盧雨欣，楊學(xué)英，米 洋，劉開輝,2，鄧百萬(wàn),3 *，趙航軻

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 漢中 723000; 2.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,陜西 西安 710021; 3.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西 漢中 723000)

【研究意義】 我國(guó)是鹽堿地大國(guó)，在全世界國(guó)家的鹽堿地面積中位居第三，且分布廣泛[1-2]。土壤鹽堿化已成為世界農(nóng)業(yè)的主要非生物脅迫源，鹽堿土壤由于高滲透壓、高pH使植物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)嚴(yán)重失調(diào)，導(dǎo)致農(nóng)作物大面積減產(chǎn)甚至絕收，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。因此，對(duì)鹽堿地土壤修復(fù)及開發(fā)利用具有重要意義。從微生物角度而言，高鹽土壤環(huán)境的利用主要包括降低土壤鹽濃度和培育新型耐鹽作物兩個(gè)方面[5]，其中通過(guò)篩選嗜鹽微生物的耐鹽基因已成為解決高鹽環(huán)境問(wèn)題的重要手段，采用基因工程手段將耐鹽基因?qū)胫参矬w內(nèi)，從而獲得耐鹽能力較強(qiáng)的新型生物技術(shù)作物[6]。因此嗜鹽微生物在高鹽土壤環(huán)境改良利用及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】嗜鹽微生物由于長(zhǎng)期生活在高鹽環(huán)境中，具有特殊耐鹽機(jī)制[7-10]。但有關(guān)嗜鹽微生物耐鹽機(jī)制的研究多集中在細(xì)菌、放線菌等原核微生物中，對(duì)嗜鹽真菌耐鹽機(jī)制的研究報(bào)道較少[11]。嗜鹽真菌為適應(yīng)高鹽環(huán)境，其相關(guān)耐鹽基因必然會(huì)在鹽脅迫下進(jìn)行高效表達(dá)[12]，而形態(tài)學(xué)上的差異則是其對(duì)高鹽環(huán)境做出的直觀表現(xiàn)[13-14]。如Kuncic等[15]就從形態(tài)學(xué)角度對(duì)嗜鹽真菌Wallemiaspp.響應(yīng)高鹽誘導(dǎo)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下其細(xì)胞壁顯著增厚，菌絲球大小顯著增加?，F(xiàn)階段關(guān)于碳源、氮源對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響已經(jīng)有了一定的研究，且研究發(fā)現(xiàn)含碳化合物和含氮物質(zhì)對(duì)嗜鹽真菌的耐鹽可能有影響[16-18]。【本研究切入點(diǎn)】本研究從形態(tài)學(xué)角度對(duì)嗜鹽真菌Aspergillusmontevidensis生物特性進(jìn)行初步探究。通過(guò)研究高鹽環(huán)境中不同碳源、不同氮源、不同碳氮比對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis生長(zhǎng)速度、生物轉(zhuǎn)化量、菌落形態(tài)以及顯微形態(tài)特征的影響，對(duì)比分析其對(duì)嗜鹽真菌耐鹽的影響，初步探究嗜鹽真菌的耐鹽機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)嗜鹽真菌的生物學(xué)特性研究，可進(jìn)一步從分子水平及生物代謝水平探究嗜鹽真菌的耐鹽機(jī)理。同時(shí)根據(jù)嗜鹽真菌的耐鹽機(jī)制，尋找關(guān)鍵耐鹽基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段培育耐鹽植株，為進(jìn)一步開發(fā)利用嗜鹽真菌資源及解決鹽堿化土壤環(huán)境農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 嗜鹽真菌Aspergillusmontevidensis(菌株保藏號(hào)：CGMCC3.15762)

1.1.2 培養(yǎng)基配方 PBS緩沖液：Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，K2HPO40.27 g，KCl 0.2 g，加去離子水約800 mL，充分?jǐn)嚢柚猎噭┩耆芙?，調(diào)pH至7.4，定容到1 L，121 ℃滅菌25 min后室溫保存。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1000 mL)：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，K2HPO41 g，MgSO4(7H2O 0.5 g，VB110 mg，瓊脂粉18 g，pH 6.5。

