王娜，甲芝蓮，吳強

研究報告

RFX5調控原鈣粘蛋白基因簇的表達

王娜，甲芝蓮，吳強

上海交通大學系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院比較生物醫(yī)學研究中心，系統(tǒng)生物醫(yī)學教育部重點實驗室，上海 200240

基因的表達調控與基因組在細胞核內的三維空間架構相輔相成，原鈣粘蛋白(protocadherin,)基因簇在大腦發(fā)育中起到關鍵作用，可以作為研究基因表達調控機制的模式基因。轉錄因子RFX5 (regulatory factor x 5)是翼螺旋家族(winged HLH family)的成員，其蛋白由寡聚化結構域、DNA結合域、螺旋結構域和激活域組成，在調控免疫系統(tǒng)的主要組織相容性復合物II類(major histocompatibility complex class II, MHC II)的表達中起著至關重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)RFX5與CTCF在全基因組上結合的位點有部分重疊，利用CRISPR/Cas9 DNA大片段編輯技術，構建了基因缺失的HEC-1-B細胞系。通過RNA-seq實驗，發(fā)現(xiàn)RFX5敲除能夠顯著升高、、的表達水平。通過ChIP-nexus實驗，發(fā)現(xiàn)敲除RFX5導致染色質架構蛋白CTCF和cohesin在原鈣粘蛋白基因簇處的結合增加。最后，染色質構象捕獲QHR-4C實驗發(fā)現(xiàn)、啟動子與遠端增強子HS5-1的染色質遠距離相互作用增強。上述研究表明RFX5蛋白可能通過調控染色質高級結構影響原鈣粘蛋白基因簇的表達，為未來進一步探索RFX5的功能提供了參考。

RFX5；；CTCF；cohesin；CRISPR/Cas9

人類基因組由超過30億的核苷酸所組成，長度超過2 m，而細胞核的大小僅有數(shù)微米，因此基因組經(jīng)過有規(guī)律地折疊形成復雜的三維空間結構，最終被包含在細胞核內[1]。然而，關于基因組如何折疊形成三維空間結構及其對基因組功能有何影響，仍有待進一步研究。原鈣粘蛋白(protocadherin,)基因簇是研究三維基因組空間結構與轉錄調控的模式基因。人類原鈣粘蛋白基因簇位于5號染色體上，線性長度橫跨將近1 Mb，由原鈣粘蛋白、原鈣粘蛋白和原鈣粘蛋白3個基因簇組成，共包含53個基因[2~9]。原鈣粘蛋白基因簇與原鈣粘蛋白基因簇的基因排列類似，均包含可變區(qū)外顯子和恒定區(qū)外顯子，并且每一個可變區(qū)外顯子都有各自獨立的啟動子，轉錄產物可以順式剪接到下游的3個恒定區(qū)外顯子[10]。原鈣粘蛋白基因簇則僅包含可變區(qū)外顯子，并無恒定區(qū)外顯子。原鈣粘蛋白基因簇在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能，包括中間神經(jīng)元的存活、皮層神經(jīng)元的遷移、神經(jīng)元的自我識別、突觸的形成、樹突的自我回避以及軸突的發(fā)育等[11]，因此研究原鈣粘蛋白的表達調控機制對理解大腦的正常發(fā)育以及認識腦疾病的發(fā)生發(fā)展十分重要。

人類原鈣粘蛋白基因簇由13個隨機表達的可變區(qū)外顯子(~)，2個C型可變區(qū)外顯子(和)，以及3個恒定區(qū)外顯子構成(圖1A)[2,6]。原鈣粘蛋白基因簇的表達受下游的增強子HS5-1調控[12]。在一維線性狀態(tài)下，HS5-1與所調控的原鈣粘蛋白基因的線性距離在115~250 kb之間(與最遠的相距250 kb，與最近的相距115 kb)。因此，增強子HS5-1必須通過遠距離染色質環(huán)形成在空間上靠近啟動子的三維高級結構。CTCF (CCCTC-binding factor)蛋白是一種轉錄因子，與DNA結合具有方向性。原鈣粘蛋白到的每一個啟動子上都有兩個正向的CTCF結合位點(CTCF binding site, CBS)：CSE (conserved sequence element)和eCBS (exonic CBS)，原鈣粘蛋白的啟動子上有一個正向的CBS，但是原鈣粘蛋白的啟動子上無CBS。有趣的是，下游的增強子HS5-1上有兩個反向的CBS HS5-1a和HS5-1b (圖1A)[13~15]。CTCF蛋白通過鋅指結構域結合在這些CBS上，滑動的cohesin蛋白復合體會停留在啟動子的正向CBS和增強子的反向CBS上，從而形成染色質環(huán)，使得增強子靠近并激活基因的表達[13,14,16]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)在增強子HS5-1處有RFX5 (regulatory factor x 5)蛋白結合，并且與CTCF的結合區(qū)域相互重疊。由此推測RFX5可能通過影響三維基因組的空間構象調控基因的表達。

