種經(jīng)濟(jì)作物，導(dǎo)致果實(shí)、根、莖部的腐爛[13-14]。因此對該種病害要做好預(yù)防工作。在植煙后的團(tuán)棵期，植煙土壤中的花臉香蘑(Lepistasordida)和鏈格孢屬(Alternaria)為優(yōu)勢類群，其中花臉香蘑(Lepistasordida)僅在昆明低肥力土壤中大量出現(xiàn)，鏈格孢屬(Alternaria)在團(tuán)棵期玉溪高肥力土壤、南澗低肥力土壤以及新平中等肥力土壤中豐度較高。鏈格孢屬(Alternaria)真菌具有發(fā)生種類較多，寄主范圍較廣，適應(yīng)性較強(qiáng)等特點(diǎn)，大多數(shù)種類兼性寄生于植物上，引起多種經(jīng)濟(jì)植物病害。如Alternariaalternata可使煙草產(chǎn)生赤星病，是煙葉成熟期易發(fā)生的葉斑病，在云南赤星病發(fā)生面積達(dá)4萬km2左右，對煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量造成較大影響。在云南煙葉旺長期煙草根際土中篩到一株Alternariaalternata真菌，這種真菌在云南植煙土壤中有較高的豐度，要加以重點(diǎn)防治。對赤星病可通過合理施肥、肥水調(diào)均、保持株間通風(fēng)透光等措施預(yù)防和減輕其危害煙葉。在成熟期大孢錐蓋傘(Conocybemacrospora)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是優(yōu)勢類群，大孢錐蓋傘(Conocybemacrospora)僅在楚雄煙葉成熟期的中等肥力土壤中大量出現(xiàn)，在煙葉成熟期昆明、玉溪、楚雄土壤中尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)豐度較高。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是煙草根腐病的致病菌，煙葉獲取營養(yǎng)物質(zhì)的源頭和通道是煙草的根莖部分，而根莖病害的發(fā)生會(huì)嚴(yán)重影響煙草品質(zhì)和產(chǎn)量，單一方法很難達(dá)到好的防治效果，要根據(jù)植煙地情況，科學(xué)協(xié)調(diào)農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治措施，才能取得經(jīng)濟(jì)、有效的防治效果[15]。

在玉溪植煙前和團(tuán)棵期的低肥力土壤和楚雄植煙前、團(tuán)棵期和旺長期的低肥力土壤中青霉菌屬(Penicillium)真菌都有較高的豐度，主要有草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)等，研究表明草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)菌株能夠依靠自身的代謝產(chǎn)物溶解土壤中的難溶無機(jī)磷，在磷素的轉(zhuǎn)化中起著非常重要的作用[16-17]。在煙葉團(tuán)棵期，新平、玉溪2地高肥力土壤中有大量的被孢霉屬(Mortierella)真菌，是土壤中的腐生性真菌，主要分布在植物根面上，對植物不具有致病性，其豐度隨植物的生長逐漸上升，在植物營養(yǎng)生長高峰期活性最強(qiáng)，對纖維素、半纖維素、果膠物質(zhì)等起分解作用，但也有研究表明被孢霉屬(Mortierella)在染黑脛病的煙草根際土中豐度上升[18]。青霉菌屬(Penicillium)、被孢霉屬(Mortierella)與木霉屬(Trichoderma)、毛霉屬(Mucor)同為在植物根系上生長的常見生態(tài)類群，這些真菌可通過產(chǎn)生抗生素、營養(yǎng)競爭、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式來防治病害或抑制病原，對維持健康的植煙土壤環(huán)境有重要作用。

4 結(jié) 論

本研究分析了云南7個(gè)地區(qū)植煙地不同肥力土壤，煙株生長的4個(gè)階段真菌群落動(dòng)態(tài)及土壤理化指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系。通過研究顯示，不同時(shí)期土壤真菌群落組成有顯著變化，植煙前與植煙后各階段的差異最為顯著，真菌群落的演替與土壤速效磷、有機(jī)氮、墑情等密切相關(guān)。植煙土壤中真菌種類昆明土壤始終較高，而新平土壤始終較低。在不同階段，Alternaria屬、鐮刀菌屬(Fusarium)、Plectosphaerellacucumerina、Cladosporiumchasmanthicola、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等的豐度具其優(yōu)勢真菌類群有顯著差異。該項(xiàng)研究結(jié)果可為煙草種植土壤、肥料的選擇以及病害防治提供借鑒。