張敏，梁麗鴻，魯雅潔，曹新

綜 述

G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)分選蛋白功能特征與相關(guān)疾病研究進(jìn)展

張敏，梁麗鴻，魯雅潔，曹新

南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，南京 211166

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)作為最大的一類膜蛋白受體家族，可被多種配體激活并發(fā)揮相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，參與生物體內(nèi)重要的生理過程。G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)分選蛋白(G protein-coupled receptors associated sorting proteins, GASPs)則對內(nèi)吞后的GPCRs分選過程發(fā)揮著重要的作用，并介導(dǎo)受體進(jìn)入降解或再循環(huán)途徑，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。研究發(fā)現(xiàn)GASPs的功能缺陷與多種疾病相關(guān)，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和耳聾等。本文重點(diǎn)介紹了G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)分選蛋白的功能特征及其相關(guān)信號通路，描述了GASPs功能缺陷與疾病的關(guān)聯(lián)性及家族蛋白與GPCRs的相互作用、GASPs分選途徑的發(fā)現(xiàn)、參與的信號通路及對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以期為GASPs相關(guān)多種疾病的治療提供新的思路和策略。

G蛋白偶聯(lián)受體；G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)分選蛋白；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；疾病

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)是哺乳動物中最大且用途最為廣泛的信號受體家族[1]。它們可以被各種外界物質(zhì)如氣體、光子、蛋白質(zhì)、肽、化學(xué)物質(zhì)、激素、脂質(zhì)和糖類等信號激活，從而將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)[2]，影響個體心血管、免疫及神經(jīng)等多系統(tǒng)的生理及病理作用。不僅如此，GPCRs還是細(xì)胞內(nèi)的一類關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，是人體最大的一類治療藥物靶標(biāo)，據(jù)分析已超過1/3的藥物作用于GPCRs的家族成員[3,4]。與GPCRs相互作用蛋白如G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)分選蛋白(GPCR associated sorting proteins, GASPs)、Na+/H+交換調(diào)節(jié)因子/埃茲蛋白結(jié)合蛋白50(Na+/H+exchan-ger regulatory factor, NHERF/ezrin radixin moesin- binding protein 50 kDa, EBP50)、β-arrestin等在GPCRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞及內(nèi)吞后分選過程中發(fā)揮著重要的作用[5~8]。GASPs家族作為GPCRs分選轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因子，主要通過與受體C末端保守序列相互結(jié)合，通過磷酸化或泛素化的作用對內(nèi)吞后的GPCRs進(jìn)行分選，介導(dǎo)受體發(fā)生復(fù)敏或脫敏，參與調(diào)節(jié)GPCRs活性、GPCRs轉(zhuǎn)運(yùn)過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[9,10]，進(jìn)而影響相關(guān)疾病的發(fā)生或靶向GPCRs藥物的效果。因此深入研究GASPs分子作用機(jī)制和功能特征，揭示GASPs功能缺陷與疾病的關(guān)系，將為以GASPs為靶標(biāo)的生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。本文對GASPs家族的結(jié)構(gòu)特征、分選作用機(jī)制、相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄方面起的重要作用及其與疾病發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)的綜述。