RFX5是一種DNA結合蛋白[17]，屬于螺旋–轉角–螺旋家族中翼螺旋亞家族[18]。RFX5的首次報道見于對II型裸淋巴細胞綜合征(the bare lymphocyte syndrome, BLS)的研究[19]。BLS是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，該病的特征在于缺乏主要組織相容性復合物II類(major histocompatibility complex class Ⅱ, MHC II)分子的表達，從而導致了嚴重的免疫缺陷，機體反復遭受感染，患者常在嬰幼兒期死亡[20~25]。研究表明，MHC II類分子缺乏的根本原因是調節(jié)基因表達的相關因子RFX5蛋白存在缺陷，致使MHC II類分子無法在免疫細胞中表達或表達降低[26,27]，由此開啟了轉錄因子RFX5在基因表達調控方面的研究[28~32]?；虬?1個外顯子，編碼一個含有616個氨基酸的蛋白質。該蛋白包含4個結構域：寡聚化結構域、DNA結合域、螺旋結構域和激活域[33,34]。RFX5蛋白的寡聚化結構域由一個較長的中央螺旋和兩個較短的螺旋組成。當RFX5單獨存在時，兩個RFX5分子的中心螺旋形成一個反平行的盤繞線圈，側翼螺旋垂直排列在長螺旋的末端，使得RFX5二聚體的形狀如釘書釘[35]。此時高度保守的DNA結合域被遮蔽，無法與染色體結合。只有在寡聚化結構域及螺旋結構域通過與配體RFXANK、RFXAP的相互作用形成RFX復合物，暴露出包裹在內部的DNA結合域時，RFX5才能與啟動子、增強子等結合，從而發(fā)揮調控功能[33]。關于RFX5的研究主要集中在MHC II類分子的表達調控方面，以及RFX復合體如何相互作用[26,36~39]，鮮有涉及RFX5在三維基因組空間結構形成方面的作用。

本研究利用II型成簇規(guī)律間隔短回文重復序列CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9)系統(tǒng)發(fā)展起來的DNA大片段編輯技術[40~47]，通過引入兩個sgRNA (single-guide RNA)，將Cas9蛋白定位到靶點位置并進行切割，造成DNA雙鏈斷裂，經(jīng)過細胞自我修復后，可以獲得基因片段的刪除、反轉、重復和插入[42,46]。本研究通過向細胞中導入兩個sgRNA，得到基因敲除的單細胞克隆株。然后利用RNA-seq實驗檢測敲除細胞中基因表達水平的變化，通過染色質免疫沉淀(chromatin immu-noprecipitation, ChIP)實驗結合深度測序，探尋敲除RFX5對于染色質空間架構蛋白CTCF和cohesin蛋白復合體在DNA結合方面的影響，最后通過定量高分辨率染色體構象捕獲(quantitative high-resolution chromosome conformation capture copy, QHR-4C)實驗探究敲除RFX5對原鈣粘蛋白基因簇啟動子與增強子之間三維空間結構的影響，發(fā)現(xiàn)RFX5能夠抑制染色質遠距離環(huán)化，對進一步了解RFX5蛋白的功能有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pGL3-U6-sgRNA-Puromycin-BsaI質粒由南京大學黃行許教授提供；人源化pST374-Cas9-ZF-NLS質粒由北京大學席建忠教授提供；人子宮內膜癌細胞系HEC-1-B來自于美國菌種保藏中心(ATCC)；MEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗、谷氨酰胺和丙酮酸鈉均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自南美ExCell公司；sgRNA、測序引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司、上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成；質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自美國AXYGEN公司；MinElute Gel Extraction kit購自德國QIAGEN公司；Lipo3000購自美國Invitrogen公司；I限制性內切酶、NEB Buffer 2、T4 DNA連接酶、T4 DNA連接酶緩沖液、Poly (A) mRNA Magnetic Isolation Module、RNA文庫制備試劑盒、末端修復酶、末端修復酶緩沖液、Klenow Fragment (3?→5? exo-)、dA-Tailing反應緩沖液、Blunt/TA連接酶混合液、NEB Buffer 2.1、T4 DNA聚合酶、Lambda核酸外切酶、RecJf核酸外切酶、蛋白酶K、Q5?Hot Start HiFi PCR Master Mix等均購自美國NEB公司；TRIzol購自美國Ambion公司；AMPure?XP Beads購自美國Beckman Coulter公司；GreenMix、dNTPs購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Protein G beads、甲醛溶液、RNase A、糖原、Fast DigestH I限制性內切酶均購自美國Thermo公司；CirLigase? ssDNA Ligase試劑盒購自美國Epicentre公司；Rad21抗體、CTCF抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 構建pGL3-U6-sgRNA質粒

