徐光沛，楊 睿，章萬(wàn)君，吳書(shū)卉，朱 蕓，韓春楊，劉翠艷 *

(1.獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

【研究意義】寒冷是一種重要的環(huán)境應(yīng)激原。在畜禽養(yǎng)殖上，春冬季節(jié)防寒保暖難以得到有效保障，特別是北方高寒地區(qū)晝夜溫差大，冷應(yīng)激更加無(wú)法避免。冷應(yīng)激可引起動(dòng)物機(jī)體免疫力下降[1]、能量代謝紊亂、抗氧化功能受損[2]，影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能、繁殖性能，降低畜產(chǎn)品的質(zhì)量甚至死亡[3]，是制約畜牧生產(chǎn)發(fā)展的重要因素之一[4-5]。因此，研究急性冷應(yīng)激的致病特點(diǎn)、開(kāi)發(fā)具有提高抗冷應(yīng)激能力的藥物，對(duì)于防治冷應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損害及其引發(fā)的多種疾病、保障畜禽的健康具有重要意義[6]。研究表明，中藥可以提高機(jī)體冷適應(yīng)能力，調(diào)節(jié)低溫條件下機(jī)體特異和非特異性免疫功能，增強(qiáng)抗寒能力和加速冷適應(yīng)的建立[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】王娜等[6]將附子、當(dāng)歸、黃芪、五味子等中藥飼喂雛雞發(fā)現(xiàn)能提高冷應(yīng)激狀態(tài)下雛雞的免疫水平和抗氧化能力；楊鳳微[8]等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中藥水提液(附子、黃芪、五味子)可顯著提高慢性冷應(yīng)激狀態(tài)下雛雞的抗氧化能力和白細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)典方劑麻黃湯出自張仲景的《傷寒論》，由麻黃、杏仁、桂枝、甘草組成，主治外感風(fēng)寒表實(shí)證?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用表明，麻黃湯可以抗流行性感冒、急性支氣管炎、支氣管哮喘等[9-10]；藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，麻黃湯具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏作用[11-14]，能顯著提升寒冷應(yīng)激小鼠的免疫功能[15]。【本研究切入點(diǎn)】麻黃湯對(duì)動(dòng)物冷應(yīng)激的防治效果及對(duì)急性冷應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物生理、生化指標(biāo)的影響未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物病理模型，觀察了麻黃湯對(duì)急性冷應(yīng)激模型小鼠血液生理、血清生化及肝組織抗氧化能力的影響，以期為麻黃湯在畜禽冷應(yīng)激方面的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種小鼠36只，體重(21±1)g，雄性，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-2012，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度41 % ～ 60 %。

1.1.2 中藥 麻黃、桂枝、杏仁、炙甘草，均購(gòu)自合肥華佳大藥房。

1.2 方法

1.2.1 麻黃湯水煎液的制備 取麻黃16 g、桂枝16 g、杏仁20 g、炙甘草8 g，混合后冷水浸泡40 min；武火煎至沸騰時(shí)，改用文火；共煎煮2次，合并濾液；濃縮至0.45 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 36只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為空白組、模型組和麻黃湯給藥組，每組12只。給藥組按0.02 mL/g 體質(zhì)量灌胃麻黃湯，其它組按同等劑量灌胃蒸餾水。造模前36 h第1次灌藥/灌水，以后每隔12 h灌藥/灌水1次，連續(xù)3次。末次灌胃2 h后，將模型組、給藥組小鼠置于-20 ℃冷室中感受寒冷刺激，空白組小鼠室溫放置。分別于放置1、2 h觀察小鼠的精神狀態(tài)、黏膜顏色等情況；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有小鼠眼球采血，摘取肝臟。肝組織于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) ① 血液生理指標(biāo)。紅細(xì)胞指數(shù)：紅細(xì)胞(RBC)、紅細(xì)胞比容(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血紅蛋白濃度(HGB)；白細(xì)胞指數(shù)：白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(Lymp)、單核細(xì)胞(Gran)、中性粒細(xì)胞(Mono)；血小板(PLT)。② 血清生化指標(biāo)。血清尿素(urea)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血糖(Glu)、肌酸激酶(CK)含量(活性)。③ 肝組織抗氧化指標(biāo) 取肝組織，低溫勻漿處理，按照試劑盒說(shuō)明操作，采用比色法檢測(cè)肝組織中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)含量(活性)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0比較均值中的單因素進(jìn)行分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，同時(shí)比較各組之間的差異性，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)能力及皮膚色澤的影響