1 GPCRs與GASPs

1.1 GPCRs及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

GPCRs作為哺乳動物體內(nèi)最大的跨膜受體家族，不僅種類眾多，且其家族成員具有相同的結(jié)構(gòu)特征：7次跨膜α螺旋，在其肽鏈的羧基端和連接第5及第6個跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)(即第3個胞內(nèi)環(huán))上都有鳥苷酸結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，但其氨基酸的序列在進(jìn)化上缺乏保守性，因而也使GPCRs的功能呈現(xiàn)復(fù)雜多樣性[11,12]。GPCRs均具有與異三聚Gαβγ蛋白相互作用的能力，βγ二聚體通過共價鍵結(jié)合于膜上起穩(wěn)定α亞基的作用，而α亞基本身具有GTP酶活性，它們作為GTPase活性中心從而啟動下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。按其序列的相似度主要可分為谷氨酸(glutamate, G)、視紫紅質(zhì)(rhodopsin, R)、粘附力(adhesion, A)、Frizzled/ Tastes (F)、分泌素(secretin, S)5個家族，簡稱為GRAFS[13]。其中，G家族成員較少，主要包括代謝型谷氨酸受體和鈣受體樣受體等，其氨基末端有500~600個氨基酸殘基，ICL3很短且高度保守，羧基末端無棕櫚?；稽c(diǎn)，不形成ICL4[14]，其家族成員功能異常將導(dǎo)致慢性癲癇病、阿爾茲海默病和帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[15]。R家族是視紫紅質(zhì)樣受體和腎上腺素受體，該亞家族包含了絕大多數(shù)種類的G蛋白偶聯(lián)受體，構(gòu)成基礎(chǔ)多肽鏈的結(jié)構(gòu)具有氨基末端氨基酸殘基數(shù)少的特點(diǎn)，第三胞內(nèi)環(huán)(ICL3)較長，羧基末端有棕櫚?；陌腚装彼?，形成第四胞內(nèi)環(huán)(ICL4)[14]，其功能缺失主要與心血管疾病有關(guān)，如高血壓、急性心肌梗塞和心力衰竭[16]。A家族受體具有一些GPCRs非經(jīng)典特征，包括一個較長的細(xì)胞外氨基末端和一個自催化GPCR蛋白水解位點(diǎn)(GPCR proteolysis site, GPS)，其主要與血管生成、炎癥、男性不育及某些遺傳病有關(guān)[13]。F家族包括10個frizzled受體(hFZD1-10)和一個平滑受體(hSmo)，以及25個Taste2或苦味受體，而Frizzled/Tastes類受體缺乏R家族GPCRs中大多數(shù)保守性特征，但是Smo結(jié)構(gòu)依舊顯示出保守的7次跨膜結(jié)構(gòu)，該家族成員的功能異常將導(dǎo)致慢性鼻竇炎、哮喘、囊性纖維化和癌癥等疾病[17]。S家族包括15種不同類型的受體，其在體內(nèi)的天然配體多為多肽類激素，它們在氨基末端的氨基酸殘基多達(dá)100多個，ICL3較長，羧基末端無棕櫚?；稽c(diǎn)，不形成ICL4[14]；該家族成員的功能缺陷會導(dǎo)致肥胖、癌癥及心腦血管疾病，因此它們也是臨床相關(guān)疾病治療的重要靶標(biāo)[18]。

GPCRs配體的多樣性決定GPCRs涉及細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，因此GPCRs信號通路是細(xì)胞內(nèi)比較重要的一類信號通路。目前認(rèn)為GPCRs介導(dǎo)和調(diào)控生理功能主要經(jīng)由兩條途徑：受體激活的G蛋白途徑和配體激活的β-arrestin途徑[19]。前者，G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)若被各種不同的外界信號激活，激活G蛋白信號途徑，包括cAMP通路、磷脂酰肌醇信號通路和MAPK/Erk信號通路等[20~23]。由于持續(xù)的GPCRs信號將會影響細(xì)胞存活和發(fā)生不良應(yīng)激反應(yīng)，因此需要嚴(yán)格調(diào)控GPCRs信號的終止。后者，β-arrestin途徑不僅能阻斷G蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時還與網(wǎng)格蛋白和網(wǎng)格蛋白銜接蛋白相互作用，從而促進(jìn)了活化受體的內(nèi)化，在GPCRs的脫敏、復(fù)敏、細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄的過程中起重要作用[24]。受體內(nèi)吞可能發(fā)生兩種變化：(1)在衣被小泡內(nèi)發(fā)生去磷酸化，通過再循環(huán)回到質(zhì)膜表面；(2)經(jīng)過內(nèi)體分選，有些非泛素化的受體蛋白再循環(huán)至細(xì)胞膜表面，有些受體蛋白則在溶酶體中發(fā)生降解。

1.2 GASPs結(jié)構(gòu)特征與表達(dá)分布

GASPs是在酵母雙雜交篩選中利用δ-阿片受體(DOR)胞質(zhì)的羧基尾作為誘餌而首次篩選出的新型分選蛋白，并通過與GPCRs的羧基末端相互作用介導(dǎo)了DOR的降解，該靶蛋白被命名為GASP-1[25]。GASP-1已被證明可以在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)GPCRs的轉(zhuǎn)運(yùn)特性[25~27]，后續(xù)與GASP-1結(jié)構(gòu)與功能相似成員被鑒定，迄今共有10個家族成員，即GASP-1~ GASP-10[8]。除GASP-8外，所有GASP成員均定位于X染色體的q22.1~q22.2區(qū)域，人類有兩個GASP-8基因拷貝，分別定位于人類7號染色體(含有7個外顯子，可產(chǎn)生4種剪切變體)和3號染色體(只含有一個編碼蛋白質(zhì)的外顯子，一種剪切變體)上[27]。