供試碳源培養(yǎng)基：以供試碳源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，各組分含量不變，同時(shí)分別添加0、1.5和3 mol/L的NaCl制成不同鹽濃度梯度的供試碳源培養(yǎng)基。供試碳源為：淀粉、纖維素、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖。

供試氮源培養(yǎng)基：以供試氮源替換含最佳碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，各組分含量不變，同時(shí)分別添加0、1.5和3 mol/L的NaCl制成不同鹽濃度梯度的供試碳源培養(yǎng)基。供試碳源為：硝酸銨、氯化銨、酵母粉、蛋白胨、硝酸鉀。

供試C/N培養(yǎng)基(1000 mL)：Na2HPO46 g，K2HPO43 g，KNO33.57 g，MgSO4(7H2O 0.12 g，CaCl20.01 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，pH自然。以葡萄糖和KNO3為碳氮源，使培養(yǎng)基中的碳素及氮素質(zhì)量比分別為10∶1、1∶1、1∶10，同時(shí)分別添加0、1.5和3 mol/L的NaCl制成不同鹽濃度梯度的碳氮比培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器 見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌落形態(tài)觀察 將嗜鹽真菌A.montevidensis接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 顯微形態(tài)觀察 采用插片法，在嗜鹽真菌A.montevidensis接種位點(diǎn)旁斜45°插入無(wú)菌蓋玻片，待有菌絲爬上蓋玻片后，取出蓋玻片并用棉蘭進(jìn)行染色，用高級(jí)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等顯微形態(tài)的觀察。

1.2.3 菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)量 將嗜鹽真菌A.montevidensis接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)7 d，每隔24 h測(cè)量培養(yǎng)皿中菌落的生長(zhǎng)半徑，每種培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速率。

1.2.4 菌絲體干質(zhì)量測(cè)量 將嗜鹽真菌A.montevidensis接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d，過(guò)濾收集菌絲，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次，60 ℃烘至恒重，進(jìn)行干質(zhì)量測(cè)量。每種培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis耐鹽的影響

如表2、圖1所示，隨著鹽濃度的增加，嗜鹽真菌A.montevidensis菌絲生長(zhǎng)旺盛，分生孢子鏈更長(zhǎng)且更加致密，在1.5 mol/L鹽濃度下其黃色素達(dá)到最大沉積，在3 mol/L高鹽濃度下孢子中的色素由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗷疑昂谏?，菌絲纖細(xì)為白色。在不同碳源中，以蔗糖為唯一碳源時(shí)，嗜鹽真菌A.montevidensis最先滿皿，菌絲生長(zhǎng)旺盛并有大量孢子產(chǎn)生，且在1.5 mol/L鹽濃度下孢子中的黃色素就已經(jīng)開始轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗷疑昂谏?。以葡萄糖為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)次之。雖然以纖維素為唯一碳源時(shí)，孢子色素也較早轉(zhuǎn)變，但從菌落形態(tài)觀察，其并不利于菌絲生長(zhǎng)。因此，嗜鹽真菌A.montevidensis的耐鹽性受不同碳源的影響，且以蔗糖為唯一碳源時(shí)展現(xiàn)出最好的耐鹽性，且該嗜鹽真菌A.montevidensis的最適生長(zhǎng)鹽濃度為1.5 mol/L。

A/a、B/b、C/c、D/d、E/e分別表示以淀粉、纖維素、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖為唯一碳源時(shí)，嗜鹽真菌A.montevidensis的菌落形態(tài)(顯微形態(tài))；1、2、3分別代表0、1.5、3 mol/L鹽濃度A/a,B/b,C/c,D/d and E/e respectively represent the colony morphology (microscopic morphology) of halophilic fungus A.montevidensis when starch,cellulose,maltose,sucrose or glucose are the only carbon sources； 1,2 and 3 respectively represent the salt concentration of 0,1.5 and 3 mol/L

表2 不同碳源對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis形態(tài)的影響

如圖2所示，不同鹽濃度下嗜鹽真菌A.montevidensis在5種不同碳源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率、菌絲體干質(zhì)量均不同。當(dāng)NaCl濃度為1.5 mol/L時(shí)，以蔗糖為碳源時(shí)該菌生長(zhǎng)速率最快為0.61 cm/d，菌絲體平均干質(zhì)量最大為3.00 g/L；當(dāng)NaCl濃度為3 mol/L時(shí)，同樣是以蔗糖為碳源時(shí)該菌生長(zhǎng)最快，生長(zhǎng)速率為0.54 cm/d，菌絲體干質(zhì)量最大為2.41 g/L。在無(wú)鹽條件下時(shí)，該菌在不同碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率、生物轉(zhuǎn)化量差異并不明顯，但隨著鹽濃度的增加，差異明顯，進(jìn)一步說(shuō)明了不同碳源對(duì)該菌株的耐鹽性存在影響。