試驗(yàn)前，各組小鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，皮膚呈淡粉色，抓取時(shí)劇烈掙扎。試驗(yàn)1 h后，模型組小鼠精神不佳，皮膚呈粉紅色，活動(dòng)量減少，抓取時(shí)略有掙扎；而給藥組小鼠精神狀態(tài)良好，少量活動(dòng)，皮膚呈淡粉色，抓取時(shí)有明顯掙扎。試驗(yàn)2 h后，模型組小鼠精神萎靡，幾乎不活動(dòng)，身體蜷縮并伴有顫抖，皮膚輕度紫紅，抓取時(shí)幾乎不掙扎；給藥組小鼠精神沉郁，皮膚潮紅，抓取時(shí)仍有輕度掙扎。

2.2 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠血液生理指標(biāo)的影響

2.2.1 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠紅細(xì)胞指數(shù)的影響 由表1可知，與空白組相比，模型組和給藥組的RBC、HGB、HCT值略微升高， MCV、MCHC值略微降低(P>0.05)；與模型組相比，給藥組RBC、HCT、HGB的值升高，MCV、RDW、MCHC值降低(P>0.05)；比較各組的RBC、HCT、MCV、RDW、MCHC、HGB差異均不顯著(P>0.05)。說(shuō)明麻黃湯能略微增加冷應(yīng)激小鼠紅細(xì)胞指數(shù)。

表1 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠紅細(xì)胞數(shù)的影響

2.2.2 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠白細(xì)胞指數(shù)及血小板的影響 由表2可知，與空白組相比，模型組和給藥組的WBC數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，包括Lymp、Gran、Mono數(shù)量均極顯著降低(P<0.01)，PLT值均有所升高(P>0.05)；與模型組比較，給藥組的WBC值升高(P>0.05)，包括Lymp、Gran、Mono值均有所升高，但差異不顯著(P>0.05)，PLT值略微降低(P>0.05)；比較各組的PLT值，差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明麻黃湯能增加冷應(yīng)激小鼠白細(xì)胞指數(shù)，對(duì)血小板無(wú)顯著影響。

表2 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠白細(xì)胞及血小板數(shù)量的影響

2.3 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠的urea含量顯著升高(P<0.05)，給藥組小鼠的urea降低(P>0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠的urea極顯著降低(P<0.01)。與空白組相比，模型組和給藥組小鼠的ALT水平均降低(P>0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠ALT水平升高，但差異不顯著(P>0.05)。與空白組相比，模型組和給藥組小鼠的AST升高，差異極顯著(P<0.01)；與模型組比較，給藥組小鼠的AST升高，差異不顯著(P>0.05)。與空白組相比，模型組和給藥組小鼠的Glu水平極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥組小鼠的Glu水平極顯著降低(P<0.01)。與空白組相比，模型組小鼠的CK活性極顯著提升(P<0.01)，給藥組小鼠的CK值降低，但差異并不顯著(P>0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠CK值極顯著降低(P<0.01)。說(shuō)明麻黃湯能降低冷應(yīng)激小鼠血清urea、Glu、CK水平。