GASP-1~GASP-10具有從249～1395個不等的氨基酸，各成員之間有明顯的序列相似性，在近氨基端都存在含250個保守的氨基酸殘基的羧基末端區(qū)(犰狳類重復(fù))的跨膜區(qū)[27]。GASP-1具有最長的氨基酸序列，其羧基末端與其它的GASPs家族成員的羧基末端之間約有20%~77%的序列相似性(圖1)，而GASP-10具有最短的氨基酸序列[28]。根據(jù)GASPs的序列特點(diǎn)將家族成員可分為兩個亞家族，亞家族I包括GASP-1到GASP-5，它們在羧基末端之外都含有15個高度保守的氨基酸殘基組成的重復(fù)基序，稱為“GASP基序”，“GASP基序”中含有4個高度保守的氨基酸殘基SWFW，其是與GPCRs的C末端發(fā)生相互作用的關(guān)鍵部位。GASP-1含有22個GASP基序，從GASP-2到GASP-5都含有2個GASP基序。而亞家族II包括GASP-6到GASP-10，它們均不含有GASP基序[28]。

圖1 GASPs家族成員的比較

盡管GASPs家族成員在生物體內(nèi)普遍表達(dá)[29]，但大部分成員主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中高度表達(dá)，而GASP-6主要分布于免疫細(xì)胞、肺和肝組織中；GASP-8和GASP-10主要分布于胰和皮膚中；GASP-9在腎、子宮、心臟、腦、肺、胎盤以及前列腺等器官高度表達(dá)[30]。與此同時，超過90%的GPCRs也在CNS中表達(dá)，這種表達(dá)模式與GASPs家族參與調(diào)節(jié)這些受體的活性以及GASPs家族和GPCRs之間的相互作用相一致。

1.3 GASPs及其相互作用伴侶

GASPs根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征，其主要的相互作用伴侶是GPCRs (表1)。由于亞家族I成員的結(jié)構(gòu)域主要是由氨基端跨膜域、GASP基序和羧基端犰狳類重復(fù)序列3個部分構(gòu)成，而人們分別研究了這3個區(qū)域與GPCRs的結(jié)合作用。Bornert等[28]通過前期GASP-1蛋白的截短體共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GASP-1的氨基端跨膜域與GPCRs之間不存在結(jié)合作用；只含有GASP-1保守的羧基末端區(qū)域與GPCRs (ADRB1和M1)幾乎無相互作用，而與DOR受體僅有微弱的結(jié)合；相反的，含有GASP-1的中央結(jié)構(gòu)域保留有70%與GPCRs (ADRB1和M1)結(jié)合作用，與DOR受體結(jié)合作用留有30%；而含有GASP-1的中央結(jié)構(gòu)區(qū)域和羧基末端兩個區(qū)域與GPCRs(DOR、ADRB1和M1)結(jié)合作用很強(qiáng)，與完整的GASP-1的結(jié)合能力相似。因此，研究發(fā)現(xiàn)該亞家族I成員GASP-1與GPCRs存在兩種類型的相互作用關(guān)系：一類GPCRs靶向GASP-1的中間部位(GASP基序)相結(jié)合；而另一些GPCRs與GASP-1的中間部位和羧基端都能發(fā)生相互作用[28]。這表明GASP-1中央結(jié)構(gòu)域的GASP基序是與GPCRs相互作用的關(guān)鍵部位。該中央結(jié)構(gòu)域基序也存在于GASP-2到GASP-5的相應(yīng)中央部分，因此提示在GPCRs與這些GASP亞家族成員之間的相互作用中GASP基序可能也發(fā)揮著重要作用。GASP-1不僅能與GPCRs發(fā)生結(jié)合，還能與接頭蛋白(Gab1)[31]及微管(microtubules)[32]發(fā)生相互作用，從而對細(xì)胞骨架的形成與解聚進(jìn)行動態(tài)調(diào)控。在GASP家族中GASP-2與GASP-1的序列同源性最為相似，因此GASP-2也同樣具有類似GASP-1的功能，其可以與亨廷頓蛋白(Huntingtin, HTT)[33]、多巴胺D2[34]受體以及病毒趨化因子受體US28(由人巨細(xì)胞病毒HCMV所編碼的G蛋白偶聯(lián)受體[35,36])等受體相結(jié)合，將它們靶向至再循環(huán)或降解途徑。據(jù)報(bào)道[28]，GASP-3及GASP-5也能與GPCRs發(fā)生強(qiáng)結(jié)合。由于GASP亞家族II的結(jié)構(gòu)域主要由兩部分構(gòu)成：N端跨膜域和C端犰狳類重復(fù)序列，不包含GASP基序，因此與GASP亞家族I相比，亞家族II與GPCRs的羧基末端作用比較弱[28]。盡管亞家族II的成員與GPCRs的作用較弱，但是它們?nèi)匀荒芘c部分GPCRs發(fā)生作用，如GASP-6、GASP-7與腎上腺素能受體(ADRB1)、降鈣素受體(CALCR)、血栓素A2受體(TXA2)存在一定的相互作用[28]，而GASP-8雖不與GPCRs發(fā)生相互作用，但是P53可以作為其相互作用伴侶[37]，從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。因此可見，GASP家族的羧基端保守區(qū)域?qū)ζ渑cGPCRs相互作用的過程發(fā)揮著重要作用。

