于麗娟，吳麗華，王金香，李雪瑞，田 浩，楊 芳，李晚誼，肖 丹，李智敏*

(1.云南省農業(yè)科學院農產品加工研究所，云南 昆明 650221；2.云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650205；3.山西大同大學生命科學學院，山西 大同 037009)

【研究意義】余甘子(PhyllanthusemblicaL.;P.emblica),又名滇橄欖，為大戟科葉下珠屬落葉喬木或灌木，被世界衛(wèi)生組織列為在世界范圍內推廣種植的3種保健植物之一；廣泛分布于中國、印度、印度尼西亞和馬來西亞等熱帶和亞熱帶地區(qū)，其中云南省是中國余甘子野生資源的主要分布區(qū)[1]。余甘子果實富含多種人體有益物質，如多酚、黃酮、多糖、維生素、有機酸等[2]，因此不僅能清熱涼血、消食健胃、生津止咳，同時還具有抗炎、降脂、降壓、免疫調節(jié)、抗氧化等多種藥用功效[3]。【前人研究進展】多酚和黃酮類化合物是余甘子的主要功效成分，不但與余甘子果實提取物的抗氧化活性密切相關，還與其大部分藥理作用如抗病原微生物、抗炎、調節(jié)免疫，抗衰老等密切相關[3-4]。從天然植物中提取多酚和黃酮類物質，利用其抗氧化、抗衰老等活性，開發(fā)功能性食品和日用品具有廣泛的應用前景[5]?！颈狙芯壳腥朦c】作為富含多酚和黃酮類物質的藥食兩用資源，余甘子極具開發(fā)價值和市場潛力，但余甘子目前仍存在開發(fā)利用率低、產品附加值不高的問題?！緮M解決的關鍵問題】文章以余甘子果實為材料，采用水提法和乙醇提法提取其中的有效成分，分析其抗氧化活性分析和對酪氨酸酶活性的影響，探究余甘子的功效；研究結果進一步確認了余甘子果實富含多酚和黃酮類活性物質，且水提物優(yōu)于醇提物；同時明確了余甘子果實提取物具有極強的抗氧化能力，對DPPH自由基的清除能力最強，對羥自由基的清除能力最弱；而且研究發(fā)現余甘子果實提取物可影響酪氨酸酶活性，低濃度提取物引起酶活性升高，高濃度則抑制酶活性，但作用機制比較復雜有待進一步研究。研究結果可為促進余甘子果實的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

余甘子果實清洗后去核烘干，研磨成粉末后過篩，得到干粉；L-DOPA(L-多巴)，酪氨酸酶(25KU)，DPPH(1,1-苯基-2-苦肼基自由基)，ABTS(2,2聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)，均從上海源葉生物科技有限公司采購；30 % H2O2，過硫酸鉀和水楊酸等試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器

電子分析天平(梅特勒-托利多，ME204)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司，DK-98-Ⅱ)；超聲儀(昆山超聲，KQ5200E)；酶標儀(Thermo Scientific，MULTISKAN GO)；離心機(Eppendorf，5424 R)等。

1.3 方法

1.3.1 余甘子水提物的制備 取余甘子果實干粉，按料液比1∶8(m/V)加入蒸餾水，沸水回流提取1 h，離心過濾后取上清液，如此重復提取2次，將2次濾液合并，干燥后得到余甘子水提物。

1.3.2 余甘子醇提物的制備 取余甘子果實干粉，按料液比1∶8(m/V)加入95 %乙醇，回流提取1 h，離心后取上清液，反復提取2次后將濾液合并，干燥后得到余甘子醇提物。

1.3.3 供試液制備 余甘子提取物經超聲輔助溶解后，稀釋至適當濃度用于測定多酚和黃酮含量，分析其對DPPH、ABTS+、羥自由基的清除能力和對酪氨酸酶活性的影響。

1.3.4 多酚含量的測定 采用福林酚法測定余甘子果實提取物中多酚含量[6]。采用沒食子酸為標準品，繪制標準曲線：橫坐標為沒食子酸質量濃度(μg/mL)，縱坐標為760 nm處吸光值，得回歸方程：y=4.6529x+0.0015(R2=0.9991)。經適當稀釋后取50 μl樣品，加入200 μl蒸餾水和250 μl福林酚，室溫反應8 min；加入20 % Na2CO3750 μl，混勻；加入400 μl 蒸餾水避光反應1.5 h，于760 nm處檢測吸光值，代入標準曲線計算反應液中多酚的含量。