設計合成sgRNA的寡核苷酸序列如表1所示。購買的單鏈sgRNA首先用ddH2O稀釋為終濃度20 μmol/L，接著進行引物退火步驟，反應體系如下(總體積為20 μL)：2 μL sgRNA-F，2 μL sgRNA-R，2 μL 10 × NEB Buffer 2，14 μL ddH2O，經(jīng)微量移液器吹打混勻后放入PCR儀中。反應條件為：95℃預變性5 min，緩慢降溫95℃ 20 s 351個循環(huán)(自第二個循環(huán)開始逐步降溫，每個循環(huán)降溫0.2℃)，最終產物4℃保存。

環(huán)形pGL3-U6-sgRNA質粒通過I酶切后，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的分離，切膠純化得到線性pGL3-U6-sgRNA載體。將該線性化載體與退火產物進行連接反應，體系如下(總體積為5 μL)：0.5 μL T4 DNA連接酶，0.5 μL T4 DNA連接酶緩沖液，0.5 μL線性pGL3-U6-sgRNA載體，0.5 μL退火產物，3 μL ddH2O，混勻后室溫靜置30 min；將上述反應體系加入含感受態(tài)細胞的1.5 mL離心管中，冰上靜置30 min后放入42℃水浴鍋，熱激45 s立即拿出，冰上靜置2 min；加入500 μL LB無抗培養(yǎng)基，并置于37℃搖床中培養(yǎng)45 min，均勻地涂在含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16~17 h；挑取2~3個單菌落搖菌培養(yǎng)，用質粒小量提取試劑盒提取質粒，并測序。

表1 引物序列

sgRNA引物中帶下劃線部分為構建質粒所需的粘性末端。P7-index中帶下劃線部分為index。

1.3 細胞培養(yǎng)

HEC-1-B細胞培養(yǎng)在含5% CO2濃度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基為加入10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉的MEM完全培養(yǎng)基。

1.4 轉染與單細胞克隆株的篩選

將處于對數(shù)生長期的約2×105/mL的HEC-1-B細胞傳代至12孔板培養(yǎng)，待細胞生長密度為70%~ 90%時轉染：先用MEM培養(yǎng)基稀釋轉染試劑Lipo3000，混勻后室溫靜置5 min；另取一管MEM培養(yǎng)基稀釋sgRNA質粒、Cas9質粒和轉染試劑P3000，并將Lipo3000加入其中，室溫孵育20 min后全部加至12孔板的培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)基換為含有2 ng/μL嘌呤霉素的MEM完全培養(yǎng)基進行藥物篩選。藥篩4 d后，更換為普通的MEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞量足夠時，經(jīng)過胰酶消化后，取1/10細胞置于PCR管中，室溫11,200 r/min離心3 min，棄去上清。向PCR管中加入10 μL堿裂解液，吹打混勻后放入PCR儀中，98℃ 20 min裂解細胞釋放DNA；再加入等體積的中和液，吹打混勻于?20℃冰箱中保存待用。通過設計PCR引物鑒定上述轉染細胞中是否含有片段刪除，若存在，則將12孔板中剩余的細胞進行單克隆鋪板。一周后在顯微鏡下觀察孔內細胞是否為單一團狀并做標記，兩周后對單細胞克隆株進行基因型鑒定。

1.5 單細胞克隆株的鑒定

單細胞克隆經(jīng)胰酶消化后，取部分細胞經(jīng)上述堿裂解法進行裂解，獲得的細胞基因組作為模板，保存至?20℃冰箱待用。以特異性引物通過PCR擴增反應得到目的片段，擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，并回收測序從而鑒定單細胞克隆株的基因型。若出現(xiàn)雙峰的情況，則通過TA克隆進一步鑒定。

鑒定單細胞克隆株的引物序列如表1所示。PCR反應體系如下(總體積為10 μL)：1 μL模板DNA，0.5 μL 10 μmol/L正向引物，0.5 μL 10 μmol/L反向引物，5 μL 2 × GreenMix，3 μL ddH2O。上述反應體系經(jīng)微量移液器吹打混勻后放入PCR儀中。反應條件為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s (退火溫度根據(jù)引物的GC含量而定)，72℃延伸1 min (延伸時間根據(jù)PCR產物的長度改變，酶延伸速度約為1 kb/min)，35~37個循環(huán)；72℃ 2 min完全延伸，最終產物4℃保存。