表1 GASPs及其相互作用伴侶

2 GASPs分子功能

2.1 GASPs調(diào)控GPCRs內(nèi)吞后的分選過程

GPCRs激活后被靶細(xì)胞內(nèi)吞，其后面臨兩個分選途徑：(1)去磷酸化進(jìn)入再循環(huán)到胞膜；(2)受體經(jīng)過內(nèi)體分選，有些非泛素化的受體蛋白再循環(huán)至細(xì)胞膜表面，有些受體蛋白則在溶酶體中發(fā)生降解(圖2)。當(dāng)配體與GPCRs結(jié)合后，G蛋白偶聯(lián)受體激酶將磷酸化細(xì)胞膜上的蛋白受體，一旦磷酸化，在β-arrestins作用下GPCRs與G蛋白解偶聯(lián)，并通過網(wǎng)格蛋白有被小泡內(nèi)化至分選內(nèi)體[45]，實(shí)現(xiàn)受體內(nèi)吞作用。受體內(nèi)吞后的分選途徑的選擇主要取決于內(nèi)吞后受體的磷酸化以及泛素化過程，當(dāng)受到激動劑的作用后，GPCRs發(fā)生磷酸化，這對受體的內(nèi)吞以及受體再循環(huán)至質(zhì)膜途徑是至關(guān)重要的[46]，通過快速再循環(huán)途徑將內(nèi)化的GPCRs運(yùn)送質(zhì)膜上，以恢復(fù)受體的功能，并促進(jìn)受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重新致敏性。相反的，當(dāng)GPCRs羧基端的賴氨酸殘基與泛素化蛋白相互作用時，將促進(jìn)受體的內(nèi)吞和受體進(jìn)入溶酶體中降解途徑[47]，促進(jìn)了受體蛋白的水解和下調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的衰減效應(yīng)延長[48]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個受體內(nèi)吞后再循環(huán)途徑和受體內(nèi)吞后降解途徑相關(guān)的蛋白，而這些相關(guān)蛋白通?？梢酝ㄟ^與GPCRs的羧基末端結(jié)構(gòu)域相互作用，從而特異性靶向GPCRs，它們可以再循環(huán)利用受體也可以降解受體[5]。在此過程中，GASPs在調(diào)控GPCRs內(nèi)吞后的分選過程中發(fā)揮了重要的作用。GASP-1作為該家族的較早發(fā)現(xiàn)的成員已被廣泛地研究，GASP-1主要通過其羧基末端與受體的Helix-8相互作用[30]，從而介導(dǎo)受體進(jìn)入溶酶體中，如GASP-1可以與內(nèi)吞作用后的δ-阿片類受體、多巴胺D2受體、多巴胺D3受體、大麻素受體等多個GPCRs的降解有關(guān)[49~51]。因此其羧基端區(qū)域的破壞，有可能抑制受體的降解，從而促進(jìn)受體的再循環(huán)。但是，GASP-1并不能與所有內(nèi)吞后的GPCRs進(jìn)行相互作用，如μ-阿片類受體和多巴胺D1受體不能與GASP-1相互作用，從而它們會被“再循環(huán)蛋白”運(yùn)送回細(xì)胞膜上。GASP-1不僅在細(xì)胞上發(fā)揮重要的作用，而且其可以將病毒趨化因子受體US28靶向至晚期核內(nèi)體和溶酶體內(nèi)，這一過程對病毒的外包是至關(guān)重要的[36]。最近，Edfawy等[42]研究發(fā)現(xiàn)GASP-2可以利用其內(nèi)吞分選作用，調(diào)節(jié)代謝型谷氨酸受體的表面有效性，而I型代謝型谷氨酸受體在小腦和海馬結(jié)構(gòu)突觸可塑性中起重要作用，它們的激活導(dǎo)致α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體的內(nèi)化。當(dāng)急性過表達(dá)GASP-2時，細(xì)胞膜表面的代謝型谷氨酸受體5 (mGluR5)的信號降低20%左右；相反的，當(dāng)敲除GASP-2時，在細(xì)胞膜表面的mGluR5聚集增加，這揭示GASP-2功能的異常干擾了受體內(nèi)化后正常的分選機(jī)制[42]。GASPs參與的GPCRs分選保證細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞具有適度的強(qiáng)度和時空上的特異性，以及精確調(diào)控細(xì)胞膜上GPCRs的數(shù)量、活性及分布。若GPCRs結(jié)構(gòu)異?；蚬δ苁д{(diào)或者GASPs功能缺陷均會影響GPCRs內(nèi)吞分選機(jī)制的正常調(diào)控，從而導(dǎo)致人類多疾病的發(fā)生，如阿爾茲海默病、腫瘤和耳聾等。因此，GASPs的正常調(diào)控對于維持細(xì)胞功能具有及其重要的作用。

