崔學(xué)強(qiáng)，唐 璇，黃昌艷，鄧杰玲，李秀玲，張自斌，盧家仕

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】卡特蘭又名卡特利亞蘭或嘉德利亞蘭，是蘭科(Orchidaceae)卡特蘭屬(Cattleya)及其近緣屬物種的統(tǒng)稱(chēng)，主要產(chǎn)于中南美洲一帶，為巴西、哥倫比亞及哥斯達(dá)黎加等國(guó)的國(guó)花?？ㄌ靥m假鱗莖呈紡錘形或圓柱形，葉革質(zhì)，單葉或雙葉頂生，氣生根系，著花1至數(shù)朵，多花種類(lèi)著花數(shù)可達(dá)數(shù)十朵，花期因種而異，花色豐富而艷麗，花朵盛開(kāi)時(shí)有特殊芳香，被譽(yù)為洋蘭之王[1]，可作高級(jí)盆花和名貴切花，還可作為高雅美麗的胸飾花，觀賞價(jià)值極高，深受世界各地人民的喜愛(ài)。卡特蘭在我國(guó)未發(fā)現(xiàn)原生種分布，需從其他國(guó)家引種栽培，而引種栽培的卡特蘭存在許多同種異名和同名異種現(xiàn)象，對(duì)我國(guó)卡特蘭雜交育種的親本選擇造成了不利影響。已有研究表明，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可對(duì)部分蘭科植物進(jìn)行遺傳多樣性分析及親緣關(guān)系和品種鑒定[2-4]，但迄今關(guān)于卡特蘭遺傳多樣性分子標(biāo)記方面的研究報(bào)道較少。因此，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)引種的卡特蘭進(jìn)行親緣關(guān)系分析，對(duì)卡特蘭原生種的分類(lèi)、鑒定及雜交育種親本選擇具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對(duì)卡特蘭的研究主要集中于栽培技術(shù)[5]、組培快繁[6-8]、花期調(diào)控[9]和基因挖掘[10]等方面。Ziekienlcz等[11]、王少銘等[12]、楊和川等[13]研究認(rèn)為，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有引物設(shè)計(jì)容易、操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性好、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在其他蘭類(lèi)植物上的應(yīng)用，何荊洲等[2]采用ISSR分子標(biāo)記研究了36個(gè)蝴蝶蘭品種的遺傳關(guān)系；陳業(yè)等[3]采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)23種兜蘭屬植物親緣關(guān)系進(jìn)行分析；盧家仕等[4]采用ISSR分子標(biāo)記研究了20份蘭科植物的遺傳多樣性；黃曉慧等[14]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)蘭進(jìn)行了PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選。李永清等[15]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)36份鐵皮石斛種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)在遺傳相似系數(shù)0.700處可將鐵皮石斛種質(zhì)資源劃分為6個(gè)類(lèi)群。李宗艷等[16]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析7個(gè)硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)居群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)7個(gè)居群聚為兩類(lèi)，居群間遺傳分化與地理距離無(wú)顯著相關(guān)性。李麗輝等[17]利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)7種蘭屬(CymbidiumSw.)21個(gè)品種資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)21個(gè)蘭屬品種資源間遺傳距離為1.910～6.600，聚類(lèi)結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果基本一致?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，鮮見(jiàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)卡特蘭進(jìn)行多樣性親緣關(guān)系分析的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)18份卡特蘭種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增及遺傳關(guān)系和聚類(lèi)分析，探究其親緣關(guān)系和遺傳特征，為卡特蘭品種鑒定及雜交育種親本選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

18份卡特蘭種質(zhì)資源均從國(guó)內(nèi)外收集獲得，種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所種質(zhì)圃，其基本信息見(jiàn)表1。