表3 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠生化指標(biāo)的影響

2.4 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠肝組織抗氧化指標(biāo)的影響

由圖1可知，與空白組相比，模型組中的MDA水平極顯著升高(P<0.01)，給藥組小鼠的MDA水平降低(P>0.05)；與模型組相比，給藥組MDA值極顯著降低(P<0.01)；說(shuō)明麻黃湯能顯著降低冷應(yīng)激小鼠的肝臟MDA水平。由圖2可知：與空白組相比，模型組的GSH水平降低，差異不顯著(P>0.05)，給藥組小鼠的GSH值升高(P>0.05)；與模型組相比，給藥組GSH顯著升高(P<0.05)；說(shuō)明麻黃湯能提高冷應(yīng)激小鼠肝臟的GSH水平。由圖3可知：與空白組相比，模型組的SOD值降低，差異極顯著(P<0.01)，給藥組SOD值降低，差異不顯著(P>0.05)；與模型組相比，給藥組SOD升高，差異極顯著(P<0.01)；說(shuō)明麻黃湯能提高冷應(yīng)激小鼠肝臟的SOD水平。

圖1 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠肝臟MDA水平的影響Fig.1 Effects of Mahuang decoction on MDA level of cold-stress mice liver (n =12)

圖2 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠肝臟GSH水平的影響Fig.2 Effects of Mahuang decoction on GSH level of cold-stress mice liver (n =12)

圖3 麻黃湯對(duì)冷應(yīng)激小鼠肝臟SOD活性的影響Fig.3 Effects of Mahuang decoction on SOD activity in cold-stress mice liver (n =12)

3 討 論

動(dòng)物在冷應(yīng)激狀態(tài)下，增加產(chǎn)熱以維持體溫恒定是動(dòng)物機(jī)體重要生理機(jī)制之一[5]。研究表明，麻黃湯可通過(guò)減少散熱、增加產(chǎn)熱，以迅速升高體核溫度調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，還可作用于下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞使體溫下降[16]。藥理學(xué)研究表明，麻黃湯中的麻黃堿能興奮中樞神經(jīng)，對(duì)大腦、中腦及延腦、呼吸與循環(huán)中樞均起到興奮作用，還有類似腎上腺素的作用，故內(nèi)服麻黃制劑可使全身溫暖，心跳加快，末梢血管收縮，血壓升高，且作用和緩而持久；輔藥桂枝含有桂枝醛能增強(qiáng)血液循環(huán)[17]。馬江[18]通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)麻黃湯口服生物利用度預(yù)測(cè)、類藥性分析和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)相結(jié)合，明確了麻黃湯中的活性化合物是通過(guò)舒張血管、促腎上腺素效應(yīng)和促平滑肌收縮等作用發(fā)揮治療傷寒證的功效；魏鳳環(huán)等[19,20]研究發(fā)現(xiàn)，麻黃湯能使興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)升高，增加小鼠自主活動(dòng)的作用。本試驗(yàn)觀察到，麻黃湯可以在一定程度上改善冷應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)能力的抑制。

血液生理檢查作為臨床判斷機(jī)體是否處于正常水平的基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)之一，對(duì)疾病的判斷及預(yù)后具有重要意義。血液中RBC在機(jī)體中主要承擔(dān)物質(zhì)運(yùn)輸及部分免疫功能[5]。一般情況下，為維持體溫恒定，冷應(yīng)激時(shí)機(jī)體產(chǎn)熱會(huì)增加，代謝的需氧量也相應(yīng)增加，導(dǎo)致RBC增多及HGB升高。本研究中，經(jīng)冷應(yīng)激處理2 h后的小鼠RBC與HGB均高于空白組，而麻黃湯干預(yù)組小鼠RBC水平較模型組和正常組又有所提高，原因可能與麻黃湯能促進(jìn)肝糖原分解、加快代謝，導(dǎo)致血液中的RBC代償性升高以提供更多的氧氣有關(guān)[21]。其中HCT增加，主要與RBC的數(shù)量增加相關(guān)。WBC主要包括Lymp、Gran、Mono等，在抵抗病原體的免疫應(yīng)答中起重要作用，是臨床上判斷機(jī)體免疫力的重要指標(biāo)之一[22]，冷應(yīng)激時(shí)會(huì)發(fā)生顯著變化。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，冷應(yīng)激處理2 h后小鼠的WBC水平特別是淋巴細(xì)胞顯著降低，這與Lavoy等[23]研究結(jié)果基本一致；而麻黃湯組小鼠WBC水平較模型組均有所增高，與喻敏等[24]研究結(jié)果一致。