圖2 不同碳源下嗜鹽真菌A.montevidensis的生長(zhǎng)速率(A)及菌絲體干質(zhì)量(B)Fig.2 Growth rate (A) and dry weight (B) of halophilic fungus A.montevidensis under different carbon sources

2.2 不同氮源對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis耐鹽的影響

如表3、圖3所示，隨著鹽濃度的增加，嗜鹽真菌A.montevidensis分生孢子鏈更長(zhǎng)且更加致密，菌絲縱向生長(zhǎng)越來(lái)越旺盛，甚至3 mol/L鹽濃度下，嗜鹽真菌A.montevidensis在以酵母粉為唯一氮源的培養(yǎng)基上其菌絲已觸及皿蓋。在不同的氮源中，以蛋白胨為唯一氮源時(shí)嗜鹽真菌A.montevidensis最先滿皿且產(chǎn)生大量孢子，在1.5 mol/L鹽濃度下孢子中的黃色素就已經(jīng)開始轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗷疑昂谏木湫螒B(tài)觀察，以硝酸銨、氯化銨、酵母粉為唯一氮源時(shí)，有利于該嗜鹽真菌在3 mol/L高鹽濃度下菌絲的生長(zhǎng)，但不利于其產(chǎn)生孢子。因此，嗜鹽真菌A.montevidensis的耐鹽性也受到不同氮源的影響，在以蛋白胨為唯一氮源時(shí)展現(xiàn)出最好的耐鹽性。

A/a、B/b、C/c、D/d、E/e分別表示以硝酸銨、氯化銨、酵母粉、蛋白胨、硝酸鉀為唯一氮源時(shí)，嗜鹽真菌A.montevidensis的菌落形態(tài)(顯微形態(tài))；1、2、3分別代表0、1.5、3 mol/L鹽濃度 A/a,B/b,C/c,D/d and E/e respectively represent the colony morphology (microscopic morphology) of halophilic fungus A.montevidensis when ammonium nitrate,ammonium chloride,yeast powder,peptone or potassium nitrate are the only nitrogen sources；1,2 and 3 respectively represent the salt concentration of 0,1.5 and 3 mol/L

表3 不同氮源對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis形態(tài)的影響

如圖4所示，在1.5 mol/L鹽濃度下，以蛋白胨為唯一氮源時(shí)生長(zhǎng)速率最快為0.63 cm/d，菌絲體平均干質(zhì)量最大為3.05 g/L，酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨次之。在3 mol/L鹽濃度下，仍是以蛋白胨為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率最快為0.57 cm/d，其菌絲體平均干質(zhì)量最大為2.56 g/L。氮源種類的不同對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis的生長(zhǎng)影響較大，且隨著鹽濃度的增加差異較為明顯，進(jìn)一步說(shuō)明了不同氮源對(duì)該菌株的耐鹽性也存在影響。

圖4 不同氮源下嗜鹽真菌A.montevidensis的生長(zhǎng)速率(A)及菌絲體生物量(B)Fig.4 Growth rate (A) and dry weight (B) of halophilic fungus A.montevidensis under different nitrogen sources