圖2 GASPs參與內(nèi)吞后的GPCRs分選

2.2 GASPs調(diào)控GPCRs相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

GASPs家族蛋白的重要功能一方面是在GPCRs內(nèi)吞后分選過程中發(fā)揮作用；另一方面，GASP家族對GPCRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)同樣起到重要作用，而且GASP家族可能是連接這兩個過程的重要調(diào)控因子。在HEK293細(xì)胞中敲除內(nèi)源性的GASP-1會破壞US28介導(dǎo)的Gαq/PLC/inositol phosphate(IP)的累積，但當(dāng)GASP-1過表達(dá)增強(qiáng)了IP的累積，與此同時，US28介導(dǎo)的相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子NF-?B、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)也會隨著GASP-1的過表達(dá)或敲除而表現(xiàn)出相應(yīng)的上調(diào)或者下調(diào)[36]，因此，GASP-1不僅調(diào)節(jié)了US28的內(nèi)吞后運(yùn)輸，而且還調(diào)節(jié)了US28的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。目前推測GASP-1的過表達(dá)上調(diào)US28的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要可能由兩個方面造成：一是US28受體與GASP-1結(jié)合后會呈現(xiàn)出一種更有活性的構(gòu)象狀態(tài)，從而增強(qiáng)下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)；二是GASP-1靶向US28至細(xì)胞內(nèi)特定區(qū)域，進(jìn)而增強(qiáng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過GST融合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[30]，R家族(即視紫紅質(zhì)類受體家族)的阿片類受體的羧基末端可以與GASP-1結(jié)合；不僅如此，還發(fā)現(xiàn)雖然S家族(分泌素家族)的降鈣素受體的羧基末端區(qū)域與R亞家族成員沒有序列同源性，但是同樣也可以與GASP-1結(jié)合[30]。而G家族(即谷氨酸家族)的G蛋白偶聯(lián)受體mGluR5在可塑性、神經(jīng)棘形態(tài)、突觸通訊[52~56]和神經(jīng)突伸展[57]中起到關(guān)鍵作用，Heydorn等[26]提出GPRASPs可以調(diào)節(jié)代謝型谷氨酸受體(metabo-tropic glutamate receptor, mGluRs)，研究者利用在轉(zhuǎn)染后的HT-22細(xì)胞中證實(shí)了GPRASP2和mGluR5的相互作用，且缺失GPRASP2基因會干擾受體內(nèi)吞后的正常機(jī)制，表現(xiàn)出異常的mGluR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[42]。Jung等[41]研究發(fā)現(xiàn)，GASP-2蛋白可以與Smo蛋白和Pitchfork蛋白形成纖毛靶向復(fù)合體，能夠調(diào)節(jié)Smo向初級纖毛的易位，從而參與Hedgehog通路的正常調(diào)控。Hedgehog(Hh)信號通路是一條從無脊椎動物到脊椎動物都高度保守的信號通路，在胚胎期多種組織器官的發(fā)育、纖毛形成及腫瘤發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮著重要的作用[58]。Hh信號傳導(dǎo)通路核心組成部分包括分泌型糖蛋白配體(Hh)、膜蛋白受體復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子及下游目的基因4個部分。膜蛋白受體Ptch由腫瘤抑制基因Patched編碼，Ptch是一種12次跨膜受體；而受體Smo作為Ptch蛋白的下游分子，其由原癌基因Smoothened編碼，它屬于G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)蛋白，由7個跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成，N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)，其磷酸化部位位于羧基末端的絲氨酸和蘇氨酸殘基上，該蛋白家族成員只有維持蛋白全長時才具有轉(zhuǎn)錄啟動活性，從而啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[59,60]。而當(dāng)GASP-2蛋白缺失時，將導(dǎo)致Smo蛋白易位的失敗和抑制Hh靶基因的激活，從而抑制Hedgehog信號通路的激活。