血清生化指標(biāo)常常反映動(dòng)物機(jī)體的物質(zhì)代謝水平和某些組織器官機(jī)能狀態(tài)。AST廣泛存在于肝臟、心肌、骨骼肌、腎臟及大腦內(nèi)。本研究中，模型組小鼠AST水平上升，與穆淑琴等[28]的結(jié)果一致，是冷應(yīng)激造成細(xì)胞受到不同程度損傷、通透性增加所致。麻黃湯組小鼠AST水平顯著上升，可能與麻黃湯能調(diào)節(jié)糖代謝、花生四烯酸代謝及脂代謝等有關(guān)[29]。Glu是機(jī)體重要的能量來(lái)源，當(dāng)動(dòng)物暴露寒冷環(huán)境下，血液中Glu水平顯著升高以增強(qiáng)產(chǎn)熱維持體溫[30]。CK是能量產(chǎn)生過(guò)程中一種重要的酶，主要存在于消耗能量迅速的組織和細(xì)胞中。研究顯示，在麻黃湯的干預(yù)下，CK水平顯著降低，提示其可緩解能量活躍細(xì)胞在冷應(yīng)激狀態(tài)下的損傷。urea是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體腎功能出現(xiàn)異?；虻鞍踪|(zhì)代謝增強(qiáng)時(shí)會(huì)引起urea值增高。本試驗(yàn)中，模型組小鼠urea顯著升高，與胡麗蓉[25]、黃立波等[26]的研究結(jié)果一致；而麻黃湯能緩解小鼠urea水平的升高，與趙莎[27]報(bào)道相吻合。其機(jī)制可能與麻黃湯降低了蛋白質(zhì)代謝水平或提高代謝效率有關(guān)。

抗氧化是反映機(jī)體清除氧自由基降低細(xì)胞氧化損傷的能力，阻止損害生物細(xì)胞的一系列反應(yīng)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)中最重要的產(chǎn)物之一，能間接地反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度；GSH是機(jī)體清除氧自由基發(fā)揮抗氧化功能的重要物質(zhì)，由自身的細(xì)胞合成；SOD廣泛存在于任何細(xì)胞中，能清除氧自由基。急性冷應(yīng)激狀態(tài)下，動(dòng)物肝組織中MDA水平顯著升高[29]，GSH水平降低[32]，SOD水平顯著降低[31-32]。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠肝組織MDA、GSH、SOD變化與上述研究結(jié)果一致，說(shuō)明急性冷應(yīng)激嚴(yán)重?fù)p害了小鼠的抗氧化能力。在麻黃湯的干預(yù)下，小鼠GSH、SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低，其中GSH水平升高與李星[33]研究結(jié)果一致，說(shuō)明麻黃湯有效地保護(hù)了急性冷應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠氧化損傷。根據(jù)李睿[34]的研究，麻黃湯含有的各種生物堿、有機(jī)酸、揮發(fā)油、黃酮類等物質(zhì)能有效保護(hù)線粒體，與機(jī)體的抗氧化應(yīng)激密切相關(guān)；Moselhy等[35]發(fā)現(xiàn)桂枝酸能有效緩解四氯化碳造成小鼠的肝損傷降低氧化應(yīng)激。

4 結(jié) 論

麻黃湯可以改善急性冷應(yīng)激小鼠的精神狀態(tài)和活動(dòng)能力，增加應(yīng)激狀態(tài)下小鼠白細(xì)胞數(shù)量，顯著降低肝、腎及心肌功能指標(biāo)，從而緩解細(xì)胞損傷，增強(qiáng)肝臟的抗氧化功能?？梢?jiàn)，麻黃湯能在一定程度上抵抗急性冷應(yīng)激對(duì)小鼠造成的損傷。