1.3.5 黃酮含量的測定 采用紫外分光光度法測定黃酮含量。采用蘆丁為標準品，繪制標準曲線：以蘆丁濃度(μg/mL)為橫坐標，以505 nm處吸光值為縱坐標，得回歸方程：y=0.0019x+1.244(R2=0.998)。經適當稀釋后取2 mL樣品，加入1 mL 5 % 亞硝酸鈉，搖勻、反應6 min；再加入10 % 硝酸鋁1 mL，反應6 min；加入4 % NaOH 4 mL、80 %乙醇2 mL，定容至10 mL，反應15 min，測505 nm處吸光值。代入標準曲線計算反應液中黃酮的含量。

1.3.6 DPPH清除能力測定 樣品經適當稀釋后，取100 μl，加入2.0×10-4mol/L DPPH 溶液100 μl，混勻，常溫反應1 h后，測定 517 nm 處吸光值，記為AS；DPPH 溶液在 517 nm 處的吸光值記為A1；各樣品自身在517 nm 處的吸光值記為A0。按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100 計算樣品對DPPH的清除率。

1.3.7 ABTS+清除能力測定 利用7 mmol/L ABTS 和 2.45 mmol/L 過硫酸鉀在避光室溫條件下反應 12～16 h， 制備ABTS+；用無水乙醇稀釋，測 734 nm 處吸光值，至吸光值為 0.7±0.05時備用。

取經適當稀釋后的樣品50 μl，加入200 μl ABTS+溶液，混勻、室溫避光反應6 min后，測定734 nm處吸光值，記為AS；ABTS+溶液于734 nm 處的吸光值記為A1；各樣品自身于 734 nm 處的吸光值記為A0。按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100 計算樣品對ABTS+的清除率。

1.3.8 羥自由基清除能力測定 分別加入 9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L 水楊酸-乙醇和樣品各1 mL后，加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2用于啟動反應，37 ℃水浴反應15 min，測定反應液在510 nm處的吸光值，記為As；同時測定各樣品自身于510 nm的吸光值，記為A0；空白溶液于510 nm的吸光度值，記為A1；按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100，計算樣品對羥自由基的清除率。

1.3.9 酪氨酸酶活性抑制動力學檢測 酪氨酸酶活性的檢測采用酪氨酸酶-多巴速率氧化法。按表1所示，將PBS磷酸鹽緩沖液、稀釋至適當濃度的樣品、酪氨酸酶混合均勻；37 ℃孵育10 min后，加入100 μl L-多巴溶液混勻。以PBS緩沖液為對照，連續(xù)反應30min、檢測溶液在 475 nm 處的吸收值，得到AC1、AC2、AT1和AT2。計算樣品對酪氨酸酶活性的抑制作用，計算公式如下：

表1 酪氨酸酶活性測定反應液

活性抑制率(%)=[1-(AT1-AT2)/(AC1-AC2)]×100

式中，AC1: 不加樣品、加酪氨酸酶的反應液的吸光值；AC2:不加樣品、也不加酪氨酸酶的反應液的吸光值；AT1: 同時添加樣品、酪氨酸酶的反應液的吸光度；AT2: 加樣品、但不加酪氨酸酶的反應液的吸光值。

1.3.10 生物統計學分析 所有測試均重復3次，以平均值±平均偏差的方式表達結果；同時采用 SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 余甘子提取物中多酚和黃酮含量的檢測

多酚和黃酮類物質都含有酚羥基，可溶于水、乙醇等溶劑中[7]。因此用水或乙醇為溶劑從植物中提取多酚和黃酮類物質是常用方法。本實驗分別以水和乙醇為溶劑從余甘子果實中提取多酚和黃酮。如表2所示，以水為溶劑從余甘子果實中提取多酚含量可達到22.95 mg/g DW，而以乙醇為溶劑可提取多酚為15.61 mg/g DW，水提法得到的余甘子多酚含量是醇提法的1.47倍。采用水提法提取黃酮類物質含量為34.61 mg/g DW，醇提物中的含量是17.61 mg/g DW，水提物得到的黃酮是醇提法的1.96倍。以水為溶劑提取的多酚和黃酮含量均高于乙醇，推測余甘子中水溶性多酚和黃酮含量高于醇溶性多酚和黃酮。