因此，GASPs家族成員的作用不僅僅體現(xiàn)在GPCRs內(nèi)吞后的分選過程，還體現(xiàn)在參與相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，且GASPs可能是連接兩個過程的重要調(diào)控因子。

2.3 GASPs與GPCR相互作用的機(jī)制

經(jīng)配體激活后，大多數(shù)GPCRs將受到一系列涉及脫敏和內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)。內(nèi)化后的受體會被再循環(huán)至質(zhì)膜中或者靶向至溶酶體中降解。有文獻(xiàn)報(bào)道[26,61]，GASP-1可以與許多GPCRs的羧基末端進(jìn)行相互作用，而在大部分GPCRs的羧基末端存在helix-8，其是參與GASP和GPCRs相互作用的主要區(qū)域[30]。而受體再循環(huán)至質(zhì)膜主要取決于一些受體的羧基末端含有“回收序列”，此“回收序列”可以與NHERF/ EPB50等再循環(huán)蛋白進(jìn)行相互作用，從而促進(jìn)受體迅速再循環(huán)[34]。Thompson等[34]在人類HEK293細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，MOR受體羧基末端的“回收序列”決定了MOR不與GASP-1結(jié)合，但當(dāng)截短MOR受體的末尾17個氨基酸時，經(jīng)免疫沉淀結(jié)果顯示MOR可以與GASP-1進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而將受體運(yùn)送至溶酶體中降解。

因此，可以通過破壞與再循環(huán)蛋白的相互作用，或通過突變增強(qiáng)受體對GASP的親和力來促進(jìn)受體與GASP的相互作用，從而改變受體內(nèi)吞后的命運(yùn)。

2.4 GASPs調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)

研究表明GASPs家族成員參與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控。Matsuki等[62]關(guān)于GASP-1的研究表明，GASP-1可以與Period-1 (與哺乳動物晝夜節(jié)律調(diào)控相關(guān)的重要蛋白并且在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用)發(fā)生相互作用，并且在同一細(xì)胞中共表達(dá)這兩種蛋白質(zhì)可以促進(jìn)GASP-1靶向細(xì)胞核，在神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)處理后的PC12細(xì)胞中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)GASP-1發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。此外，在用GASP-1 siRNA預(yù)處理的細(xì)胞中，NGF可以使PC12細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡或死亡。這些結(jié)果表明，在NGF介導(dǎo)作用下，GASP-1通過核轉(zhuǎn)位調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[38,39]。不僅是GASP-1，GASP-3主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，有些則在細(xì)胞核中。GASP-3的序列中存在bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族特有的堿性螺旋-環(huán)-螺旋基序，這表明GASP-3可能參與基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄。另一方面，在血清饑餓誘導(dǎo)條件下用siRNA干擾GASP-3處理PC12細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)GASP-3對神經(jīng)元細(xì)胞的存活和增殖起到重要的調(diào)控作用，可能參與了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[27]。據(jù)報(bào)道，GASPs亞家族II中的GASP-6定位于線粒體的外膜中，其可與轉(zhuǎn)錄因子Sox10相互作用。Mou等[44]外源性過表達(dá)GASP-6后，發(fā)現(xiàn)線粒體中Sox10的數(shù)量增加。另外，盡管GASP-6不具有固有的轉(zhuǎn)錄活性，但它確實(shí)增強(qiáng)了Sox10對煙堿乙酰膽堿受體(nACh) α3和β4亞基的基因啟動子的反式激活，Sox10與GASP-6能夠通過直接相互作用增加轉(zhuǎn)錄功能及細(xì)胞核與線粒體之間進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的可能性。而GASP-6與GASP-8均能通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[37,63]：在QSG-1701(正常肝細(xì)胞系)中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GASP-8 能加速細(xì)胞生長，而抑制或干擾GASP-8表達(dá)則誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

由此，GASPs家族成員可以通過參與胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而影響細(xì)胞的存活與增殖。