TA克隆：PCR產物與T載體室溫連接30 min；連接產物加入含感受態(tài)細胞的1.5 mL離心管中，冰上靜置30 min；42℃熱激45 s；冰上2 min；向離心管加入500 μL LB無抗培養(yǎng)基，37℃搖床中培養(yǎng)45 min；均勻涂在含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~17 h；挑取8~10個單菌落搖菌培養(yǎng)，用質粒小量提取試劑盒提取質粒，并送測序。

高血壓性腦出血是一種常見的腦血管疾病,其出血部位以基底節(jié)區(qū)為常見,在老年人中發(fā)病率高,出血后需及時清除血腫,避免引起血腫繼發(fā)損傷和神經(jīng)功能進一步損害[3-4]。傳統(tǒng)的開顱手術創(chuàng)傷大,且老年患者耐受性差,容易產生感染等嚴重并發(fā)癥。微創(chuàng)穿刺引流術近年來得到廣泛應用。微創(chuàng)穿刺引流術創(chuàng)傷輕,對功能區(qū)域的損害達到最小化,且對于血腫引流可分次、緩慢進行,可以降低顱內感染和繼發(fā)性出血的風險,幫助患者手術后更快恢復神經(jīng)功能,提高生活質量[5-6]。

1.6 單細胞克隆株總RNA的提取

將處于對數(shù)生長期的細胞傳代至12孔板培養(yǎng)，待細胞生長密度為80%~90%時收集細胞提取RNA：丟棄原孔中的培養(yǎng)基，用1×PBS清洗2~3次并棄去上清；加入500 μL/孔TRIzol溶液，室溫靜置15 min；吹打混勻后轉至1.5 mL離心管中；加入100 μL三氯甲烷，震蕩儀劇烈震蕩15 s，室溫孵育2~3 min；放入4℃離心機中12,000 r/min離心15 min；轉移上清(約200 μL左右)至新的1.5 mL離心管中；加入250 μL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫孵育10 min；放入4℃離心機中12,000 r/min離心10 min，棄去上清；加入500 μL 75%乙醇，上下顛倒10次混勻，放入4℃離心機中12,000 r/min離心5 min，棄去上清(勿動沉淀)；短暫離心以除去管壁上殘留的液滴，室溫開蓋干燥10 min；加入20 μL無核酸酶的水溶解沉淀，震蕩混勻，用NanoDrop2000測濃度后于?80℃冰箱保存。

1.7 RNA-seq建庫和高通量測序

單細胞克隆株總RNA抽提后，使用Poly (A) mRNA Magnetic Isolation Module試劑盒提取成熟的mRNA，合成并純化獲得cDNA；使用RNA文庫制備試劑盒經(jīng)過末端修復、加接頭、PCR擴增、純化等步驟構建文庫，經(jīng)Qubit3 Fluorometer測量濃度后于?20℃冰箱保存，以備高通量測序。文庫經(jīng)蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺進行測序，利用特異性index序列對測序結果進行拆分，通過Cufflinks、STAR等軟件進行數(shù)據(jù)分析[48]。所用P7-index序列見表1。

1.8 RFX5與CTCF蛋白結合位點分析

ChIP-seq數(shù)據(jù)來自GEO，所分析的細胞系為人宮頸癌細胞系HeLa-S3，RFX5蛋白的ChIP-seq數(shù)據(jù)編號為GSM935560，CTCF蛋白的ChIP-seq數(shù)據(jù)編號為GSM749739。利用Bedtools分析結合峰，并畫出韋恩圖。啟動子處RFX5和CTCF蛋白的ChIP-seq數(shù)據(jù)來自人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-SH，數(shù)據(jù)編號分別為GSM1003629和GSM1003633。

1.9 單細胞克隆株ChIP-nexus建庫與高通量測序

將處于對數(shù)生長期的細胞系傳代至10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，待細胞生長密度為80%~90%時收集細胞：丟棄原10 cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1 × PBS清洗1次并棄去上清；加入1 mL/皿胰酶溶液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2~3 min；加入1 mL新鮮的MEM培養(yǎng)基終止胰酶消化，吹打混勻后轉至15 mL離心管中；放入離心機中室溫2000 r/min離心5 min，棄去上清(勿動下層細胞沉淀)；加入10 mL培養(yǎng)基重懸沉淀；加入670 μL 16%多聚甲醛溶液，置于旋轉儀中，室溫顛倒混勻10 min；加入712.5 μL 2 mol/L的甘氨酸溶液，置于旋轉儀中，室溫顛倒混勻5 min；放入4℃離心機中3300 r/min離心10 min，棄去上清；用預冷的1×PBS重懸細胞沉淀，放入4℃離心機中3300 r/min離心5 min，棄去上清；短暫離心以除去管壁上的殘留液，用微量移液器吸取上清并丟棄；立即用液氮速凍后放入?80℃冰箱保存待用或直接進行裂解超聲。