表2 余甘子提取物中多酚和黃酮類化合物的含量

2.2 余甘子提取物對3種自由基的清除率

多酚和黃酮類物質均具有抗氧化活性，可清除機體中的自由基，增強機體的抗氧化能力，提高機體的抗衰老能力[8-10]。本實驗采用水提法和醇提法從余甘子果實中提取多酚和黃酮類物質，并對其自由基清除能力進行了分析。結果(表3)表明，無論是水提物還是醇提物對3種自由基都表現出極強的清除能力，其中余甘子水提物和醇提物清除DPPH的IC50值分別為4.58和5.62 μg/mL；余甘子水提物和醇提物清除ABTS+的IC50值分別為9.61和14.29 μg/mL；水提物和醇提物清除羥自由基的IC50值分別為1.99和5.02 mg/mL。水提物對3種自由基的清除能力高于醇提物；并且提取物對3種自由基清除能力大小依次是DPPH>ABTS+>羥自由基，對DPPH自由基的清除能力最強，對羥自由基的清除能力最弱。

表3 余甘子提取物對DPPH、ABTS+、羥自由基的清除能力

2.3 相關性分析

同時本文分析了余甘子果肉提取物中多酚、黃酮類化合物含量與其自由基清除能力的相關性。如表4所示，多酚、黃酮類化合物含量均與其DPPHIC50值呈顯著負相關關系，相關性在-0.80以上；與ABTS+和羥自由基IC50值均表現出極顯著負相關，相關性在-0.95以上。表明多酚類和黃酮類化合物是余甘子清除DPPH、ABTS+和羥自由基的主要功效成分，這為證實余甘子果肉富含多酚和黃酮類化合物，具有較強抗氧化能力，可進一步開發(fā)利用提供了理論依據。

表4 多酚、黃酮含量與余甘子抗氧化活性的相關性分析

2.4 余甘子提取物對酪氨酸酶活性的影響

余甘子果實提取物對酪氨酸酶活性影響的體外實驗(圖1)表明，不添加任何提取物時(對照組)，酪氨酸酶活性表現為：初期，酶活性迅速呈指數級上升，10 min后酶活性趨于平穩(wěn)不發(fā)生明顯變化；當在反應體系中加入余甘子提取物時，與對照相比酪氨酸酶活性發(fā)生改變，其中加入0.2 mg/mL提取物(低濃度組)，酪氨酸酶活性在10 min內與對照組接近，沒有顯著變化，但隨反應時間的延長酶活性持續(xù)升高，在反應時間達30 min時高于對照；當濃度為0.6 mg/mL時(中濃度組)，在反應15 min之內對酪氨酸酶一直表現出抑制作用，之后抑制作用逐漸減弱，反應20 min之后酶活性逐漸超過對照組；當加入1.8 mg/mL(高濃度組)水提物時，在整個觀察期間酪氨酸酶活性內一直被抑制，只是隨反應時間延長抑制效應逐漸減弱。余甘子醇提物對酪氨酸酶活性的影響與水提物相似，即：低濃度的醇提物有激活酪氨酸酶的作用，中濃度組表現出先抑制后激活的規(guī)律，高濃度組對酪氨酸酶表現出抑制作用。分析反應15 min時水提物和醇提物對酪氨酸酶活性的影響，發(fā)現雖然由于重復之間變化較大，二者差異不顯著，但與醇提物相比，水提物對酪氨酸酶活性表現出更明顯的激活或抑制作用。

A：不同濃度水提物對酪氨酸酶活性的影響；B：不同濃度醇提物對酪氨酸酶活性的影響；C：余甘子水提物和醇提物對酪氨酸酶活性抑制率的比較A: The enzymatic reaction curve added with different concentration of aqueous extracts; B: The enzymatic reaction curve added with different concentration of ethanolic extracts; C: Comparison of the inhibition rate of aqueous and ethanolic extracts

3 討 論

3.1 余甘子果實水提物和醇提物中多酚和黃酮類物質的含量

本文分別采用水提和醇提法提取余甘子果實中的有效成分，檢測其中多酚和黃酮含量，進一步確認余甘子果實中存在豐富的多酚和黃酮類化合物；但由于提取溶劑不同，導致提取物中多酚和黃酮含量不同，其中水提物中多酚和黃酮類化合物均高于醇提物，水提得到余甘子果實中多酚和黃酮類含量分別為22.95、34.61mg/g DW，是醇提的1.47，1.96倍。根據多酚和黃酮類物質富含羥基的特性和相似相溶原理，采用水或極性溶劑(如乙醇和丙酮)對其進行提取，當提取溶劑的極性與余甘子中酚類和黃酮化合物極性相近時，才能更充分高效地提取活性物質[7]。本實驗分別以水和95%乙醇為溶劑用煮沸回流1 h、抽提2次的方法從余甘子果實中抽提活性物質，干燥后分別得到水提物和醇提物，水提法得到的活性物質更多，抽提率更高。