表1 用于ISSR分析的卡特蘭信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測(cè) 采用改良CTAB法分別提取18份卡特蘭的基因組DNA[18]。用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，用TE緩沖液將提取的基因組DNA稀釋至20 ng/μl，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選及ISSR-PCR擴(kuò)增 供試引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第9套ISSR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μl：無(wú)菌水8 μl、2×TaqPCR Master Mix 10 μl、引物1 μl、模板DNA 1 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min，產(chǎn)物4 ℃保存。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，凝膠上在相同遷移率位置上有條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記“0”。將不同引物記錄的條帶構(gòu)建[0，1]矩陣。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用NTSYS 2.10進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用非加權(quán)算術(shù)平均聚類(lèi)(UPGMA)法進(jìn)行聚類(lèi)分析。用GenAlEx 6.51計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon信息多樣性指數(shù)(I)和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(He)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的多態(tài)性分析結(jié)果

從100條ISSR引物中篩選出6條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的ISSR引物對(duì)18份卡特蘭種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分析，結(jié)果(表2)表明，每條引物擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶數(shù)在20～30條，平均為25.5條，6條引物擴(kuò)增共獲得條帶153條，其中多態(tài)性條帶為153條，引物平均多態(tài)性比率達(dá)100 %，說(shuō)明18份卡特蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富。圖1為部分引物對(duì)供試樣品的擴(kuò)增結(jié)果。

表2 6條ISSR引物對(duì)卡特蘭基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果

M：DL2000 Marker；1～18與表1編號(hào)相同M：DL2000 Marker；1-18 was the same as in table 1

2.2 卡特蘭種質(zhì)資源間遺傳相似性分析結(jié)果

利用6條ISSR引物產(chǎn)生的標(biāo)記信息，經(jīng)NTSYS 2.10計(jì)算18份卡特蘭種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果(表3)表明18份卡特蘭種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.6514～0.8991。其中，遺傳相似系數(shù)最小的是C3(Cattleyaguatemalensis)與C13(Cattleyaforbesii)，說(shuō)明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異相對(duì)較大；遺傳相似系數(shù)最大的為C6(CattleyaBrazilian Jewel)與C8(Cattleyanobilior)，說(shuō)明二者的親緣關(guān)系最近，遺傳差異相對(duì)較小。對(duì)遺傳多樣性參數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表4)表明，Na為2.000個(gè)，Ne為1.207個(gè)，He為0.157，I為0.281，說(shuō)明18份卡特蘭種質(zhì)資源間具有較豐富的遺傳多樣性。

表3 18份卡特蘭種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)

表4 18份卡特蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性參數(shù)

2.3 18份卡特蘭種質(zhì)資源的聚類(lèi)分析結(jié)果

為了確定各供試材料間的遺傳關(guān)系，采用NTSYS 2.10對(duì)遺傳矩陣進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，構(gòu)建樹(shù)狀聚類(lèi)圖。從圖2可看出，在遺傳相似系數(shù)為0.749處，18份卡特蘭種質(zhì)資源可分為6大類(lèi)，其中，第一大類(lèi)包括C1、C12和C18，均為卡特亞屬(Cattleya)，該屬為單葉種，花朵較大；第二大類(lèi)包括C2、C3、C10和C14，其中C2屬于波浪邊亞屬(Crispae)，為卡特蘭迷你原生種，植株矮小，單花，花大，C3、C10和C14屬于圈聚花蘭屬(Guarianthe)，為雙葉種，多花，花?。坏谌箢?lèi)只有C5，屬于類(lèi)匈伯加亞屬(Schomburgkoidea)，雙葉種，花中等大小，花朵無(wú)斑點(diǎn)；第四大類(lèi)包括C7、C9和C11，屬于鐮刀形花亞屬(Falcata)，雙葉種，花大且有斑點(diǎn)；第五大類(lèi)包括C4、C13、C15和C16，屬于因特美地亞屬(Intermedia)，雙葉種，一梗多花；第六大類(lèi)包括C6、C8和C17，屬于藕莖花亞屬(Rhizantha)，該屬植株矮小，花大，其中C6為C8與C17的雜交種，保留親本C8的遺傳物質(zhì)較多。