超聲后，放入4℃離心機中以最大轉速離心10 min；轉移上清至新的無菌1.5 mL離心管中，加入適量抗體，置于4℃冰箱旋轉儀中緩慢旋轉孵育過夜；加入適量Protein G beads孵育；接著進行末端修復、3?末端添加一個腺嘌呤脫氧核苷酸、連接接頭、接頭填補和修剪、Lambda和RecJf核酸外切酶的酶切反應、DNA洗脫與純化、單鏈環(huán)化等步驟構建文庫[49]，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。用Qubit3 Fluorometer測濃度后于?20℃冰箱保存，以備高通量測序。文庫經(jīng)蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺進行測序，根據(jù)index序列對測序結果進行拆分，通過Bowtie2比對到GRCh37/hg19基因組，用BamCoverage進行歸一化處理，標準化到RPKM (reads per kilobase per million mapped reads)。所用P7-index序列見表1。

1.10 單細胞克隆株QHR-4C建庫與高通量測序

將生長旺盛的細胞系傳代至10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，待細胞生長密度為80%~90%時收集細胞。接著進行酶切、連接、DNA純化、超聲、線性PCR擴增、加接頭、PCR擴增、純化等步驟構建文庫[15,50]。用Qubit3 Fluorometer測量濃度后置于?20℃冰箱保存，以備高通量測序。文庫經(jīng)蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺進行測序，根據(jù)index序列對測序結果進行拆分，去除重復的Reads，通過Bowtie2比對到GRCh37/hg19基因組，用Samtools將比對文件進行轉換，隨即用R3Cseq計算每個II酶切片段的Reads數(shù)，將總Reads標準化到一百萬，最后根據(jù)冪律分布對觀測點附近進行反向累積擬合得到染色質互作圖。由于超聲產生DNA末端的隨機性，將RFX5敲除細胞與野生型細胞數(shù)據(jù)進行相減得到差異性數(shù)據(jù)[15,50]。所用P7-index序列見表1。

2 結果與分析

2.1 使用CRISPR/Cas9大片段編輯技術建立RFX5基因敲除的單細胞克隆株

圖1 使用CRISPR/Cas9技術建立RFX5基因敲除的單細胞克隆株

A：人類原鈣粘蛋白()基因簇示意圖。人類原鈣粘蛋白基因簇包含15個可變區(qū)外顯子(13個隨機表達型及2個C型)和3個恒定區(qū)外顯子。每1個隨機表達型外顯子的啟動子上都有2個正向的CTCF結合位點(CBS)，C型外顯子的啟動子上有1個正向的CBS，而的啟動子上沒有CBS。原鈣粘蛋白基因簇下游的增強子HS5-1上含有兩個反向的CBS。在CTCF和cohesin蛋白復合體的作用下，HS5-1增強子與原鈣粘蛋白基因啟動子之間(除外)形成染色質環(huán)調控這些基因的表達。B：敲除基因所使用的一對sgRNA (sgRNA1和sgRNA2)以及各鑒定引物的位置示意圖。C：分析比較HeLa-S3細胞中RFX5蛋白和CTCF蛋白結合峰的重疊情況。D：RFX5在啟動子和HS5-1增強子中分別有兩個結合峰，并且部分與CTCF結合峰有重疊。E：基因敲除的單細胞克隆株K30和K56的基因型鑒定結果。以野生型細胞(WT)作為對照；用F1/R2或F2/R3引物，在sgRNA切點處，WT可擴增出884 bp或1587 bp片段，K30和K56中未檢測到以上2個片段；用引物F1/R1，在K30和K56中擴增出785 bp的條帶，而WT無條帶。F：F1/R1引物在K30和K56單細胞克隆株中擴增產物的測序結果圖。

