鄭鵬麗，程建如，周明芹

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊洲 434025)

【研究意義】對節(jié)白蠟(FraxinushupehensisChiú.Shang et Su)又名湖北白蠟，為木犀科白蠟屬的落葉喬木，其生長緩慢、壽命長、樹齡可達2000年以上，既是珍貴的用材樹種，又是優(yōu)美的園林綠化樹種，還是極佳的盆景、根雕素材，被譽為“活化石”、“盆景之王”[1]。對節(jié)白蠟野生資源僅分布于鐘祥市與京山縣交界的大洪山余脈及周圍相鄰地區(qū)，分布范圍狹窄，種群規(guī)模小，野生資源稀少，為中國第二批珍稀瀕危保護植物[2]，被列入《中國植物紅皮書》?！厩叭搜芯窟M展】目前， 國內(nèi)外對對節(jié)白蠟研究主要集中在生物學(xué)特性[3]、人工栽培技術(shù)[4-6]、化學(xué)成分及藥理作用與應(yīng)用[7-8]等方面，遺傳多樣性與野生資源保護研究很少。【本研究切入點】葉綠體微衛(wèi)星(chloroplast simple sequence repeat，cpSSR)是一種新型的標記技術(shù)，它不僅有SSR的優(yōu)點，還能兼顧到cpDNA獨立進化的特點[9]，目前已被廣泛應(yīng)用到植物種群遺傳多樣性[10]、種群結(jié)構(gòu)分析[11]、種群分類[12]、系統(tǒng)地理分布[13]等方面研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以來自京山和鐘祥兩地的10個對節(jié)白蠟天然居群共196個個體為材料，采用cpSSR分子標記方法對對節(jié)白蠟居群野生資源進行了遺傳多樣性分析，旨在從分子水平上揭示10個居群間對節(jié)白蠟的親緣關(guān)系，為對節(jié)白蠟的生物多樣性保護提供參考，并為cpSSR等分子技術(shù)在對節(jié)白蠟等瀕危植物上的進一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用材料分別采自京山和鐘祥兩地的客店、雞鳴寺、大口林場、虎爪山、孫橋、空山洞、雁門口、觀音巖、永興及楊集10個對節(jié)白蠟天然居群共196個個體。隨機從距離至少10 m的成樹上采集5 g當年生嫩葉，加適量變色硅膠后封口保存?zhèn)溆?，種群編號及樣品數(shù)分別為KD(16)、JMS(36)、DKL(6)、HZS(31)、SQ(19)、KSD(17)、YMK(21)、GYY(21)、YX(12)、YJ(25)(表1)，樣本的數(shù)量反映了相應(yīng)種群的大小。

表1 對節(jié)白蠟10個居群的樣本及編號

1.2 DNA提取和cpSSR反應(yīng)體系的建立

稱取0.2 g干燥葉片，采用改良CTAB法[14]提取對節(jié)白蠟基因組DNA。cpSSR反應(yīng)體系為7.5 μl 2×TaqMaster Mix、0.45 μl cpSSR primer(F)、0.45 μl cpSSR primer(R)、1 μl 模版DNA(20 ng/μl)、6.1 μl RNase-Free Water，反應(yīng)總體系為15 μl。在PCR儀上擴增程序如下：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，最佳退火溫度72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

由于cpDNA相對保守，cpSSR突變率較低，cpSSR引物的通用性較高[15]。故本研究從10對雙子葉植物[16]和12對油橄欖[17]的cpSSR引物中篩選出6對能擴增出穩(wěn)定且有多態(tài)性條帶的微衛(wèi)星引物(ccmp1、ccmp2、ccmp7、ccSSR8、ccSSR12、ccSSR20)用于對對節(jié)白蠟10個居群進行擴增，引物由北京天輝遠生物公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在電泳圖譜中，同一位置的條帶被視作一個位點，根據(jù)同一位置上是否有條帶進行統(tǒng)計，有帶的記為“1”，無帶記為“0”。利用軟件 POPGENE 1.31計算居群內(nèi)及居群間的多態(tài)位點百分率(PPL)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's基因多樣性指數(shù)(h)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、總的基因多樣性(Ht)、物種基因多樣性(Hs)、遺傳分化系數(shù)(Gst)及基因流(Nm)、遺傳一致度、遺傳距離。用NTSYS-pc 2.10軟件根據(jù)居群間的Nei's遺傳一致度，對對節(jié)白蠟10個居群進行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpDNA遺傳多樣性分析

利用POPGENE 1.31對cpSSR標記擴增的結(jié)果進行遺傳多樣性參數(shù)的統(tǒng)計分析，篩選出的6對cpSSR引物共擴增了40條帶，其中多態(tài)性帶有30條，多態(tài)位點百分率為75.00 %。在居群水平上，PPL為7.50 %～55.00 %；Na為1.0750～1.5500，平均值為1.2575；Ne為1.0452～1.3124，平均值為1.1712；h值在0.0272～0.1850之間，平均值為0.0974；I值在0.0409～0.2802之間，平均值為0.1440。PPL、Na、Ne、h、I值最高的是雞鳴寺(JMS)居群，最低的居群是觀音巖(GYY)。對節(jié)白蠟種在物種水平上，Na、Ne、h、I平均值分別為1.7500、1.2756、0.1720、0.22732(表2)。cpDNA遺傳多樣性分析表明對節(jié)白蠟居群遺傳多樣性水平較低。

表2 cpSSR檢測對節(jié)白蠟10個居群的遺傳多樣性分析

2.2 cpSSR遺傳結(jié)構(gòu)分析

據(jù)POPGENE 1.31顯示分析，對節(jié)白蠟的Ht為0.1676，Hs為0.0974，Gst為0.4189。用AMOVA1.55軟件包對所得數(shù)據(jù)進行方差分析，對節(jié)白蠟居群間的遺傳多樣性和居群內(nèi)遺傳多樣性分別占總遺傳多樣性的41.89 %和58.11 %，表明對節(jié)白蠟遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。Nm為0.6942，說明居群間基因交流不夠豐富。