2.3 不同C/N對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis耐鹽的影響

由圖6可以看出，0 mol/L鹽濃度下，嗜鹽真菌A.montevidensis在不同C/N的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況良好，在C/N為1∶1和1∶10的培養(yǎng)基上，菌落整體為絨狀，中間呈黃色，邊緣整齊呈白色；在C/N為10∶1的培養(yǎng)基上，菌落表面有乳白色顆粒狀凸起，邊緣處里面呈淺棕色外面為黃色。1.5 mol/L鹽濃度下，嗜鹽真菌A.montevidensis在不同C/N的培養(yǎng)基上菌落形態(tài)相似，在C/N為1∶1的培養(yǎng)基上菌落邊緣處出現(xiàn)一圈淺綠色，在C/N為10∶1的培養(yǎng)基上菌落整體更為蓬松，菌絲更加致密，邊緣的綠色比之C/N為1∶1的培養(yǎng)基顏色加深。3 mol/L鹽濃度下，嗜鹽真菌A.montevidensis在C/N為10∶1的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況最好，菌落整體呈藍(lán)綠色；1∶10的培養(yǎng)基上該菌生長(zhǎng)次之，菌絲呈淺綠色；在1∶1的培養(yǎng)基上菌絲呈白色，且僅呈現(xiàn)為萌發(fā)狀態(tài)。由此可見(jiàn)，C/N為10∶1的培養(yǎng)基是嗜鹽真菌A.montevidensis的最佳C/N培養(yǎng)基。

選取最優(yōu)C/N=10∶1，觀察其在0、1.5、3 mol/L鹽濃度下的顯微形態(tài)如圖6所示。0 mol/L鹽濃度下有大量成熟的閉囊殼結(jié)構(gòu)，大小約為44.51～65.74 μm × 46.98～70.72 μm；1.5和3 mol/L鹽濃度下，顯微形態(tài)差別并不顯著，均存在分生孢子頭和閉囊殼兩種結(jié)構(gòu)，其閉囊殼大小約為32.09～42.26 μm × 36.00～47.04 μm，但1.5 mol/L鹽濃度下的菌絲及閉囊殼結(jié)構(gòu)多于3 mol/L。說(shuō)明隨著鹽濃度的增加，嗜鹽真菌A.montevidensis其繁殖方式從以閉囊殼為主的有性繁殖轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑稚咦訛橹鞯臒o(wú)性繁殖。

A、B、C分別代表0、1.5、3 mol/L鹽濃度A,B and C respectively represent the salt concentration of 0,1.5 and 3 mol/L

3 討 論

通過(guò)對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis生物特性的初步探究，結(jié)果表明：嗜鹽真菌A.montevidensis在鹽濃度為1.5 mol/L，以蔗糖為碳源、以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況最好，此條件下平均生長(zhǎng)速率為0.63 cm/d，菌絲體干質(zhì)量達(dá)3.05 g/L。嗜鹽真菌A.montevidensis生長(zhǎng)最佳C/N為10∶1。董秀黃等[19]人曾利用蔗糖作為碳源從新疆哈密南湖分離得到最多的嗜鹽菌；王艷紅[20]等人通過(guò)對(duì)中度嗜鹽菌HalobacillusY5的研究，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨。說(shuō)明蔗糖與蛋白胨能使嗜鹽菌在鹽脅迫條件下更好的生存，與本研究結(jié)果一致。

嗜鹽真菌通過(guò)調(diào)節(jié)復(fù)雜的生命活動(dòng)過(guò)程，繼而為適應(yīng)高鹽環(huán)境的響應(yīng)策略在形態(tài)學(xué)上的表現(xiàn)也有所不同[15,21]。本研究中的嗜鹽真菌A.montevidensis，在不同碳氮源條件下，當(dāng)嗜鹽真菌A.montevidensis菌落變?yōu)榍嗷疑蚝谏?，菌絲生長(zhǎng)旺盛，分生孢子鏈長(zhǎng)且致密時(shí)，展現(xiàn)出更好的耐鹽性。在無(wú)鹽條件下，以產(chǎn)生閉囊殼結(jié)構(gòu)為主，而在高鹽環(huán)境中會(huì)以產(chǎn)生分生孢子為主。

本研究通過(guò)對(duì)嗜鹽真菌A.montevidensis最佳鹽濃度以及碳氮源篩選，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對(duì)該菌生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。為進(jìn)一步全面揭示該嗜鹽真菌耐鹽機(jī)制提供參考，同時(shí)為耐鹽基因的篩選及耐鹽農(nóng)作物培育提供了理論依據(jù)，為高鹽環(huán)境土壤結(jié)構(gòu)改良及開發(fā)利用，以促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

A、B、C表示的C/N分別為1∶10、1∶1、10∶1；1、2、3分別代表0、1.5、3 mol/L鹽濃度C/N respectively represented by A,B and C are 1∶10,1∶1 and 10∶1; 1,2 and 3 respectively represent the salt concentration of 0,1.5 and 3 mol/L