設計兩個sgRNA (sgRNA1和sgRNA2)，分別定位在啟動子下游101 bp和終止密碼子處(PAM上游3 bp)，二者相距4034 bp (圖1B)。利用這兩個sgRNA與Cas9切割基因，能造成基因絕大部分編碼序列的刪除。在切口位置上下游設計引物，檢測編輯后細胞的基因型。引物F1設計在sgRNA1切口上游645 bp，引物R1設計在sgRNA2切口下游140 bp。使用F1和R1鑒定片段刪除的單細胞克隆株，經(jīng)過PCR反應可獲得長度為785 bp的產物，而野生型細胞無條帶(圖1E)。為排除雜合子，對有片段刪除的單細胞克隆株進一步在sgRNA切口上下游進行PCR擴增鑒定。對于sgRNA1切口設計引物R2，位于切口下游239 bp。sgRNA1切口處使用引物F1和R2進行PCR，野生型或雜合子可獲得片段長度為884 bp的產物，而純合子敲除無條帶(圖1E)。sgRNA2切口處設計引物F2，位于sgRNA2上游779 bp，引物R3設計在sgRNA2下游808 bp (圖1B)。使用引物F2和R3進行PCR，野生型或雜合子可獲得片段長度為1587 bp的產物，而純合子敲除無條帶(圖1E)。經(jīng)過上述PCR鑒定，從56個單細胞克隆株篩選到兩個敲除純合子單細胞克隆株：K30和K56。PCR產物測序顯示K30存在兩種不同的染色體基因型，一種為Cas9精確地切割在PAM上游3 bp處后的連接產物，另一種加入一個T堿基，可能為Cas9切割在sgRNA2非互補鏈PAM上游4 bp處所致。K56只存在一種基因型，即Cas9精確地切割在PAM上游3 bp處后的連接產物(圖1F)。

2.2 敲除RFX5基因對原鈣粘蛋白α基因簇表達的影響

為了研究RFX5敲除對基因表達產生的影響，對獲得的兩個單細胞克隆株分別進行RNA-seq實驗。首先分析基因的表達，結果顯示兩個克隆中均檢測不到的成熟mRNA，進一步證明了單細胞克隆株K30和K56已成功敲除基因(圖2，A和B)。進一步分析了基因敲除對原鈣粘蛋白基因簇轉錄水平的影響，結果發(fā)現(xiàn)，在RFX5敲除的K30和K56單細胞克隆株中，相比于野生型細胞，原鈣粘蛋白基因簇基因總體轉錄水平升高(圖2C)。野生型細胞主要表達、、以及，其他基因不表達。在RFX5敲除的K30單細胞克隆株中，相比于野生型細胞，表達基因的個數(shù)沒有變化，但表達水平升高，其中表達升高1.55倍，表達升高1.34倍，表達升高1.77倍(圖2D)。在K56單細胞克隆株中，與K30單細胞克隆株一致，上述3個基因表達均升高，其中表達升高1.56倍，表達升高1.86倍，表達升高1.9倍(圖2E)。這些結果表明，基因敲除顯著提高了原鈣粘蛋白基因簇的基因轉錄水平。

2.3 敲除RFX5基因增加CTCF和cohesin蛋白在原鈣粘蛋白α基因簇的結合

為了探尋基因如何調控原鈣粘蛋白基因簇的轉錄，首先對CTCF蛋白在原鈣粘蛋白基因簇的結合情況進行研究。CTCF蛋白是一種轉錄因子，包含11個鋅指結構域，可方向性地與DNA結合，調控基因的表達[51]。此外，CTCF可作為絕緣子，與cohesin蛋白復合體相互作用，協(xié)同決定染色質環(huán)形成的方向性[13,14,52,53]。采用ChIP-nexus實驗，發(fā)現(xiàn)在基因敲除的兩個單細胞克隆株K30和K56中，CTCF在轉錄升高的和基因啟動子上的結合均高于野生型克隆，在增強子HS5-1處的結合也同時升高(圖3A)。在不表達的和基因啟動子處，CTCF的結合水平也高于野生型。總體而言，基因的敲除顯著提高了CTCF蛋白在原鈣粘蛋白基因簇位點的結合。

結合在正向–反向CBS上的一對CTCF蛋白能夠阻斷cohesin蛋白復合體在DNA上的滑動，從而形成染色質環(huán)。因此，絕大多數(shù)CBS上都有cohesin蛋白復合體的結合[13,14,54,55]。為了研究RFX5的敲除是否影響cohesin蛋白復合體的結合，對cohesin蛋白復合體亞基RAD21也進行了ChIP-nexus實驗。類似于CTCF，結果發(fā)現(xiàn)RAD21在、、、以及HS5-1處的結合也高于野生型克隆(圖3B)。