3 GASPs功能缺陷與疾病

3.1 GASPs功能異常與腫瘤

越來越多研究表明GASP家族成員的功能異常與癌癥發(fā)生和發(fā)展存在密切關(guān)系，Tuszynski等[64]研究發(fā)現(xiàn)在早期乳腺癌患者的血清中存在GASP-1的特定蛋白片段，而正?；颊叩难逯袆t沒有；同時在7例2期和3期乳腺癌的腫瘤提取物中也檢測到GASP-1表達(dá)，但在相鄰的正常組織中未檢測到。而且GASP-1在多種癌癥病人的血清中都顯著過表達(dá)[65]，包括乳腺癌、腦癌和肺癌等，因此GASP-1可以作為一類潛在的腫瘤生物標(biāo)記物。在幾種結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了GASP-3基因啟動子CpG島的高甲基化，并且這幾類腫瘤都與GASP-3的表達(dá)缺陷相關(guān)[66]，結(jié)果表明GASP-3參與了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。此外，Rickman等[67]對經(jīng)手術(shù)治療發(fā)生轉(zhuǎn)移和未發(fā)生轉(zhuǎn)移的186例原發(fā)性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)與手術(shù)后未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者相比，這些最初接受手術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中其GASP-2和GASP-3在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平也顯著上調(diào)，這表明GASP-2和GASP-3可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡化。還有研究發(fā)現(xiàn)GASP-5可以作為ZNF217的下游靶基因，而ZNF217廣泛分布在各種腫瘤細(xì)胞中，其在腫瘤轉(zhuǎn)化過程和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用，該基因水平下調(diào)時可能導(dǎo)致與分化相關(guān)的GASP-5基因下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞去分化并促使細(xì)胞加速增殖，進(jìn)而誘發(fā)癌癥的發(fā)生[68]。在肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和卵巢癌中以及在不同人癌細(xì)胞系中都發(fā)現(xiàn)GASP-7和GASP-9轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)缺失或下調(diào)[30]，而且在肝細(xì)胞癌中GASP-8的亞型2表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)這種亞型的人肝癌細(xì)胞系生長比率增高，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而干擾其RNA表達(dá)能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[63]。這些結(jié)果均揭示GASPs家族蛋白可以作為腫瘤發(fā)展早期的生物標(biāo)志物，可能代表癌癥治療的新靶標(biāo)。

3.2 GASPs功能異常與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

GASPs家族成員廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GASP家族成員大部分位于X染色體q22.1~q22.2，該區(qū)域與人類的精神疾病有著很大的關(guān)聯(lián)。尤其是GASP-1和GASP-2。研究表明[69]，GASP-1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出程序性的記憶喪失，小鼠缺乏獲得性反應(yīng)和復(fù)雜反應(yīng)的能力。Horn等[40]研究發(fā)現(xiàn)HTT和GASP-2之間可以發(fā)生相互作用，從而影響受體的再循環(huán)和降解途徑。由于HTT出現(xiàn)延長的polyQ序列[70]，影響了GASP2和HTT之間親和力，從而可能直接影響患者神經(jīng)元受體的表面密度，這一過程與亨廷頓舞蹈癥有很大的關(guān)聯(lián)性。此外，GASP-2可以與7次跨膜受體Smo以及Pitchfork (Pifo)形成復(fù)合物，在Smo轉(zhuǎn)運(yùn)至初級纖毛的過程中起到重要的作用，GASP-2或者Pifo的缺失會導(dǎo)致Hedgehog信號通路的異常，從而無法激活Hh靶基因，進(jìn)而會引起小腦發(fā)育異常、顱面缺陷、共濟(jì)失調(diào)等癥狀[41]。特別是Xq22.1區(qū)域內(nèi)的0.35 Mb的缺失，會導(dǎo)致個體表現(xiàn)出呼吸障礙、腭裂和癲癇等癥狀[71]。此外，GASP-3可能通過與兩個重要的細(xì)胞內(nèi)信號激酶RanBP5 (importin-β樣運(yùn)輸受體)和PP2A (調(diào)控tau蛋白磷酸化的磷酸酶)發(fā)生相互作用，從而參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞的存活和生長。而在AD患者的大腦組織中發(fā)現(xiàn)GASP-3 mRNA水平下降，同時在阿爾茨海默癥中觀察到多種神經(jīng)元的退化和死亡[43]，這揭示了GASP-3在神經(jīng)元細(xì)胞正常的生長和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，并且研究者還將GASP-2和GASP-4列入帕金森病患者大腦組織中892個高度失調(diào)的優(yōu)先基因列表中，這些失調(diào)的優(yōu)先基因可能位于疾病過程的核心，并且可以作為治療PD疾病的新靶標(biāo)[72]。這些研究表明，GASPs與神經(jīng)系統(tǒng)性疾病密切相連。