3.2 余甘子果實水提物和醇提物的抗氧化活性

脂質過氧化是導致細胞衰老的主要原因。自由基(羥自由基、超氧自由基、羧自由基、一氧化氮等)能加速體內不飽和脂肪酸氧化為類脂過氧化物，加快器官的衰老[11]。凡能減少此類自由基的產生或積累，即可抑制氧化反應的發(fā)生，起到防衰老、防疾病等作用。DPPH是一種以氮為中心的自由基，樣品對DPPH自由基的清除能力，可以反映其抗氧化能力[12-13]；ABTS法也是檢測體外抗氧化能力的常用方法之一[14]。筆者對2種方法提取得到的余甘子果實樣品分別進行了DPPH、ABTS+和羥基自由基清除能力分析。IC50值越低，表明抗氧化能力越強[15]。結果表明，水提物和醇提物對3種自由基均有很強的清除作用，其中水提物清除DPPH、ABTS+和羥自由基的IC50的濃度分別為4.58、9.61、1.99 mg/mL。研究結果與楊冰鑫(2019)[16]報道的余甘子多酚對DPPH自由基(EC50為 9 μg/mL)、羥自由基(EC50為 0.47 mg/mL)[12]的清除能力趨勢一致。且本研究中水提物的抗氧化能力高于醇提物，這與水提物中多酚和黃酮含量高于醇提物的結果一致。而且本文進一步分析了余甘子果實提取物中多酚和黃酮類化合物含量與其清除自由基能力的相關性。發(fā)現多酚和黃酮，都與余甘子提取物清除DPPH、ABTS+、羥自由基的IC50值呈顯著負相關，表明多酚和黃酮這兩類物質是清除以上3種自由基的主要成分。但余甘子果實中的多酚和黃酮化合物種類多樣、結構復雜，抗氧化能力不盡相同。推測當用2種提取試劑抽提多酚和黃酮類活性成分的時候，不僅含量不同，而且多酚和黃酮的組成結構也差異巨大，因而最終表現出不同的抗氧化能力。后期可進一步對余甘子果實中多酚和黃酮物質進行深入分離鑒定。

3.3 余甘子果實水提物和醇提物對酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸酶是引起人體產生黑色素以及果蔬褐變的關鍵酶，采用酪氨酸酶抑制劑抑制酪氨酸酶活性可一定程度上減少黑色素的生成，因此酪氨酸酶抑制劑在美容、食品及醫(yī)藥等領域具有廣闊的應用前景[17]。多酚類物質可以抑制酪氨酸酶的活性[18]。在本實驗中，余甘子水提物和醇提物對酪氨酸酶的活性影響表現出濃度效應。低濃度對酪氨酸酶有激活作用，中濃度組表現出先抑制后激活的規(guī)律，高濃度則表現出抑制作用。余甘子醇提物對酪氨酸酶活性影響與水提物相似，總體趨勢上醇提物的影響效果弱于水提物。余甘子提取物對酪氨酸酶活性的作用效應可能是人們利用其開發(fā)生毛、防脫發(fā)專利的基礎[19-20]。基于本實驗結果，推測余甘子的提取物不但富含多酚和黃酮類物質，同時含有很多其他活性成分，因此較低劑量余甘子提取物可激活酪氨酸酶，發(fā)揮黑發(fā)護發(fā)功效；較高濃度余甘子提取物則可以用于開發(fā)功能性日化品，發(fā)揮抗氧化、抗衰老作用。

4 結 論

本研究以余甘子果實為材料，采用水提法和乙醇提法提取其中的有效成分，從體外抗氧化活性和其對酪氨酸酶活性的影響，探究余甘子的功效。研究結果進一步確認了余甘子果實富含多酚和黃酮類活性物質，且水提物優(yōu)于醇提物；同時明確了余甘子果實提取物具有極強的抗氧化能力，對DPPH自由基的清除能力最強，依次強于ABTS+、羥自由基；研究還發(fā)現余甘子果實提取物可影響酪氨酸酶活性，低濃度提取物引起酶活性升高，高濃度則抑制酶活性，作用機制比較復雜有待進一步分析。本研究結果可為促進余甘子果實的開發(fā)利用提供理論依據。