2.4 RFX5影響原鈣粘蛋白α基因簇的三維空間構象

基于RFX5對CTCF和cohesin復合體在原鈣粘蛋白基因簇位點結合水平的影響，推測RFX5可能通過影響染色質三維空間構象從而調控原鈣粘蛋白基因簇的表達，因此對原鈣粘蛋白基因簇進行可定量的高分辨率染色質構象捕獲(QHR-4C)實驗。該實驗能夠研究某個觀測點(viewpoint, VP)與全基因組其他位點之間的空間關系[15]。本研究首先以增強子HS5-1為觀測點，發(fā)現(xiàn)在野生型細胞中，HS5-1與以及之間形成遠距離的染色質環(huán)(圖4A)。在RFX5敲除的兩個單細胞克隆株K30和K56中，HS5-1與這些基因之間的遠距離相互作用增加(圖4A)。為了進一步確定這些基因組位點間空間結構的變化，選取啟動子為觀測點，發(fā)現(xiàn)在基因敲除的兩個單細胞克隆株中，與增強子HS5-1之間的遠距離相互作用也同樣增加(圖4B)。這些結果說明，敲除基因后，原鈣粘蛋白基因簇啟動子與遠端增強子HS5-1之間的染色質相互作用增強，這可能是基因表達上調的原因。

圖2 RFX5基因敲除對原鈣粘蛋白α基因簇轉錄水平的影響

A：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT、K30、K56單細胞克隆株中基因外顯子轉錄水平。B：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT、K30、K56單細胞克隆株中基因轉錄水平。C：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT、K30、K56單細胞克隆株中原鈣粘蛋白基因簇基因總體轉錄水平。D：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT和K30細胞中原鈣粘蛋白基因簇各基因轉錄水平。E：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT和K56細胞中原鈣粘蛋白基因簇各基因轉錄水平。***：< 0.001；****：< 0.0001；FPKM：fragments per kilobase of transcript per million mapped reads；RPM：reads of transcript per million mapped reads。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)敲除基因導致原鈣粘蛋白基因簇表達升高，并且RFX5會阻礙CTCF蛋白和cohesin蛋白復合體在原鈣粘蛋白基因簇的結合。此外，RFX5參與調控染色質環(huán)的形成，進而影響染色質三維空間結構。

3 討論

基因組空間構象的變化在很大程度上影響基因的表達，因此對基因組空間構象調控機制的研究具有重要意義。CTCF通過與DNA的結合，阻礙cohesin蛋白復合體的滑動從而使DNA成環(huán)，造成遠距離的啟動子、增強子彼此靠近，以此調控基因的表達[16,54]。以原鈣粘蛋白基因簇為例，基因簇下游的增強子與上游基因啟動子之間形成遠距離染色質環(huán)，調控上游基因的表達[12,56]。本研究主要集中在RFX5蛋白對原鈣粘蛋白基因簇的表達調控，以及探索其對于原鈣粘蛋白基因簇三維空間結構的影響。

圖3 RFX5敲除促進CTCF和RAD21在原鈣粘蛋白α基因簇位點的結合

A：ChIP-nexus數(shù)據(jù)分析比較WT、K30和K56單細胞克隆株中，CTCF蛋白在原鈣粘蛋白基因簇的結合情況。B：ChIP-nexus數(shù)據(jù)分析比較WT、K30和K56單細胞克隆株中，cohesin蛋白復合體亞基RAD21蛋白在原鈣粘蛋白基因簇的結合情況。對每個克隆分別進行了兩次獨立的重復實驗(rep)。

圖4 RFX5敲除增加原鈣粘蛋白α基因簇增強子與啟動子的遠距離空間互作

A：RFX5敲除導致增強子與啟動子間相互作用增加。在染色質構象捕獲QHR-4C實驗中，以HS5-1為觀測點(viewpoint, VP)，顯示K30和K56單細胞克隆株中增強子HS5-1與原鈣粘蛋白基因簇啟動子之間的染色質相互作用。K30和K56分別與WT相減(K30-WT, K56-WT)發(fā)現(xiàn)RFX5敲除后HS5-1與啟動子之間的染色質相互作用高于WT克隆。B：RFX5敲除導致啟動子與增強子間相互作用增加。以為觀測點的染色質構象捕獲實驗，顯示K30和K56單細胞克隆株中啟動子與增強子HS5-1之間的染色質相互作用。K30和K56分別與WT相減(K30-WT, K56-WT)發(fā)現(xiàn)RFX5敲除后啟動子與HS5-1之間的染色質相互作用高于WT克隆。