圖2 18份卡特蘭種質(zhì)資源UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果Fig.2 UPGMA clustering analysis results of 18 Cattleya germplasm resources

3 討 論

卡特蘭原產(chǎn)于南美洲國(guó)家，其中文譯名沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同學(xué)者針對(duì)同種卡特蘭的中文譯名存在較大差異，本研究的中文譯名參照王雁等[19]的《卡特蘭》一書(shū)。從分類(lèi)角度分卡特蘭有狹義和廣義卡特蘭，狹義卡特蘭單指卡特亞屬(Cattleya)，包括屬內(nèi)的原生種和屬內(nèi)種間的雜交品系，廣義卡特蘭泛指卡特亞屬(Cattleya)及其他相關(guān)近緣屬的所有原生種及雜交種。本研究的供試材料Guarianthebowringiana、Guariantheguatemalensis和Guarianthepatinii原為雙葉種卡特亞屬(Cattleya)的圈聚花蘭亞屬(Subgenuscircumvola)，2007年已變更屬名為圈聚花蘭屬(Guarianthe)，成為獨(dú)立屬[1]，其余材料均為卡特亞屬(Cattleya)。

由于卡特蘭原生種資源缺乏的限制，目前國(guó)內(nèi)開(kāi)展分子標(biāo)記研究仍屬空白，但國(guó)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。Jin等[20]利用RAPD技術(shù)對(duì)25個(gè)卡特蘭品種進(jìn)行親緣關(guān)系研究，通過(guò)分子聚類(lèi)結(jié)果證實(shí)Cattleyawalkeriana與Cattleyanobilior分屬于不同的種，而此前Cattleyawalkeriana曾被認(rèn)為是Cattleyanobilior的一個(gè)種或Cattleyaloddigesii的雜種。本研究結(jié)果也表明，Cattleyawalkeriana與Cattleyanobilior為不同種，且其親緣關(guān)系較近。目前形態(tài)學(xué)分類(lèi)將Cattleyawalkeriana和Cattleyanobilior歸為藕莖花亞屬(Rhizantha)，分子標(biāo)記結(jié)果與其形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果一致。Fajardo等[21]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)巴西一種瀕臨絕種蘭花Cattleyagranulosa及其他4種巴西本土種Brassavolatuberculata、Cattleyabicolor、Cattleyalabiata和Cattleyaschofieldiana的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明ISSR遺傳標(biāo)記可有效檢測(cè)卡特蘭種間的遺傳分化。而本研究聚類(lèi)分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果完全一致，與Fajardo等[21]的研究結(jié)果相符。Pinheirode等[22]利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究130個(gè)卡特蘭樣品，聚類(lèi)分析結(jié)果表明所有樣品可劃分為5個(gè)類(lèi)群，Cattleyalabiata與其他種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究18份卡特蘭種質(zhì)資源在相似系數(shù)為0.749處被分為6大類(lèi)，通過(guò)遺傳相似性分析發(fā)現(xiàn)Cattleyaguatemalensis和Cattleyaforbesii親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，雖然二者均為雙葉種，多花，但其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，也為其隸屬于不同的屬提供了證據(jù)。CattleyaBrazilian Jewel是Cattleyanobilior與Cattleyawalkeriana的雜交種，與Cattleyanobilior的親緣關(guān)系最近是因?yàn)槠湟话氲倪z傳物質(zhì)來(lái)源于Cattleyanobilior。

4 結(jié) 論

卡特蘭種質(zhì)資源間具有豐富的遺傳多樣性；UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果基本一致，18份卡特蘭種質(zhì)資源分別隸屬于卡特亞屬、波浪邊亞屬、類(lèi)匈伯加亞屬、鐮刀形花亞屬、因特美地亞屬、藕莖花亞屬和圈聚花蘭屬7個(gè)屬。