2.3 cpSSR遺傳聚類分析

對節(jié)白蠟各居群間Nei’s遺傳距離值的變化范圍為0.0329 (KD、GYY)～0.1569(DKL、GYY)，平均值為0.0843；遺傳一致度范圍為0.8548(DKL、GYY)～0.9676(KD、GYY)，10個居群的遺傳一致度平均值為0.9141(表3)。根據(jù)遺傳一致度，用NTSYS-pc 2.10軟件對對節(jié)白蠟的10個居群進行UPGMA遺傳關(guān)系聚類分析(圖1)。從聚類圖可以看出，10個自然居群聚成4個大類：第I類包括5個居群，分別為客店、觀音巖、虎爪山、楊集和雁門口；第 II類為孫橋和空山洞2個居群；永興居群獨成第III類；雞鳴寺和大口林場2個居群構(gòu)成第IV類。

表3 基于cpSSR標記的10個居群的遺傳一致度和遺傳距離

圖1 根據(jù) Nei’s遺傳一致度構(gòu)建的10個居群UPGMA聚類圖Fig.1 The UPGMA dendrogram of the 10 populations based on genetic identity

3 討 論

近年來，雖一些學(xué)者致力于研究瀕危植物多樣性，但這方面的研究仍然相對較少，分子標記等方法的運用將為野生遺傳資源的保護提供更好的研究平臺，在植物遺傳多樣性研究上將發(fā)揮更為重要的作用。對節(jié)白蠟作為我國特有的瀕危物種，其應(yīng)用價值極高，野生植物資源受到極大的破壞。因此，了解對節(jié)白蠟植物野生居群系統(tǒng)發(fā)育，進行遺傳分析及鑒定，從種群基因?qū)用嬷贫ǔ鲆吧参镔Y源的保護性利用措施極為重要。

由于微衛(wèi)星兩側(cè)的堿基序列具有很強的保守性，因此一個引物可以在另外一個物種上進行穩(wěn)定擴增，稱之為“種間擴增”。據(jù)研究，已開發(fā)的SSR引物具有較好通用性[18]，可以用于不同物種之間的擴增，如Weising等[19]報道了在煙草中成功擴增的10對cpSSR引物在獼猴桃科、桃金娘科、十字花科、龍舌蘭科、薔薇科、禾本科和豆科中擴增成功。本研究通過篩選已發(fā)表的cpSSR通用引物得到一些能穩(wěn)定擴增的引物，但有部分引物多態(tài)性較低，難獲得較高的多態(tài)性位點，而多態(tài)性高的引物可以得出較好分析結(jié)果。這與鄧紹勇[20]對大青屬9個種研究結(jié)果相似，表明盡管cpSSR引物的通用性較高，但由于植物親緣關(guān)系較遠會導(dǎo)致引物擴增的多態(tài)性降低。本研究結(jié)果顯示：對節(jié)白蠟各居群的PPL平均值為25.75 %，h和I平均值為0.0974和0.1440，其中DKL、YX居群因其分布范圍最小，樣本數(shù)最少，群體比較小，致使個體間親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性水平較低。在物種水平上，PPL值有所提高為75.00 %，而h和I值分別為0.1720和0.2732，均高于居群的平均值，說明對節(jié)白蠟在物種水平上具有較高水平的遺傳多樣性。這與桃兒七[21]、榧樹[22]的研究結(jié)果一致。

物種的遺傳分化程度可以通過基因流反映出來，基因交換頻繁的物種，其基因流大，居群間的遺傳分化較小[23]。實驗結(jié)果顯示：Nm為0.6942(<1)，Gst為0.4189(>0.25)，表明對節(jié)白蠟自然居群間存在著極強的遺傳分化趨勢，這可能是對節(jié)白蠟繁育方式為異交，蟲媒傳粉影響了基因流的傳播距離，致使長時間的地理隔離產(chǎn)生，花粉和種子在居群間的傳播較為困難，居群交流頻率較低。此外，對節(jié)白蠟居群間的遺傳多樣性和居群內(nèi)遺傳多樣性分別為41.89 %和58.11 %，遺傳一致度較高(0.8548～0.9676)，其原因可能是對節(jié)白蠟以前是一個完整的自然居群，由于人類活動的破壞了對節(jié)白蠟林，其自然居群數(shù)量減少，呈片段化分布，但在大型林場或自然保護區(qū)內(nèi)的大量對節(jié)白蠟自然種群得以完整保存，地理距離相距較近的種群仍能有效的進行基因流的交換，使其遺傳多樣性在種群內(nèi)較高。另一方面，對節(jié)白蠟樹較為長壽，種子有深休眠的習(xí)性[5]，種群天然更新困難，導(dǎo)致其種群間遺傳一致度較高。

對于10個對節(jié)白蠟自然居群，提出針對化保護建議：首先，對節(jié)白蠟的遺傳變異主要發(fā)生在于居群內(nèi)，因此要做好就地保護，保護其生存環(huán)境破不被破壞，保持居群大小和自然更新，并擴大種群規(guī)模。其次，對對節(jié)白蠟進行遷地保護，從多個居群中收集優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源建立對節(jié)白蠟遷地保護林，加強保育遺傳學(xué)的研究，更好的保護該物種各水平上的遺傳多樣性。最后，應(yīng)積極開展其種子繁殖研究和人工繁殖技術(shù)和育苗，有效緩解人為過度破壞對天然種群生存的威脅。