本研究使用CRISPR/Cas9技術，通過導入兩個sgRNA，將Cas9蛋白定位在目的片段處進行切割，造成DNA雙鏈斷裂，經(jīng)細胞修復機制得到基因敲除的單細胞克隆株K30和K56。K30的兩條染色體有一個堿基不同，而K56兩條染色體基因型相同。本研究對這兩個單細胞克隆株的RNA-seq、ChIP-nexus、以及染色質構象捕獲實驗發(fā)現(xiàn)，RFX5敲除后，、、轉錄升高。推測這些轉錄水平變化是由于RFX5敲除后，蛋白CTCF和cohesin在原鈣粘蛋白基因簇的結合升高，使得增強子與啟動子之間的染色質相互作用增加而導致的(圖5)。該現(xiàn)象表明RFX5蛋白通過抑制CTCF和cohesin與DNA的結合調控染色質高級結構，從而參與原鈣粘蛋白基因簇的轉錄調控(圖5)。然而進一步分析RFX5敲除后基因組范圍的轉錄變化時，發(fā)現(xiàn)轉錄水平降低的基因數(shù)量多于轉錄水平升高的基因，說明RFX5蛋白在不同的基因位點可能扮演的角色不同。

圖5 RFX5蛋白調控原鈣粘蛋白α基因簇表達的模式圖

A：野生型細胞(WT)中原鈣粘蛋白基因簇基因調控示意圖。在野生型細胞中，RFX5、CTCF蛋白和cohesin復合體結合在原鈣粘蛋白基因簇啟動子和增強子上，通過CTCF/cohesin介導的染色質環(huán)，增強子調控啟動子的活性。B：RFX5敲除細胞(KO)中原鈣粘蛋白基因簇基因調控示意圖。敲除基因后，CTCF蛋白和cohesin復合體在啟動子、增強子的結合增加，使得增強子與啟動子之間的染色質環(huán)增多，啟動子的活性增加。

通過ChIP-nexus和染色質構象捕獲QHR-4C實驗，發(fā)現(xiàn)敲除基因后，原鈣粘蛋白基因簇中啟動子以及增強子HS5-1處的CTCF和cohesin的結合水平升高。在RFX5敲除的單細胞克隆株中，和啟動子處的CTCF/cohesin結合增加，以及這兩個啟動子與增強子HS5-1之間的染色質相互作用增加，這些均能解釋和這兩個基因轉錄水平升高的現(xiàn)象。但是，RFX5的敲除如何上調的轉錄水平仍是未解決的問題。是原鈣粘蛋白基因簇的特殊一員，它的啟動子上沒有CTCF蛋白的結合，并且它的轉錄不受增強子HS5-1的調控，而是由另外一個增強子HS7調控[12,57,58]。本研究在的啟動子上沒有發(fā)現(xiàn)RFX5的結合，但在增強子HS7上發(fā)現(xiàn)有RFX5的強結合，說明RFX5可能通過結合增強子HS7調控的轉錄。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RFX5蛋白參與調控原鈣粘蛋白基因簇的轉錄，敲除RFX5導致該基因簇的轉錄水平升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)RFX5抑制染色質環(huán)的形成，在三維基因組空間構象中發(fā)揮作用。本研究工作將為后續(xù)對RFX5蛋白更深層次的研究提供參考。

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RFX5 regulates gene expression of thecluster

Na Wang, Zhilian Jia, Qiang Wu

Gene expression and three-dimensional (3D) genome organization are thought to be closely related. The protocadherin () clusters are central for neuronal self-avoidance in brain development and have been used as model genes to explore the role of 3D genome structures in gene regulation. Transcription factor RFX5 (regulatory factor x 5) is a member of the winged-helix subfamily of the helix-turn-helix superfamily proteins. The RFX5 protein contains four domains: oligomerization, DNA-binding, helical, and transactivation domains. RFX5 plays an important role in regulating expression of the major histocompatibility complex class II (MHC II) gene complex. Here we report a role of RFX5 in the regulation of clusteredgenes. We first knocked out thegene by using CRISPR/Cas9 DNA-fragment editing in HEC-1-B cell line. By RNA-seq experiments, we found that RFX5 deletion results in a significant increase of expression levels of the,andgenes. By ChIP-nexus experiments, we found that RFX5 deletion leads to the increased binding of CTCF and RAD21 in thecluster. Finally, through quantitative high-resolution chromosome conformation capture copy (QHR-4C) experiments, we found that RFX5 deletion results in a significant increase of long-distance chromatin interactions between the HS5-1 enhancer and its target promoters in thecluster. In conclusion, RFX5 regulates gene expression of thecluster through higher-order chromatin structure.

RFX5;; CTCF; cohesin; CRISPR/Cas9

2020-06-19;

2020-07-08

國家自然科學基金項目(編號：91640118, 31630039)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 91640118, 31630039)]

王娜，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物學。E-mail: 1191593019@qq.com

吳強，博士，教授，研究方向：三維基因組架構與功能。E-mail: qwu123@gmail.com

10.16288/j.yczz.20-184

2020/8/6 9:31:05

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200804.1501.001.html

(責任編委: 方向東)