3.3 GASPs功能異常與耳聾

在內(nèi)耳的發(fā)育過程中，許多GPCRs，包括Vlgr1、Lgr5和腺苷酸受體等在內(nèi)耳中都有表達(dá)。其中，Vlgr1蛋白是目前已知最大的G蛋白偶聯(lián)受體，其主要表達(dá)在毛細(xì)胞的纖毛根部，參與纖毛踝連接的形成[73]。同時，Vlgr1基因的突變可以引起Usher綜合征[74,75]，實(shí)驗(yàn)表明腺苷酸環(huán)化酶AC6在纖毛上與Vlgr1共定位，從而推測可能通過G蛋白激活腺苷酸酶AC6，從而參與cAMP介導(dǎo)的信號傳遞途徑[76]，其異常導(dǎo)致靜纖毛形態(tài)的異常，從而影響聽覺轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)耳發(fā)育。Lgr5，又稱為GPR49，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)內(nèi)耳毛細(xì)胞受損傷刺激，激活Wnt信號通路可以促進(jìn)Lgr5陽性細(xì)胞的增殖，而抑制Notch信號通路可以顯著地促進(jìn)Lgr5陽性細(xì)胞分化成毛細(xì)胞，從而顯著地促進(jìn)毛細(xì)胞的再生[77]，這為在損傷模型中通過前體細(xì)胞再生來恢復(fù)耳蝸結(jié)構(gòu)和功能奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。而最新研究表明，能夠靶向GPCRs的GASPs家族也與聽覺功能密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室在一個中國人遺傳性耳聾大家系中發(fā)現(xiàn)了GASP-2突變的遺傳學(xué)效應(yīng)[78]，該突變造成蛋白質(zhì)側(cè)鏈的位阻和極性的改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而患者出現(xiàn)耳廓畸形、內(nèi)耳道閉鎖(狹窄)、先天性傳導(dǎo)性或混合性聽力喪失、雙側(cè)上瞼下垂伴隨面部畸形等臨床表現(xiàn)。隨后，Liu等[79]利用原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)揭示了GASP-2主要在斑馬魚的內(nèi)耳和神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，GASP-2的分子致聾機(jī)制正在研究中，有望對GASPs家族相關(guān)的致聾機(jī)制提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)語與展望

GPCRs作為哺乳動物體內(nèi)分布最廣、種類最多的一類膜表面受體[80]，廣泛參與體內(nèi)體外多種生理過程，如免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)等，它一直是人們研究的熱點(diǎn)以及藥物研究的靶點(diǎn)。如今，近一半的臨床使用藥物通過靶向不同種類的GPCRs而發(fā)揮作用[81]。GASPs作為重要的GPCRs互作蛋白，在調(diào)控GPCRs的活性、內(nèi)吞分選及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程發(fā)揮重要的作用，如通過對δ-阿片類受體、mGluR5、HTT和Smo等受體蛋白的靶向結(jié)合作用，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、耳聾形成等。隨著人們對GASPs家族的具體分選機(jī)制功能及調(diào)節(jié)過程的研究不斷深入，有助于更好地理解這些GASPs的精確的分子功能，研究靶向GASPs及其相互作用伴侶，期望作為神經(jīng)退行性疾病癌癥及耳聾等疾病新的藥物治療靶點(diǎn)，進(jìn)而為其相關(guān)疾病的診治或干預(yù)策略提供新的思路與方向。

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G protein-coupled receptor-associated sorting proteins: function and relevant disorders

Min Zhang, Lihong Liang, Yajie Lu, Xin Cao

G protein-coupled receptors (GPCRs), the largest family of membrane protein receptors, can be activated by a variety of ligands and participate in signaling transduction, and they are essential in the physiologic process. GPCR-associated sorting proteins (GASPs) play an important role in the post-endocytic sorting of GPCRs. They mediate the degradation or recycling pathway, and regulate cell signaling transduction and other biological processes. The functional defects of GASPs have been reported to be implicated in pathogenesis of some neurological diseases, tumors and deafness and so on. In this review, we summarize the GASPs’ function, GPCR-GASP interactions, GPCR sorting pathway and GASP-related signaling pathways implicated in the transcriptional regulation. It could help to understand the potential linkage between GASPs’ dysfunction and diseases, and provide a new approach and strategy for the treatment of GASP-related diseases.

G protein-coupled receptors (GPCRs); G protein-coupled receptor-associated sorting proteins (GASPs); signal transduction; disease

2020-02-19;

2020-04-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31571302)和江蘇省財(cái)政廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺建設(shè)項(xiàng)目資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31571302), and Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation]

張敏，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：遺傳學(xué)。E-mail: zmzhangmin@njmu.edu.cn

魯雅潔，在讀博士，高級實(shí)驗(yàn)師，研究方向：疾病的分子遺傳學(xué)。E-mail: luyajie@njmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-020

2020/5/26 9:40:40

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200525.1507.004.html

(責(zé)任編委: 史岸冰)